GB29688-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)牛奶中氯霉素殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.pdf

ICS G 中 華 人 民 共 和 國(guó)中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó)國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)家 標(biāo) 準(zhǔn) GB 296882013 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 牛奶中氯霉素殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 Determination of Chloramphenicol residues in milk by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometric method （電子版本僅供參考，以標(biāo)準(zhǔn)正式出版物為準(zhǔn)） 2013-09-16 發(fā)布 2014-01-01 實(shí)施 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì) 發(fā)布 I 目目 次次 目 次 . I 前 言 . II 牛奶中氯霉素殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 . 1 范圍 . 2 規(guī)范性引用文件 . 3 原理 . 4 試劑和材料 . 5 儀器和設(shè)備 . 6 樣品的制備與保存 . 6.1 樣品的制備 . 6.2 樣品的保存 . 7 測(cè)定步驟 . 7.1 提取 . 7.2 凈化 . 7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 . 7.4 測(cè)定 . 7.5 空白試驗(yàn) . 8 結(jié)果計(jì)算和表述 . 9 檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 . 9.1 靈敏度 . 9.2 準(zhǔn)確度 . 9.3 精密度 . 附錄 A . II 前前 言言 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄 A 為資料性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)系國(guó)內(nèi)首次發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。 牛奶中氯霉素殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 1 范圍范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛奶中氯霉素殘留量檢測(cè)的制樣和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛奶中氯霉素殘留量的檢測(cè)。 2 規(guī)范性引用文件規(guī)范性引用文件 下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 GB/T 1.1-2000 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則 GB/T 6682-1992 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法 3 原理原理 試料中殘留的氯霉素，用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，C18柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。 4 試劑和材料試劑和材料 以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純?cè)噭凰疄榉螱B/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。 4.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：含量97%。 4.2 內(nèi)標(biāo)物：氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：含量為 100g/mL（作為內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)貯備液）。 4.3 甲醇：色譜純。 4.4 乙腈：色譜純。 4.5 乙酸乙酯 4.6 氯化鈉 4.7 正己烷 4.8 C18固相萃取柱：500 mg/3 mL，或相當(dāng)者。 4.9 4%氯化鈉溶液 ：取氯化鈉 4g，用水溶解并稀釋至 100 mL。 4.10 100 g/mL 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱(chēng)取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品 10 mg，于 100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 100 g/mL 的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液。 -20以下保存，有效期 1 年。 4.11 100 g/L 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 精密量取 100 g/mL 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 100 L，于 100 mL量瓶中，用 50%乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 100 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。28保存，有效期1 個(gè)月。 4.12 20 g/L 氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 精密量取氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品 20 L，于 1000 mL 量瓶中，用50%乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 20 g/L 的氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。28保存，有效期 3個(gè)月。 5 儀器和設(shè)備 5.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。 5.2 分析天平：感量 0.000 01 g。 5.3 天平：感量 0.01 g。 5.4 漩渦振蕩器 5.5 振蕩器 5.6 組織勻漿機(jī) 5.7 冷凍離心機(jī) 5.8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 5.9 離心管：50 mL。 5.10 雞心瓶：50 mL 5.11 固相萃取裝置 5.12 氮吹儀 5.13 濾膜：0.22 m。 6 試料試料的制備與保存的制備與保存 6.1 試料的制備 取適量新鮮或冷藏的空白或供試牛奶，混合，并使均質(zhì)。 取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。 取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。 取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。 6.2 試料的保存 -20以下保存。 7 測(cè)定步驟測(cè)定步驟 7.1 提取 取試料（10 0.05）g，于50 mL離心管中，加氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)工作液250 L，再加乙酸乙酯20 mL，振蕩15 min，6 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層液于雞心瓶中。再加乙酸乙酯20 mL重復(fù)提取一次，合并兩次提取液于雞心瓶中，于45水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用4%氯化鈉溶液5 mL溶解殘留物，加正己烷5 mL振蕩混合1 min，靜置分層，棄正己烷液。再加正己烷5 mL，重復(fù)提取一次。取下層液備用。 7.2 凈化 C18柱依次用甲醇 5 mL 和水 5 mL 活化，取備用液過(guò)柱，控制流速 1 滴/34s，用水 5 mL 淋洗，抽干，用甲醇 5 mL 洗脫，收集洗脫液，于 50氮?dú)獯蹈?。?50%乙腈 1.0 mL 溶解殘余物，渦旋混勻，濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。 7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密量取100 g/L氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和20 g/L氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)工作溶液適量，用流動(dòng)相稀釋?zhuān)渲瞥陕让顾貪舛葹?.10、0.25、0.50、1.0、2.0、5.0 g/L，氘代氯霉素濃度為5g/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。 7.4 測(cè)定 7.4.1 液相色譜條件 色譜柱： C18（150 mm 2.1 mm，粒徑 5 m） ，或相當(dāng)者； 柱溫：30； 流速：0.2 mL/min； 進(jìn)樣量：20 L； 運(yùn)行時(shí)間：8 min； 流動(dòng)相：乙腈+水（50+50，v/v）； 7.4.2 質(zhì)譜條件 電離模式： ESI； 掃描方式：負(fù)離子掃描； 檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)； 電離電壓：2.8 kV； 源溫：120； 霧化溫度：350； 錐孔氣流速：50 L/h； 霧化氣流速：450 L/h； 數(shù)據(jù)采集窗口：8 min； 駐留時(shí)間：0.3s； 定性、定量離子及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見(jiàn)表 1 表1 氯霉素定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞電壓 藥物 定性離子對(duì) m/z 定量離子對(duì) m/z 錐孔電壓 V 碰撞電壓 V 氯霉素（CAP） 321/151.6 321/151.6 30 15 321/256.8 13 氘代氯霉素（D5-CAP） 325.8/156.6 325.8/156.6 30 15 7.4.3 測(cè)定法 取試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算。對(duì)照溶液及試樣溶液中氯霉素和氘代氯霉素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線(xiàn)性范圍之內(nèi)。試樣溶液中的離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度比符合表2的要求。 標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白組織添加試樣溶液的總離子流和選擇離子流圖見(jiàn)附錄A。 表2 試樣溶液中離子相對(duì)豐度的允許偏差范圍 相對(duì)豐度（%） 允許偏差（%） 50 20 2050 25 1020 30 10 50 7.5 空白試驗(yàn) 除不加試料外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。 8 結(jié)果計(jì)算和表述結(jié)果計(jì)算和表述 計(jì)算A321/151.6/A325.8/156.6峰面積比值，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)校準(zhǔn)。 由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程： As/Ais=acs/cis + b 求得a和b，則 cis A c= （ - b） a Ais 試料中氯霉素殘留量（g/kg）：按下式計(jì)算： mVCX 式中: X供試供試試料中氯霉素的殘留量，g/kg； As 對(duì)照溶液中氯霉素的峰面積； AiS 對(duì)照溶液中內(nèi)標(biāo)氘代氯霉素的峰面積； cs 對(duì)照溶液中內(nèi)標(biāo)氘代氯霉素的濃度，ng/mL； cis 對(duì)照溶液中氯霉素的濃度，ng/mL； c 供試溶液中氯霉素的濃度，ng/mL； cis 試樣中氘代氯霉素的濃度，ng/mL； A 試樣中氯霉素的峰面積； AiS 試樣中內(nèi)標(biāo)氘代氯霉素的峰面積； V 溶解殘余物的體積，mL； m 供試試料質(zhì)量，g。 注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。 9 檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 9.1 靈敏度 本方法檢測(cè)限為0.01 g/kg，定量限為0.1 g/kg。 9.2 準(zhǔn)確度 本方法在0.020.10 g/kg添加濃度水平上的回收率為50%120%。 9.3 精密度 本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差17%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差20%。 附錄 A （資料性附錄） Time0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%50.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%120.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%270.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%2405STD-2MRM of 3 Channels ES- 325.8 156.66.41e33.38405STD-2MRM of 3 Channels ES- 321 256.84353.402.872.170.210.741.380.981.945.244.344.085.044.646.455.785.486.137.836.647.506.92405STD-2MRM of 3 Channels ES- 321 151.69533.402.031.615.046.467.85405STD-2MRM of 3 Channels ES- TIC7.76e33.38 圖 A1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子和特征離子質(zhì)量色譜圖（0.25 g/L） 圖A2 牛奶空白試樣特征離子質(zhì)量色譜圖 Time0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%50.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%120.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%200.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00%2M6-4MRM of 3 Channels ES- 325.8 156.65.48e33.36M6-4MRM of 3 Channels ES- 321 256.85213.401.961.8