高效液相色譜分析哈爾濱商業(yè)大學(xué)電子.ppt

第八章 高效液相色譜分析,第一節(jié) 特點(diǎn)與分類,一、特點(diǎn)： 高壓、高效、高速、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。,第二節(jié) 高效液相色譜法的主要類型及基本原理,一、液-固吸附色譜（liquid-solid adsorption chromatography） 固 定 相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5 10m的硅膠吸附劑。 流 動(dòng) 相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有 官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。 缺 點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。,二、液-液分配色譜（liquid- liquid partition chromatography）,固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配； 流 動(dòng) 相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極 性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流 動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。 正相與反相的出峰順序相反； 固 定 相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠 （擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。,三、離子交換色譜（ion-exchange chromatography）,固 定 相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂； 流 動(dòng) 相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離 子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換 劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。 親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)； 陽(yáng)離子交換：RSO3H+M+=RSO3M+H+ 陰離子交換：RNR4OH+X-=RNR4X+OH- 應(yīng) 用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。,四、離子色譜（ion chromatography）,離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)的一中技術(shù)， 其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換 容量的離子交換樹(shù)脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和 電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。 有關(guān)內(nèi)容將在第十章第六節(jié)中講授。,五、離子對(duì)色譜（ion pair chromatography）,原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子 或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水 性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配； 陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十 六烷基三甲銨作為對(duì)離子； 陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子； 反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離 子X(jué)-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+X - 后；在兩相間分配。,六、排阻色譜色譜 （size- exclusion chromatography）,固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)； 原 理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散 到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰 最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝 膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被 排斥在外，出峰最快；溶劑分子 小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì) 量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。,七、親和色譜（Affinity chromatograph）,原理：利用生物大分子和固定 相表面存在的某種特異性親和 力，進(jìn)行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種 具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔 臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配 基(酶、抗原等)，這種固載化的 配基將只能和具有親和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改變淋洗液后洗脫。,第三節(jié) 固定相與流動(dòng)相,一、液相色譜固定相（stationary phases of LC）,1. 液-液分配及離子對(duì)分離固定相 （1）全多孔型擔(dān)體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用 100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多 見(jiàn)；現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；,（2）表面多孔型擔(dān)體 （薄殼型微珠擔(dān)體）3040m的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；,（3）化學(xué)鍵合固定相,化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN,化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn),1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快； 2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊； 3）耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； 4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性； 5）有利于梯度洗脫；,存在著雙重分離機(jī)制： (鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理) 高覆蓋率：分配為主； 低覆蓋率：吸附為主；,2、液-固吸附分離固定相,種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型； 粒度：510 m。,3.離子交換色譜分離固定相,結(jié)構(gòu)類別： （1）薄殼型離子交換樹(shù)脂 薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面 涂約1%的離子交換樹(shù)脂； （2）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵 合型（鍵合離子交換基團(tuán)） 樹(shù)脂類別： （1） 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)酸 性、弱酸性） （2） 陰離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)堿 性、弱堿性）,4. 空間排阻分離固定相,（1）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。 （2）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠； 非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑 （3）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小， 可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。,二、液相色譜的流動(dòng)相（mobile phases of LC）,1.、流動(dòng)相特性 （1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng) 相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極 性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正 相柱。 （3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液 液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上 的出峰順序相反。,2.、流動(dòng)相類別,按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng) 相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。,3、 流動(dòng)相選擇,在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若 組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保 留時(shí)間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小),4.、選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題,（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累 積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。 （2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱 子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。 （3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并 在柱中沉積。 （4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè) 器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。,第四節(jié) 影響色譜峰擴(kuò)展及色譜峰分離的因素,一、影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之 一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)， 即： H=A+Cu 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。,1）液體的黏度比氣體大一百倍， 密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì) 阻力是提高柱效主要途徑。 2）由速率方程，降低固定相粒度 可提高柱效。 3）液相色譜中，不可能通過(guò)增加 柱溫來(lái)改善傳質(zhì)，恒溫。 4）改變淋洗液組成、極性是改善 分離的最直接的因素。,二、 流速,流速大于0.5 cm/s時(shí),Hu曲線 是一段斜率不大的直線。降低流 速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際 操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度 和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。,三、 固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。,第五節(jié) 高效液相色譜儀,高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見(jiàn)圖，一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過(guò)程如下：首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由此得到液相色譜圖。,一、高壓輸液系統(tǒng) 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過(guò)濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對(duì)于一個(gè)好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。,二、進(jìn)樣系統(tǒng),高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。,三、 分離系統(tǒng)色譜柱,色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 以上。一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過(guò)分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。 柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料（20m）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。,四、檢測(cè)系統(tǒng),在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測(cè)器。一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等?，F(xiàn)將常用的檢測(cè)器介紹如下:,1、紫外檢測(cè)器 2、熒光檢測(cè)器 3、示差折光率檢測(cè)器 幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器。靈敏度可達(dá)10-7gcm-3。主要缺點(diǎn)是對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 4、電導(dǎo)檢測(cè)器 5、 附屬系統(tǒng) 它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置 .,第七節(jié) 高效液相色譜分離類型選擇,第八節(jié) 毛細(xì)管電泳簡(jiǎn)介,在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。,1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白； 發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次的自由溶液電泳；第一臺(tái)電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；,二、經(jīng)典電泳分析,利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無(wú)法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬(wàn)/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、