園藝教育畢業(yè)論文（設計）-常春藤鹽脅迫下對外源鈣的響應 (2).doc

本科生畢業(yè)論文（設計）題 目: 常春藤鹽脅迫下對外源鈣的響應 姓 名: 學 院: 生命科學學院 專 業(yè): 園藝教育 班 級: 08級（2）班 學 號: 指導教師: 職稱: 講 師 2011年 12 月 5 日安徽科技學院教務處制目 錄目錄1摘 要1關鍵詞1引言11材料與方法11.1供試材料11.2試驗主要儀器21.3 試驗主要藥品21.4試驗設計與方法21.4.1 試驗準備21.4.2試驗設計21.4.3 試驗方法31.5 測定方法31.5.1 sod含量的測定31.5.2 pod含量的測定31.5.3 可溶性蛋白含量的測定31.5.4 丙二醛含量的測定31.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析42結(jié)果與分析42.1不同處理對sod含量的影響42.2不同處理對pod含量的影響42.3不同處理對可溶性蛋白含量的影響52.4不同處理對丙二醛含量的影響63 討論和結(jié)論6致謝7參考文獻7英文題名、摘要、關鍵詞.7常春藤鹽脅迫下對外源鈣的響應園藝教育: 指導教師： 摘 要：通過試驗，研究不同濃度的鈣對常春藤在不同濃度的鹽狀況下生長及生理特性的影響。通過處理，測量丙二醛含量、過氧化物酶含量、超氧化物歧化酶含量和可溶性蛋白含量，結(jié)果表明，當nacl的濃度為120mmol/l常春藤全部致死，而外源鈣沒有起到緩解效果，但是隨著nacl濃度在一定范圍內(nèi)增大，植物的丙二醛含量總體上升，過氧化物酶含量、超氧化物歧化酶含量和可溶性蛋白含量都呈現(xiàn)不同程度的減弱。而用不同濃度的ca（no3）2能夠緩解鹽對常春藤的生長的影響，ca（no3）2在一定范圍內(nèi)，濃度越大，對nacl脅迫的緩解效果越好。關鍵詞：常春藤；鹽脅迫；鈣；緩解遂著城市化進程的加快和人們生活水平的提高，人們越來越重視我們賴以生存的環(huán)境。一方面是人們居住環(huán)境遭到了破壞，城市里變得擁擠，生活上變得壓抑，使我們大家處于一種亞健康狀態(tài)。另一方面，道路中經(jīng)常彌漫著汽車尾氣、施工灰塵、建筑噪音等等，都影響到我們正常生活。這些環(huán)境的破壞，需要我們?nèi)ジ纳?，其中植物對陶冶人的情操，改善人們生活質(zhì)量發(fā)揮著巨大作用。常春藤作為一種常綠、攀援的藤本植物，它既能做為家庭綠化美化植物，改善家庭的空氣質(zhì)量，又能做為園林道路植物，吸收灰塵尾氣美化城市道路，現(xiàn)在它的應用逐漸廣泛，據(jù)此對常春藤的研究尤為重要。 常春藤原產(chǎn)于我國，分布于秦嶺以南各省區(qū)，不僅是垂直綠化的主要樹種之一，也是極好的木本地被植物，亦可盆栽。常春藤蔓枝密葉，是一種十分美麗的觀葉常綠藤本花卉，是我國園林中垂直綠化的主要樹種之一，又是極好的木本地被植物。常春藤為五加科常春藤屬常綠攀援木質(zhì)藤本, 具氣生根, 匍生或附生。小枝無毛或有毛; 單葉, 革質(zhì),全緣3-5 裂, 具葉柄, 對生或互生花小, 傘形花序單生或數(shù)個組成短圓錐花序, 花有白色、淡白綠色、紫色等; 果球形, 成熟時為紅色或黑色; 種子卵圓形。常春藤性極耐陰，也能生長在全光照環(huán)境中。能耐短暫-7的低溫。對土壤和水分要求不嚴，但喜溫暖、濕潤、疏松、肥沃的土壤。園林用途中常盆栽或吊盆布置于室內(nèi)或窗前、陽臺，是一種良好的垂直觀葉植物和地被植物。目前常春藤的耐鹽性研究不多，對鹽脅迫的應激機制和耐鹽性的研究成為近年來植物研究中的一個熱點1 ， 對常春藤的耐鹽性研究在生產(chǎn)、應用、推廣中具有很大的實用價值。植物在受到不同濃度的鹽脅迫時都會表現(xiàn)出不同程度的傷害，據(jù)此選擇不同程度的nacl對常春藤進行鹽處理，尋求常春藤的鹽脅迫忍耐程度。鈣是植物必需的一種礦質(zhì)營養(yǎng)元素，它對維持細胞壁、細胞膜以及膜結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)無機離子運輸，且作為細胞內(nèi)生理生化反應的第二信使偶聯(lián)外信號，調(diào)控多種酶活性等都具有重要的作用2。在植物適應環(huán)境的變化中鈣起重要作用，當植物受到鹽漬、低溫、高溫、厭氧、氧化脅迫等時,細胞質(zhì)內(nèi)游離鈣濃度明顯上升，啟動基因表達引起一系列的生理變化,進而提高植物對逆境的適應性3 。因此可以從不同濃度的鈣去研究植物，從而也能反映植物的抗逆性。1 材料與方法1.1 供試材料挑選生長好、沒有發(fā)生病蟲害的常春藤進行剪枝扦插培養(yǎng)，養(yǎng)活的苗做為實驗材料。試驗于2011年4月18號在安徽科技學院花卉基地進行。1.2 試驗主要儀器儀器名稱型號生產(chǎn)廠家冰箱干濕溫度計低速離心機數(shù)顯恒溫水浴鍋分光光度計電子天平電子分析天平生化培養(yǎng)箱 bcd-208k888-btgl-16ghh-6722-syp1200fa10004blrh-150青島海爾股份有限公司安徽省蕪湖市溫度計廠北京雷勃爾離心機公司國華電器有限公司上海棱光技術有限公司上海精科天平上海精密儀器有限公司上海一恒科技有限公司1.3 試驗主要藥品藥品名稱標準生產(chǎn)廠家磷酸愈創(chuàng)木酚雙氧水甲硫氨酸氮藍四唑核黃素考馬斯亮蘭g-250三氯乙酸乙醇硫代巴比酸氯化鈉丙酮磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉edta-na2氫氧化鈉arararararararar80%brararar1.4 試驗設計1.4.1 試驗準備 試驗于2011年4月12號開始在安徽科技學院花卉基地進行。采用盆栽扦插苗，首先在日光溫室的沙床內(nèi)扦插；5月10日上盆移栽，每盆裝800g潔凈的河沙，盆里墊細網(wǎng)防止沙子從盆下漏掉。生長期間進行常規(guī)管理，施用適量的水肥，苗生長健壯之后待用。1.4.2試驗設計 5個nacl濃度水平:0mmol/l，30mmol/l，60mmol/l，90mmol/l,120mmol/l, 4個ca(no3)2濃度水平:0 mmol/l,10mmol/l,20mmol/l,40mmol/l。總共20項處理，隨機排列，做三次重復，盆栽，共60盆。1.4.3試驗方法 2011年9月3號第一次進行處理，早上進行葉面噴施不同濃度的ca(no3)2溶液直到葉面滴水為止，下午用不同濃度的nacl鹽溶液（溶劑是營養(yǎng)液）150ml進行澆灌，以后每次每盆定量施150ml鹽溶液，3天后進行第二次處理，再隔3天第三次鹽處理，處理后每兩天取一次樣，總?cè)∥宕巍?.5 測定方法41.5.1 測定sod（超氧化物歧化酶）的含量 采用氮藍四唑法（nbt）法，稱0.5g鮮樣于預冷的研缽中，加1ml磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，研磨后再加緩沖液使終體積為5ml。取1.52ml于4000r/min下離心10min,上清液即為sod粗提取。取型號相同的試管，試管中加50l上清液(2支對照試管中各加磷酸緩沖液50l)，分別加3ml反應液，其中1支對照試管置于暗處，其余各管于4000lx日光下反應2030 min（要求各管受光情況一致，溫度高，時間縮短，低時延長）。反應結(jié)束后，以不照光的對照管作空白，分別測定其它各管的吸光度值。計算公式：sod總活性（u/g）(（ack-ae）v)/(0.5ackwvt)sod比活力(unitsmg-1pr)= sod總活性/蛋白質(zhì)含量1.5.2 測定pod(過氧化物酶)的含量 采用愈創(chuàng)木酚法，取0.5g鮮樣，切碎，放入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3000rmp離心10min，上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中。沉淀用5ml的磷酸緩沖液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆?。用加熱煮?min的酶液為對照，反應體系加入酶液后，立即于37。c水浴中保溫15min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入20%的三氯乙酸2.0ml終止反應，然后過濾（或5000r/min離心10min），適當稀釋，470nm波長下測定吸光度。計算公式：pod總活性u/(g/min)（a470vt）/(wvst0.01) pod比活力（od470min-1g-1pr）總活性/蛋白質(zhì)濃度1.5.3 測定可溶性蛋白的含量 采用考馬斯亮蘭g-250染色法，稱取不同鹽濃度處理的常春藤葉片各0.5g放入研缽中，加2ml的蒸餾水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6ml的蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，在室溫下放置0.51h以充分提取，然后在4000r/min離心20min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入10ml的容量瓶，并以蒸餾水定容至刻度。另取2支具塞試管，分別吸取樣品蛋白質(zhì)提取液0.1ml，放入具塞刻度試管中，各加入5ml考馬斯亮藍g-250蛋白試劑，充分混合，放置2min后以空白為對照，用1cm光徑比色杯在595nm的波長下比色。 計算公式：樣品中蛋白質(zhì)含量（mg/g鮮質(zhì)量）=(xvtn)/(wvs1000)1.5.4 測定 mda（丙二醛）的含量： 稱取不同鹽濃度處理的常春藤葉片各0.25g，重復三次，加入5%tca5ml研磨后，剩下的勻漿在3000r/min離心10min。取上清液2ml，加0.67%tba2ml混合后在100。c水浴鍋中煮沸30min，冷卻后再離心一次，最后分別取上清液在450nm、532nm和600nm下測吸光度。計算公式：c（mol /l）=6.45（a532-a600）-0.56a4501.6 數(shù)據(jù)處理與分析 本論文文字和圖表處理在word2003和excel2003下進行，試驗數(shù)據(jù)用excel制圖.2 結(jié)果與分析 21 不同處理對sod（超氧化物歧化酶）含量的影響圖1 不同處理下超氧化物歧化酶含量變化情況 nacl濃度水平：a1：0mmol/l, a2:30mmol/l,a3:60mmol/l，a4：90mmol/l ca(no3)2濃度水平：b1：0mmol/l, b2:10mmol/l, b3:20mmol/l，b4：40mmol/l由圖1（a1）可知，當植物沒有受到脅迫時，隨著ca(no3)2濃度的增加，sod含量先上升然后下降，這說明低濃度的ca(no3)2能促進生長而高濃度卻抑制生長。由a2、a3和a4可知，當沒有加入ca(no3)時，隨著濃度的變大，逐漸呈下降趨勢，但是隨著ca(no3)2的加入，sod含量逐漸上升尤其當nacl的濃度在60mmol/l，鈣的緩解效果更佳明顯，當nacl的濃度為90mmol/l時，常春藤受到的鹽脅迫嚴重，隨著ca(no3)2的加入，不能起到緩解作用，但是隨著天數(shù)的增加，常春藤對鹽脅迫的程度逐漸有自身的調(diào)節(jié)作用。22 不同處理對pod（過氧化物酶）含量的影響過氧化物酶( pod)是一類由多基因編碼含血紅素的糖蛋白。它在清除 h2o2、 生長素謝、 木質(zhì)素和木栓質(zhì)形成、 抗病性、 抗鹽性、 細胞死亡和細胞伸長等一系列生理過程中均具有重要的作用5。圖2 不同處理下過氧化物酶含量變化情況nacl濃度水平：a1：0mmol/l, a2:30mmol/l,a3:60mmol/l，a4：90mmol/l ca(no3)2濃度水平：b1：0mmol/l, b2:10mmol/l, b3:20mmol/l，b4：40mmol/l由圖2（a1）可以看出，當植物沒有受到鹽脅迫時，隨著ca(no3)2濃度的增大，pod的含量總體呈上升趨勢，但是隨著天數(shù)的增大，pod的含量總體呈下降趨勢，由圖a2、a3和圖a4可知，當沒有加ca(no3)2時，隨著nacl濃度增大增大，pod含量先上升然后下降，說明植物受到影響，但當加入不同濃度ca(no3)2時，植物體內(nèi)pod的含量總體呈上升趨勢，特別是ca(no3)2濃度為60mmol/l時，緩解效果特別明顯。當nacl濃度為90mmol/l時，植物鹽脅迫比較嚴重，加入ca(no3)2時不能起到緩解作用，然而隨著天數(shù)的增加，pod的含量總體呈上升，說明鹽脅迫隨著天數(shù)的增加，逐漸得到緩解。2.3 不同處理對可溶性蛋白含量的影響圖3不同處理下可溶性蛋白含量變化情況 nacl濃度水平：a1：0mmol/l, a2:30mmol/l,a3:60mmol/l，a4：90mmol/l ca(no3)2濃度水平：b1：0mmol/l, b2:10mmol/l, b3:20mmol/l，b4：40mmol/l由圖3（a1）可知，常春藤在沒有受到鹽脅迫時，隨著加入ca(no3)2濃度的變大，其可溶性蛋白含量先上升然后下降，說明低濃度的ca(no3)2對植物的生長有利而高濃度卻抑制其生長。由圖a2、a3和a4可知，沒有ca(no3)2的加入，隨著nacl的濃度的增大，可溶性蛋白含量逐漸下降，隨著ca(no3)2的加入，可溶性蛋白含量逐漸上升，特別當nacl的濃度為60mmol/l時，加入ca(no3)2對常春藤有緩解作用，當ca(no3)2的濃度為20mmol/l對植物的緩解效果更加明顯。由圖a2和a3可知，可溶性蛋白含量先上升然后下降，這說明當加入ca(no3)2，隨著天數(shù)的增加，鈣對鹽脅迫的緩解作用逐漸減弱，到第四天時，鈣對常春藤鹽脅迫的緩解作用最佳效果。2.4 不同處理對mda（丙二醛）含量的影響丙二醛(mda) 是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一, 一般認為在植物體內(nèi)積累是活性氧毒害的表現(xiàn), 其含量是判斷膜脂過氧化程度的一個重要指標 6 。通常利用它作為脂質(zhì)過氧化的指標，表示植物對逆境條件的反映強度，通過測定丙二醛含量就能反映出細胞膜系統(tǒng)受害情況和抗逆性情況。由圖4可知，常春藤在鹽脅迫和緩解鹽脅迫的mda含量變化情況。表現(xiàn)為隨著nacl脅迫程度加重，mda含量總體呈現(xiàn)上升趨勢;由a1圖可知，在同一nacl濃度下,隨著ca(no3)2濃度在一定范圍內(nèi)的加大，mda含量總體呈現(xiàn)下降趨勢。由a2、a3圖可知，隨著nacl溶液的升高，加入ca(no3)2溶液，丙二醛含量有所下降，說明ca(no3)2溶液起到緩解作用。而且當nacl濃度為90mmol/l時,從a4圖可知， ca(no3)2無法起到有效的緩解作用。nacl濃度在30mmol/l-60mmol/l時，隨著天數(shù)的增加，到第四天時，適宜濃度的ca(no3)2對鹽脅迫的緩解作用比較明顯。3討論與結(jié)論植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多是參與各種代謝的酶類，測其含量是了解植物總代謝的一個重要指標。該試驗結(jié)果顯示，鹽脅迫同樣使常春藤葉片可溶性蛋白質(zhì)含量下降，添加外源ca(no3)2后，常春藤葉片中可溶蛋白質(zhì)含量明顯增加，在ca(no3)2濃度為20 mmol/l時達到最佳效果。鹽漬環(huán)境下，植物體內(nèi)活性氧代謝的平衡受到影響，活性氧的產(chǎn)生增加，從而引起膜脂過氧化作用，而丙二醛(mda)是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一7。在鹽脅迫下，植物體內(nèi)mda含量隨著脅迫程度的加重明顯增加，施加鈣能抑制鹽脅迫下植物體內(nèi)mda的積累，說明鈣能抑制膜脂過氧化作用，從而減輕膜脂過氧化對細胞的傷害8。該試驗中，在nac1 脅迫下，常春藤葉片中mda 含量明顯增加，而添加了不同濃度的ca(no3)2處理中，常春藤葉片中mda含量均有不同程度的減小。這說明施加外源鈣能抑制常春藤葉片中mda的積累，從而增強常春藤在鹽逆境下的適應性。高鹽環(huán)境將誘導植物體內(nèi)活性氧( ros)的產(chǎn)生,如超氧陰離子(o2-)、過氧化氫( h2o2)和羥自由基(oh-)9,10.而植物細胞內(nèi)存在兩條抗氧化途徑清除ros危害,分別是酶促和非酶促10.其中超氧化物歧化酶( sod )、過氧化物酶(pod)屬于酶促系統(tǒng)的兩個重要組成部分.sod 可以清除活性氧自由基,防止膜質(zhì)過氧化,pod可使體內(nèi)某些氧化酶的毒性產(chǎn)物h2o2分解并阻止其對膜脂的攻擊而發(fā)生過氧化作用10,11。該實驗中，當沒有加入ca(no3)2時，pod和sod含量隨著nacl濃度的增大逐漸變小，但是隨著天數(shù)的增大，pod和sod逐漸增大，說明隨著天數(shù)的增加，使常春藤對鹽脅迫有緩解作用。當加入ca(no3)2時，sod和pod含量逐漸上升，說明鈣對常春藤鹽脅迫有緩解作用，當nacl濃度為60mmol/l時，20mmol/l對常春藤的緩解作用最佳明顯。而高濃度nacl（120mmol/l）使植物致死，ca(no3)2對濃度為90mmol/l的nacl的緩解作用不明顯。致謝本畢業(yè)論文是在安徽科技學院生命科學學院園藝教學組張雪平老師的指導下完成的。張老師在整個論文指導和試驗過程中給我的幫助很多，我由衷的感謝。在這里特此感謝張老師，還要感謝在實驗過程中給予我無私幫助的各位同學。值此特向他們表示誠摯的謝意！參考文獻：1 zhu j k. plant salt tolerance j. trends in plant science, 2001,6(2):6671.2 何龍飛，沈振國，劉友良.鋁脅迫下鈣對小麥液泡膜功能和膜脂組成的影響j.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2000，23(1)：10-13.3 馮文新,張寶紅. 鈣處理對鹽脅迫下大豆種子萌發(fā)及其生理生化指標的影響j . 大豆科學,1997 , 1(1) :48.4 王學奎.植物生理生化實驗原理和技術m.2版.北京：高等教育出版社，2006.5.5 毛桂蓮,鄭國琦,章英才,周孝程。不同鈣鹽對nacl 脅迫下枸杞愈傷組織耐鹽性的影響j. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,25(1)：131-1346giannopolitis c n , ries s k. superoxide dismutase i. occurrence inhigher plants. plant physiol , 1977 , 59 : 309314）7 趙可夫. 植物抗鹽生理m. 北京: 中國科學技術出版社,1993:234-235.8 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