課用蛋白質(zhì)組學的研究方法和進展

第4章 蛋白質(zhì)組學 的研究方法和進展,One Genome different Proteomes,Life is based on proteins and their interactions,前言從基因組學到蛋白質(zhì)組學,20世紀生命科學的輝煌成就 1953年Watson & Crick，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提出 1957年，“中心法則”的問世 20世紀90年代，人類基因組計劃（HGP）,基因組計劃的局限 無法解決“基因精細調(diào)控”問題 “mRNA” 無法反映蛋白質(zhì)的質(zhì)與量。,以往人類對于蛋白質(zhì)的研究只是針對生命活動中某一種或某幾種蛋白質(zhì)，難以形成一種整體觀，難以系統(tǒng)透徹地闡釋生命活動的基本機制。,大規(guī)模、全方位的蛋白質(zhì)研究勢在必行。,第一節(jié) 蛋白質(zhì)組學的概念及其發(fā)展史,蛋白質(zhì)組（proteome）,同一基因組在不同細胞、不同組織中蛋白質(zhì)表達各不相同。 空間和時間上呈動態(tài)變化。,由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)組學(proteomics),從整體角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。,主要研究內(nèi)容,了解特定的細胞、組織或器官表達的 蛋白質(zhì)種類；,明確各種蛋白質(zhì)分子相互作用網(wǎng)絡(luò)；,描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其 結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)合 并且決定其活性的部位。,功能蛋白質(zhì)組學 (functional proteomics),細胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的全部蛋白質(zhì)。,國際研究進展,1996年，澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質(zhì)組研究中心（APAF） 美國NCI 肺、直腸、乳腺和卵巢等腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫 NCI與FDA 有關(guān)癌癥不同發(fā)病階段和治療階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫 英國、法國、德國、日本等國也分別投入巨資進行蛋白質(zhì)組學的研究,The HUPO World,Canada,USA,China,Japan,Korea,Asia Oceania,Sweden,Russia,United Kingdom,Italy,Germany,France,America,Australia,The Human Proteome Organisation,1. Human Liver Proteome Project(HLPP) 2. Human Brain Proteome Project(HBPP) 3. Proteomic Standards Initiative(PSI) 4. Human Antibody Initiative(HAI) 5. Plasma proteome Project(PPP) 6. Mouse Models Human Disease(MMHD) 7. Human Disease Glycomics/Proteome Initiative (HGPI) 8. HUPO Cardiovascular Initiative(HUPO CVI),國內(nèi)進展,國家自然科學基金委于1997年設(shè)立了重大項目“蛋白質(zhì)組學技術(shù)體系的建立” 1998年啟動了蛋白質(zhì)組學研究 中國科學院生物化學研究所、軍事醫(yī)學科學院等單位啟動蛋白質(zhì)組研究 中國科學院上海生命科學研究院、軍事醫(yī)學科學院與復旦大學相繼成立了專門的蛋白質(zhì)組學研究中心,科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國“973”計劃項目和“863”計劃項目；國家自然科學基金委員會也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點項目。 我國在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大進展。,第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學研究方法概述,一、蛋白質(zhì)組表達模式研究方法,研究蛋白質(zhì)組的組成成分 主要技術(shù)有雙向凝膠電泳、以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)及生物信息學技術(shù)。,（一）蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備,采用細胞或組織的全蛋白質(zhì)組分進行蛋白質(zhì)組分析。 進行樣品預分級，將細胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進行研究，提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測靈敏度。,樣品預分級的主要依據(jù),蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白質(zhì)細胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等,組織水平蛋白質(zhì)組樣品制備,原因：臨床樣本都是各種細胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤中癌變的上皮類細胞總是與血管、基質(zhì)細胞等混雜。,激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM),可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特定的細胞或細胞群。,（二）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離,雙向凝膠電泳 (two-dimensional electrophoresis, 2-DE) 利用蛋白質(zhì)等電點和分子量差異，結(jié)合凝膠化學特性，分離各種蛋白質(zhì)的方法。,工作原理： 根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同進行第一向等電聚焦電泳分離 轉(zhuǎn)移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，再根據(jù)相對分子質(zhì)量大小不同進行分離,等電聚焦電泳進行過程中,等電聚焦電泳結(jié)束后,（）,（）,（）,（）,低pH,低pH,高pH,高pH,第一向等電聚焦電泳（isoelectrophoresis focusing, IEF） 聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內(nèi)制造一個pH梯度。每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI 相一致的pH處。,固相pH梯度等電聚焦的優(yōu)點,克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等缺點。 可以精確設(shè)定pH梯度。 尤其可在較窄的pH范圍內(nèi)進行第二輪分析，大大提高了分辨率及重復性。,雙向凝膠垂直電泳 雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異，垂直方向反映分子量上的差別。,第二向SDS-PAGE電泳,固相pH梯度等電聚焦電泳（第一向）示意圖,SDS- PAGE,SDS-PAGE電泳（第二向）示意圖,二維電泳的主要步驟： 1. 樣品準備 2. 第一維：固相pH梯度等電聚焦 3. 第二維：SDS-PAGE電泳 4. 染 色：考馬氏亮蘭或銀染 5. 圖像分析：肉眼或自動掃描,Gel staining,2-DE流程圖,蛋白質(zhì)二維電泳圖譜,低分化星形膠質(zhì)細胞瘤中表達明顯上調(diào)蛋白,cAMP-dependent protein kinase (L4),Glial fibrillary acidic protein, astrocyte (L1),Low-grade,High-grade,Peroxiredoxin 6 (H5),Apoliprotein A-I (H4),40,40,H4,H4,13,13,48,48,H5,H5,Fibrinogen fragment D (H3),-Internexin (H1),H1,H1,68,68,68,68,H2,H2,H3,H3,Actin, cytoplasmic 1 (H2),Low-grade,High-grade,Low-grade,Low-grade,High-grade,High-grade,高分化星形膠質(zhì)細胞瘤中表達明顯上調(diào)蛋白,二維電泳優(yōu)點,可分離10100 kD 范圍內(nèi)蛋白質(zhì) 高靈敏度和高分辨率 便于計算機進行圖像分析處理 與質(zhì)譜分析匹配,二維電泳缺點,極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。 膠內(nèi)酶解過程費時、費力，難于與質(zhì) 譜聯(lián)用實現(xiàn)自動化。,新型非凝膠技術(shù),液相色譜法 分配色譜法 吸附色譜法 離子交換色譜法 排阻色譜法 毛細管電泳,LabAlliance Model 2000二元高壓半制備梯度系統(tǒng),（三）蛋白質(zhì)組研究的樣品鑒定,基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比(m/z)的差異來分離并確定樣品的分子量。,Spot identification,Spot Picking,Digestion,MS Analysis and Database search,Spot cutter,Spots of interest,生物質(zhì)譜技術(shù)(Mass Spectrometry),通過測定樣品離子的質(zhì)荷（m/z）來進行成分和結(jié)構(gòu)分析。,“軟電離”的特點,分子電離時保留整個分子的完整性，不會形成碎片離子。 靈敏度高、快速、能同時提供樣品的精確分子量和結(jié)構(gòu)信息、既可定性又可定量、并能有效地與各種色譜聯(lián)用來分析復雜體系。,基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）,主要質(zhì)譜類型,鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線,通過肽質(zhì)譜指紋圖(peptide mass finger-printing,PMF)和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配 通過測出樣品中部分肽段二級質(zhì)譜信息或氨基酸序列標簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配,Sample MS Spectrum,典型二級質(zhì)譜圖,肽質(zhì)譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫中匹配不成功的可能原因,樣品量太少，PMF圖信噪比太低 2-DE膠上所取的一個蛋白質(zhì)點并非單一蛋白質(zhì) 角蛋白或其他蛋白質(zhì)的污染 蛋白質(zhì)發(fā)生較多的轉(zhuǎn)譯后修飾，數(shù)據(jù)庫中未有記載 所用胰蛋白酶質(zhì)量不夠好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫規(guī)模太小,組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù) 兩級飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF） 傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS） 表面增強激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜 （SELDI-TOF-MS）,聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì),液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）,蛋白質(zhì)混合物通過液相色譜分離以代替2-DE的分離,然后進入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量,再通過串聯(lián)MS技術(shù),得到部分序列信息,最后通過計算機聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定。,根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復合物。,多維色譜技術(shù)（LC/LC-MS/MS）,多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) (multidimensional protein identification technology),（四）蛋白質(zhì)組學研究的生物信息學,生物信息學是蛋白質(zhì)組學研究的一個不可缺少的部分。,構(gòu)建和分析雙向凝膠電泳圖譜 數(shù)據(jù)庫的搜索與構(gòu)建,蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,SWISS-PROT: http:/www.expasy.ch/sprot/ 擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。 NRDB:http:/www.nrdb.co.uk/ dbEST:/ NCBI:/Genomes/ EMBL:/ Prosite：/prosite/ PDB：/pdb/,目前應(yīng)用最普遍數(shù)據(jù)庫,secondary structure local spatial arrangement,b-sheet,a-helix,二、蛋白質(zhì)功能模式的研究方法,結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學（Structural Proteomics）,（一）蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究,糖基化、乙?；⒓谆?、羧基化 二硫鍵配對、焦谷氨酸化 蛋白質(zhì)降解,（二）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),生命的基本過程是不同功能蛋白質(zhì)在時空上有序和協(xié)同作用 新陳代謝以蛋白質(zhì)復合體或多蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用實現(xiàn) 細胞信號轉(zhuǎn)導及病原體感染和免疫反應(yīng),1989年Field 和Song等人在酵母細胞中設(shè)計的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法。 真核細胞轉(zhuǎn)錄激活因子(GAL4)的結(jié)構(gòu)和活性特點為基礎(chǔ)的。 N端含NLS和與酵母GAL1基因啟動子上游激活序列(UASG)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。 C端含GAL1轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,1.酵母雙雜交系統(tǒng) （yeast two-hybrid system）,系統(tǒng)構(gòu)建,分別構(gòu)建含GAL4 BD 和AD 的兩個酵母融合蛋白表達載體； 建立含特殊基因型、適用于雙雜交體分析的酵母菌株。,酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid）,主要特點和優(yōu)勢,使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系 篩選cDNA文庫 真實反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況 不需分離靶蛋白 敏感性高,假陽性 假陰性 限于核內(nèi)表達蛋白質(zhì) 的相互作用,缺點,Biacore基于表面等離子共振（SPR）進行生物大分子相互作用分析(BIA) 質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS）鑒定Biacore芯片上配體所捕獲的生物分子,2.生物傳感器耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),動力學,親和力,結(jié)合的速度 有多快？,一個單抗與另一個單抗相比較哪一