分子生物學(xué)工具酶.ppt

10/24/2019,分子生物學(xué)工具酶,中晶生物,10/24/2019,工具酶是一類用于DNA重組過程中不同DNA分子的制備、切割、修飾、擴(kuò)增, 核酸分子的標(biāo)記以及它們的核苷酸序列測定的酶。,概 述,分類： 限制性內(nèi)切酶 連接酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA、RNA聚合酶 其它酶類,大多數(shù)來自不同的微生物和噬菌體 少數(shù)酶來自動物和動物病毒 另一些工具酶編碼的基因也被克隆出來, 并用大腸桿菌細(xì)胞來生產(chǎn)這些工具酶。,10/24/2019,一、限制性內(nèi)切酶,5-GA A T T C-3 3-C T T A AG-5,EcoRI,市場容量：1.5億美金,10/24/2019,其命名以該酶來源的原核生物的名稱為依據(jù)。 第一個大寫字母：取自于屬名的第一個字母 第二、三個小寫字母：取自于種名的前兩個字母 字母后面羅馬字：該種生物中不同限制酶分離先后順序 限制酶名稱的前三個字母常用斜體或加下橫線表示,限制酶的命名,分離純化：幾千種限制性內(nèi)切酶 商品化：200多種限制性內(nèi)切酶,限制酶的種類,10/24/2019,限制性內(nèi)切酶,10/24/2019,限制性內(nèi)切酶說明書,10/24/2019,Fermentas公司,30多年研發(fā)生產(chǎn)歷史，提供200多種高質(zhì)量的工具酶 通過ISO9002國際質(zhì)量體系認(rèn)證 精湛的實驗室研發(fā)技術(shù)和實力 具有全球第二大的產(chǎn)限制酶的菌株 (2500株)庫 REBASE 中30% 限制酶經(jīng)過Fermentas的鑒定 30%II型限制修飾相關(guān)基因在Fermentas得到克隆 全球率先合成了“人造”酶(Eco57MI, N.Bpu10I) 生產(chǎn)中執(zhí)行最高級別的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)（LO Test） 致力于通過提高生產(chǎn)效率從而提升產(chǎn)品質(zhì)量和價格競爭力 全球限制性內(nèi)切酶(REs)生產(chǎn)的領(lǐng)先企業(yè) 市場份額：20左右，個別國家超過30的市場占有率,10/24/2019,執(zhí)行最嚴(yán)格生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn) PureExtreme,自 1996 年以來，只有Fermentas始終執(zhí)行分子生物學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)中最嚴(yán)格的純度標(biāo)準(zhǔn) “標(biāo)記寡核苷酸測試”（ the Labeled Oligonucleotide test，”LO” test） 獨(dú)有的“標(biāo)記寡核苷酸測試” 確保 Fermentas 產(chǎn)品達(dá)到 PureExtreme級別 在限制酶、 dNTPs、 DNA/RNA 修飾酶等的生產(chǎn)中都進(jìn)行了 “標(biāo)記寡核苷酸測試”,傳統(tǒng)分析方法包括：非特異性核酸酶內(nèi)切分析、核酸外切酶分析、連接重切分析、藍(lán)白斑篩選分析等。 但是要檢測痕量污染的內(nèi)切、外切核酸酶，磷酸酶，必需選擇更高靈敏度的檢測方法：LO Test,10/24/2019,Labeled Oligonucleotide (LO) test,A Invitrogen B Roche C NEB D Stratagene E Promega F Fermentas,10/24/2019,不同供應(yīng)商RE LO檢測分析,-,pure,contaminated,minor contamination,X,*,10/24/2019,通過LO檢測的REs(%),Roche,Invitrogen,NEB,Stratagene,Promega,Fermentas,10/24/2019,PureExtreme 限制性內(nèi)切酶優(yōu)勢,所有Fermentas內(nèi)切酶都達(dá)到 PureExtreme（致純） 最高品質(zhì)保證 產(chǎn)品投訴少 嚴(yán)格的批間一致性 保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性 幾乎所以的酶都采用標(biāo)準(zhǔn)濃度 10 units/l 實時質(zhì)量監(jiān)督,10/24/2019,所有Fermentas RE在優(yōu)化Buffer中有100%活性,Easy-to-use Five Buffer Plus System,每個Fermentas RE含兩種buffer： - 顏色區(qū)分，優(yōu)化buffer： blue (B+) green (G+) orange (O+) red (R+) yellow (Y+/Tango) 和 - Universal Y+/Tango Double Digest buffer,濃度優(yōu)化的BSA預(yù)先加入所有RE緩沖液中,10/24/2019,改進(jìn)的 REsearch engine,10/24/2019,DoubleDigestion，雙酶切,10/24/2019,DoubleDigest 提供DD最佳反應(yīng)條件,10/24/2019,Fermentas RE暢銷排行榜（Top 20）,BamHI BcuI (SpeI) BglII EcoRI Eco47III Eco57I HindIII MboI MnlI NotI,NcoI NdeI NheI PaeI (SphI) SacI SalI TaiI (MaeII) Tru1I (MseI) XbaI XhoI,補(bǔ)充：PstI,10/24/2019,與競爭對手的比較,Fermentas vs NEB,10/24/2019,與競爭對手的比較,Fermentas vs Takara,10/24/2019,與競爭對手的比較,LO 測試 達(dá)到PureExtreme: 無其它活性的污染 內(nèi)切酶種類第二多 ISO9002 認(rèn)證和質(zhì)量控制 列出有效期, 通過實時監(jiān)控保證100活性 Five Buffer Plus System，加有 BSA Y+/Tango，通用雙酶切buffer 專注于內(nèi)切酶方面 價格優(yōu)勢,未經(jīng) LO測試 內(nèi)切酶種類少 有認(rèn)證 11種 buffers及 Multi-Core 4, 不提供BSA 未提供雙酶切的詳細(xì)信息 非主要產(chǎn)品線 大幅度折扣,Fermentas vs Promega,10/24/2019,與競爭對手的比較,LO 測試 達(dá)到PureExtreme: 無其它活性的污染 內(nèi)切酶種類第二多 ISO9002 認(rèn)證和質(zhì)量控制 Five Buffer Plus System，加有 BSA Y+/Tango，通用雙酶切buffer 價格優(yōu)勢,未經(jīng) LO測試 有認(rèn)證 非主要產(chǎn)品線 9種 buffers, 不提供BSA 未提供雙酶切的詳細(xì)信息 大幅度折扣,Fermentas vs Invitrogen,10/24/2019,FastDigest Restriction Enzymes,NEW!,10/24/2019,FastDigest 限制性內(nèi)切酶,FastDigest,5min digestion,1l of enzyme,37oC temperature,ONE buffer,For ALL FastDigest enzymes,超過70多種FastDigest酶 數(shù)量快速增長,10/24/2019,產(chǎn)品特點(diǎn) 獨(dú)特的產(chǎn)品線 酶切質(zhì)粒DNA只需5 min at 37C 特殊的形式：1l enzyme 無需換算酶切單位 通用Buffer，針對所有的酶切實驗 一種溫度：37C反應(yīng) 200ng 純化的質(zhì)粒DNA (5 min酶切) 適合單酶切、雙酶切和三酶切反應(yīng) 操作簡單：無需考慮酶量、Buffer、溫度和星活性,客戶定位,10/24/2019,基因的體外突變等諸方面,限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用,各種DNA分子的體外重組,限制酶譜的繪制,基因的亞克隆分析,基因和染色體結(jié)構(gòu)的分析,10/24/2019,限制性內(nèi)切酶使用常見問題分析（一）,Q1、DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割 內(nèi)切酶失活：標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性 DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子：將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA 條件不適（試劑、溫度）：檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳 DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化：換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細(xì)菌菌株 DNA酶切位點(diǎn)上沒有甲基化（如Dpn I）：換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增 DNA位點(diǎn)上存在其它修飾：將DNA底物與DAN混勻進(jìn)行切割驗證 DNA不存在該酶識別順序 ：換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗證,10/24/2019,限制性內(nèi)切酶使用常見問題分析（二）,Q2、DNA切割不完全 內(nèi)切酶活性下降：用5-10倍量過量消化 內(nèi)切酶稀釋不正確 ：用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶 DNA不純，反應(yīng)條件不佳 ：同上 內(nèi)切酶識別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾 ：同上 部分DNA溶液粘在管壁上 ：反應(yīng)前離心數(shù)秒 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn) ：將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積 酶切后DNA粘末端退火 ：電泳前將樣品置65保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷 由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性 ：使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強(qiáng)烈振蕩 過度稀釋使酶活性降低 ：適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏 反應(yīng)條件不適 ：使用最佳反應(yīng)體系 識別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序 ：加大酶量5-10倍,10/24/2019,限制性內(nèi)切酶使用常見問題分析（三）,Q3、內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活 保存溫度不當(dāng) ：貯藏在含50%甘油的貯藏液中，-20低溫保存 以稀釋形式保存：稀釋酶液不宜長期存放，應(yīng)一次使用 貯藏緩沖液不適當(dāng)：使用廠家推薦的貯藏緩沖液 低蛋白濃度：內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存,Q4、酶切后的DNA片段連接效率低 含磷酸鹽的濃度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶：內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶 平末端連接：加大T4 DNA Ligase用量 外切酶污染：減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA 連接緩沖液不合適 ：重新配制連接緩沖液,10/24/2019,限制性內(nèi)切酶使用常見問題分析（四）,Q6、電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一 DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì)：電泳前上樣液65加熱5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提純化 內(nèi)切酶中含有DNA外切酶：減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶,Q5、DNA片段數(shù)目多于理倫值 內(nèi)切酶星狀活性：檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量 其它內(nèi)切酶污染：用DNA作底物檢查酶切結(jié)果 底物中含其它DNA雜質(zhì)：電泳檢查DNA，純化DNA片段,Q7、酶切后沒有觀察到DNA片段的存在 DNA定量錯誤（如RNA含量較高） ：用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀 ：在反應(yīng)前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次,10/24/2019,DNA/RNA 修飾酶,10/24/2019,T4 DNA Ligase (LO tested) Klenow fragment T4 Polynucleotide Kinase T4 DNA Polymerase RevertAid M-MuLV Reverse transcriptases (LO tested) Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (LO tested) Ribonuclease Inhibitor Ribonucleases Calf Intestine Alkaline Phosphatase Shrimp Alkaline Phosphatase Proteinase K,Fermentas暢銷修飾酶,10/24/2019,T4 DNA Ligase LO tested,單位： Fermentas 國際Weiss unit (ATP-PP exchange) NEB 粘端連接單位 1 Weiss單位 200粘端連接單位 相關(guān)產(chǎn)品： Rapid DNA Ligation Kit Rapid DNA Ligation & Transformation Kit,10/24/2019,Reverse transcriptases,AMV： 從禽類成骨髓細(xì)胞瘤病毒中分離，有RNase H活性，42時比M-MuLV穩(wěn)定，最高逆轉(zhuǎn)錄溫度高達(dá)72度（Finnzymes）。增加逆轉(zhuǎn)錄的特異性，適合具有二級結(jié)構(gòu)的模板RT RevertAid M-MuLV (LO Test)： 從莫洛尼鼠白血病毒中分離，有RNase H活性。42度逆轉(zhuǎn)錄，最長可獲得13kb的cDNA。 M-MuLV (RNase H- ) (LO Test)： 從莫洛尼鼠白血病毒中分離，消除了RNase H活性，適合合成全長的cDNA。 42度逆轉(zhuǎn)錄，最長可獲得13kb的cDNA，產(chǎn)量比含有RNase H活性的酶要高很多。,10/24/2019,Ribonuclease Inhibitors（RNA酶抑制劑）,概述 非共價1:1結(jié)合RNase，抑制RNases - A, B, C活性。 對Bacterial RNases H, T1, 1, S1, U1, U2, CL3無效 LO Test：超純，無其它酶蛋白污染 作用溫度范圍：25-55度，最佳反應(yīng)穩(wěn)定37度 適用PH值范圍5.0-9.0,應(yīng)用： RNA分離與純化 體外轉(zhuǎn)錄，保證RNA轉(zhuǎn)錄本的完整性 cDNA合成： 保護(hù)模板RNA、增加cDNA產(chǎn)率、增加全長cDNA比例 RT-PCR：保護(hù)模板RNA，增加RT-PCR產(chǎn)率,10/24/2019,堿性磷酸酶（AP),應(yīng)用: 除去載體和插入片段