骨髓細(xì)胞化學(xué)染色.ppt

骨髓細(xì)胞化學(xué)染色,細(xì)胞化學(xué)染色是以細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，利用化學(xué)反應(yīng)原理，對(duì)細(xì)胞中的酶類、脂類、糖類及蛋白質(zhì)等化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行定性、定位或半定量分析的方法。 用于血液系統(tǒng)疾病的診斷、鑒別診斷及療效判斷；用于白血病細(xì)胞類型的判斷。,基本步驟,1. 固定:目的是保持細(xì)胞固有結(jié)構(gòu)和化學(xué)成份不變，分蒸汽固定和液體固定。 2. 顯示:通過(guò)化學(xué)反應(yīng)顯示被測(cè)物質(zhì)，有偶氮偶聯(lián)法，聯(lián)苯胺法，金屬沉淀法等。 3. 復(fù)染：作為背景染色，使反應(yīng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)能更清楚顯示出來(lái)。,原理 機(jī)體多余的鐵以鐵蛋白及含鐵血黃素的形式儲(chǔ)存。這些鐵與低鐵氰化鉀在酸性溶液中發(fā)生反應(yīng)而呈藍(lán)色。,鐵染色,試劑,40g/l亞鐵氰化鉀溶液。 4%鹽酸（38%濃鹽酸40ml，小心倒入340ml冷蒸餾水中，混勻） 20g/l伊紅溶液。 甲醛溶液。,方法,取骨髓片2張，加固定液固定10min，水洗待干。 將II緩緩滴入I內(nèi)，混合后染液滴于骨髓涂片上， 37C放置60分鐘，流水沖洗數(shù)分鐘 流水沖洗，一張待干觀察外鐵，一張沖洗后用核固紅復(fù)染1分鐘，沖洗待干，觀察細(xì)胞內(nèi)鐵。,結(jié)果觀察,幼紅細(xì)胞核染成鮮紅色，胞漿呈淡黃色，鐵粒呈藍(lán)綠色。 （1）細(xì)胞外鐵：用低倍鏡觀察骨髓小粒,細(xì)胞外鐵主要存在于巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi),而被染成藍(lán)色，再用油鏡判斷陽(yáng)性程度。分為（-）、（+）、（+）、（+）、（+）。,細(xì)胞外鐵陽(yáng)性（+）,（2）細(xì)胞內(nèi)鐵：油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)有核紅細(xì)胞，記錄陽(yáng)性細(xì)胞（胞漿中有藍(lán)色顆粒即鐵粒幼細(xì)胞）的百分率。同時(shí)注意有無(wú)環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞（6顆以上，并繞核1/2以上者）。,環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞,1.細(xì)胞內(nèi)鐵：計(jì)算100個(gè)中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性率，正常值20-45%；鐵顆粒1-5粒，一般不超過(guò)10粒。 2.細(xì)胞外鐵：觀察骨髓小粒中巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)藍(lán)色顆粒。正常為（+）或（+）。,參考值,臨床意義 鐵染色主要用于缺鐵性貧血與鐵粒幼細(xì)胞性貧血的診斷，也是指導(dǎo)鐵劑治療的一個(gè)靈敏而可靠的指標(biāo)。特別是鐵粒幼細(xì)胞貧血形成特有的環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞，也易與其他類型貧血區(qū)別。,中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶 (NAP)染色(鈣-鈷法）,原理 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的NAP活性存在時(shí)，在pH為9.29.5的堿性條件下，它可將作用液中的基質(zhì)-甘油磷酸鈉水解，釋出磷酸，進(jìn)而與作用液中的鈣離子結(jié)合，成為磷酸鈣沉淀，再經(jīng)過(guò)硝酸鈷和硫化胺的作用，生成不溶性硫化鈷，呈黑色沉淀定位于胞漿。,NAP染色測(cè)定(偶氮偶聯(lián)法）,檢測(cè)原理 血細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶（NAP）在堿性環(huán)境下，水解-磷酸萘酚鈉，產(chǎn)生 -萘酚。后者與重氮試劑偶聯(lián)形成有色沉淀物，沉淀物的顯色深淺 與NAP活性成正比。 試劑盒組成 1. NAP固定液：1瓶5 2. NAPI液(-磷酸萘酚鈉)：1瓶 5 3. NAPII(堅(jiān)牢藍(lán)B+tris-HCl)液:1瓶 5 4.蘇木素復(fù)染液:1瓶 5,方法,1.新鮮涂片滴加固定液(4 C)30秒,水洗待干。 2.將I液置入II液混合成為基質(zhì)液。將涂片置入后，37C放置30分鐘，流水沖洗數(shù)分鐘，取出待干。 3.蘇木素復(fù)染1-2分鐘，水洗，待干，鏡檢。 4.結(jié)果顯示： 陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)暗紅色沉淀物，定位于胞質(zhì)。 陰性細(xì)胞內(nèi)無(wú)紅色沉淀物。,(-),(+),(+),(+),(+),(+)、（+）、（+）,積分計(jì)算,在油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)成熟中性粒細(xì)胞，包括桿狀核和分葉核粒細(xì)胞，結(jié)果分級(jí)為（-）、（+）、（+）、（+）、（+），分別為0-4分，所有細(xì)胞分值之和即為積分值，陽(yáng)性細(xì)胞之和為陽(yáng)性率。正常范圍：10-100分，陽(yáng)性率10-50%,注意事項(xiàng),1.標(biāo)本宜新鮮，若不能及時(shí)測(cè)定可先用固定液處理后，可保存數(shù)天。 2.基質(zhì)液配制后要及時(shí)應(yīng)用，以免失效或降低陽(yáng)性強(qiáng)度。 3.基質(zhì)液為一次性使用，配制后不能反復(fù)應(yīng)用。,臨床意義,1.各種急、慢性粒細(xì)胞性白血病，其N(xiāo)AP積分可降低甚至為零。 2.各種炎癥（細(xì)菌性），手術(shù)后，灼傷等NAP積分均可升高。 3. NAP活性對(duì)下列疾病有鑒別診斷價(jià)值： 1）.慢性粒細(xì)胞白血病與類白血病反應(yīng)的鑒別2 ）.慢性粒細(xì)胞白血病與其他骨髓增生性疾病 的鑒別,3） PNH與再生障礙性貧血的鑒別 4） 惡性組織細(xì)胞病與反應(yīng)性組織細(xì)胞增生癥的鑒別 5） 真性紅細(xì)胞增多癥與繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的鑒別 6） 區(qū)別細(xì)菌性感染和病毒性感染,粒細(xì)胞和部分單核細(xì)胞胞漿中存在過(guò)氧化酶，它可將底物(H2O2)分解產(chǎn)生出新生態(tài)氧，進(jìn)而使無(wú)色的聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)，后者與亞硝基鐵氰化鈉結(jié)合，形成穩(wěn)定的藍(lán)色物質(zhì)。,過(guò)氧化物酶(POX)染色原理,陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞,陽(yáng)性的原始粒細(xì)胞和陰性的淋巴細(xì)胞,陽(yáng)性的粒細(xì)胞和陰性的巨核細(xì)胞,臨床意義,用于鑒別急性粒細(xì)胞白血病、急性單核細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病。POX主要存在于粒系細(xì)胞中，細(xì)胞越成熟，其反應(yīng)越強(qiáng)。原始單核細(xì)胞呈陰性，幼稚單核細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。淋巴系、巨核系、紅細(xì)胞系各階段細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。,酸性磷酸酶(ACP)染色,原理 在酸性條件下(pH值4.9)，磷酸酶將作用液中的基質(zhì)(甘油磷酸鈉)水解，產(chǎn)生磷酸，進(jìn)而與鉛作用生成磷酸鉛沉淀于細(xì)胞酶活性存在處，然后與硫化銨作用，生成黑色硫化鉛沉淀。,臨床意義,1.網(wǎng)狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、組織細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞此酶呈陽(yáng)性反應(yīng)。 2.毛細(xì)胞白血病時(shí)，毛細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，且不為L(zhǎng)-酒石酸所抑制。 3.戈謝細(xì)胞ACP染色陽(yáng)性，而尼曼-匹克細(xì)胞呈陰性。,特異性酯酶(SE)染色 原理 氯醋酸AS-D萘酚酯酶為粒細(xì)胞所特有，故稱特異性酯酶，可將基質(zhì)中的氯醋酸AS-D萘酚水解而產(chǎn)生萘酚AS-D，后者與重氮鹽偶聯(lián)生成不溶性有色沉淀定位于胞漿中。,臨床意義 1.正常血細(xì)胞反應(yīng)：SE在分化好的原始粒細(xì)胞可呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，早幼粒細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，SE活性不隨粒細(xì)胞的成熟而增強(qiáng)。單核細(xì)胞呈陰性或弱陽(yáng)性反應(yīng)，其他細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。,2.急性白血病類型的鑒別：急性粒細(xì)胞白血病時(shí)，原始粒細(xì)胞和早幼粒細(xì)胞的SE活性顯著增強(qiáng)；急性單核細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性巨核細(xì)胞白血病時(shí)，其原始、幼稚細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。,非特異性酯酶(NSE)染色 原理 -醋酸萘酚酯酶存在于單核細(xì)胞粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞中，故稱為非特異性酯酶。NSE水解基質(zhì)液中-醋酸萘酯而產(chǎn)生-萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)生成不溶性有色沉淀定位于胞質(zhì)中。,陽(yáng)性的原始單核細(xì)胞,被NaF抑制,被NaF抑制的原單細(xì)胞和不抑制的中幼粒細(xì)胞,臨床意義 1.正常血細(xì)胞反應(yīng)：NSE主要存在于單核細(xì)胞系，從原單細(xì)胞到成熟單核細(xì)胞逐漸增強(qiáng)。陽(yáng)性反應(yīng)能被NaF抑制，粒細(xì)胞一般呈陰性反應(yīng)。,2.急性白血病類型的鑒別：急性單核細(xì)胞白血病時(shí)，NSE呈強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性反應(yīng)，但NSE活性能被氟化鈉所抑制，稱為氟化鈉抑制試驗(yàn)陽(yáng)性。,急性粒細(xì)胞白血病時(shí)，有部分病例是弱陽(yáng)性或陽(yáng)性反應(yīng)，但其酶活性不被氟化鈉抑制，即氟化鈉抑制試驗(yàn)陰性。故本試驗(yàn)可以用于急性單核細(xì)胞白血病的診斷及其與急性粒細(xì)胞白血病的鑒別。,糖原染色（又稱過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)，PAS反應(yīng)） 原理 含有乙二醇基的糖類，在過(guò)碘酸的作用下，經(jīng)氧化而產(chǎn)生雙醛基，醛基進(jìn)而與堿性復(fù)紅液(Schiff液)結(jié)合，使無(wú)色液體變成紫紅色染料，并沉著于含有糖原的細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)上。,正常血細(xì)胞中中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞及少數(shù)淋巴細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)。 1.紅細(xì)胞系列的糖原反應(yīng)及其診斷意義：正常人、再生障礙性貧血、巨幼紅細(xì)胞貧血的幼稚紅細(xì)胞均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng),臨床意義,巨幼貧的PAS染色幼紅細(xì)胞呈陰性,AML-M6 PAS 染色 （幼紅細(xì)胞呈顆粒狀陽(yáng)性）,溶血性貧血及MDS偶而有弱陽(yáng)性反應(yīng)。紅白血病、缺鐵性貧血、地中海貧血的幼稚紅細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)。,2.急性粒細(xì)胞白血病的原始及早幼粒細(xì)