親和素橋連構(gòu)建攜抗P選擇素單抗靶向超聲微泡及體外熒光鑒定.doc

南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文親和素橋連構(gòu)建攜抗P-選擇素單抗靶向超聲微泡及體外熒光鑒定姓名：鄭道文申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：內(nèi)科學(xué)（心血管?。┲笇?dǎo)教師：吳平生;賓建平20080415中文摘要效能的評(píng)價(jià)可采用多種體內(nèi)和體外方法，近年來(lái)國(guó)外已有應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)定性和定量評(píng)價(jià)特異性靶向超聲微泡配體結(jié)合率的報(bào)道。體外熒光法具有直觀顯示靶向超聲微泡構(gòu)建過(guò)程的獨(dú)特作用。因此，本研究擬利用生物素抗生蛋白鏈菌素（親和素）生物素（）配體橋連技術(shù)構(gòu)建一種可用于評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮炎癥或再灌注損傷的攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡，并采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其配體連接可靠性進(jìn)行定性和定量觀察。方法和結(jié)果一、普通脂質(zhì)微泡（）的制備及熒光標(biāo)記：稱(chēng)取一定比例的、等脂質(zhì)材料及輔助材料子容器瓶中，加入蒸餾水混勻，通入全氟丙烷飽和溶液，采用聲振法，超聲振蕩至形成乳白色液體，制得包裹全氟丙烷氣體的普通脂質(zhì)微泡（），分裝于安瓿中，冷藏保存。稱(chēng)取一定比例的、等脂質(zhì)材料、輔助材料及（親脂性熒光染料）于容器瓶中，采用同樣方法制得熒光脂質(zhì)微泡（），避光冷藏保存。采用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得平均粒徑為，濃度約為個(gè)。熒光顯微鏡下：標(biāo)記的普通脂質(zhì)微泡發(fā)出明亮的紅色熒光。二、攜抗選擇素單抗靶向微泡（）的構(gòu)建及熒光標(biāo)記：將、等脂質(zhì)材料及輔助材料按一定比例溶解于適量蒸餾水中，通入全氟丙烷飽和溶液，采用聲振法，超聲振蕩至形成乳白色液體，制得生物素化脂質(zhì)微泡（，）。靜置棄下清液純化微泡，利用特異結(jié)合系統(tǒng)，先后加入抗生蛋白鏈菌素及生物素化抗選擇素單抗，分別制得鏈酶親和素超聲微泡（，）和攜抗選擇素單抗靶向微泡（，）。將與抗生蛋白鏈菌素（）直接孵育，制得熒光鏈酶親和素超聲微泡（，）；二抗（抗抗選擇素單抗抗體）標(biāo)記。采用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得碩士學(xué)位論文平均粒徑，濃度個(gè)。熒光顯微鏡下：大小分布均勻，加入二抗孵育后，靶向微泡發(fā)出明亮的綠色熒光；被激發(fā)出明亮的綠色熒光。三、攜抗選擇素單抗靶向微泡（）的鑒定：不同熒光標(biāo)記物分別標(biāo)記的不同部位，觀測(cè)微泡熒光強(qiáng)度（、和級(jí)）。以作對(duì)照，按每個(gè)抗生蛋白鏈菌素孵育、沉淀和洗滌后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)大小均一的微泡發(fā)出均勻明亮的綠色熒光（級(jí)），而與等量抗生蛋白鏈菌素直接孵育、沉淀和洗滌后無(wú)熒光顯示（級(jí)）。以兩個(gè)濃度梯度（：和：）的二抗標(biāo)記、和，熒光顯微鏡下可見(jiàn)大小均一的在兩個(gè)濃度梯度下均發(fā)出明亮的綠色熒光（級(jí)）；而、僅在：濃度梯度時(shí)顯示微弱的綠色熒光（級(jí)），：濃度梯度時(shí)無(wú)熒光顯示（級(jí)）；普通脂質(zhì)微泡在兩個(gè)濃度梯度下均無(wú)熒光顯示（級(jí)）。以抗生蛋白鏈菌素及熒光二抗作為熒光探針，分別標(biāo)記和。各取個(gè)，其中一管作為對(duì)照，另一管與孵育、洗滌、純化微泡，然后用流式細(xì)胞儀分析微泡的綠色熒光強(qiáng)度；各取個(gè)、和，分別與等量二抗直接孵育、洗滌，用流式細(xì)胞儀分析各組微泡與熒光二抗結(jié)合率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。流式細(xì)胞術(shù)（）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：熒光曲線明顯右移，即鏈酶親和素超聲微泡（）構(gòu)建成功。與二抗的結(jié)合率為（士），顯著高于和（，），而與的熒光強(qiáng)度無(wú)差異（瑚），表明攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（）構(gòu)建成功。結(jié)論、抗選擇素單抗通過(guò)親和素橋連特異有效的裝配在生物素化脂質(zhì)超聲微泡表面，成功構(gòu)建了攜抗一選擇素單抗靶向微泡；、體外熒光法是鑒定靶向超聲微泡配體連接可靠性有效、簡(jiǎn)便的方法，關(guān)鍵詞選擇素靶向超聲微泡熒光流式細(xì)胞術(shù)碩士學(xué)位論文一：”釕，（），、硝，雒“，（）（），碩士學(xué)位論文（）：（），（），逗），（），（），：（）：一，一（）誠(chéng)也，（），（）（）（）（，：晰研（）：，（）研，（）（），（），（）（：）（），（）：，（），弱，、訪，；，謝，”、析碩士學(xué)位論文（）：，、砘（士），伊，）妒），州（）。：；）縮略詞表縮略詞表原創(chuàng)性聲明南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)的成果作品。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。除與外單位合作項(xiàng)目將予以明確方式規(guī)定外，本研究已發(fā)表與未發(fā)表成果的知識(shí)產(chǎn)權(quán)均歸屬第一軍醫(yī)大學(xué)。本人承諾承擔(dān)本聲明的法律效果。作者簽名：日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)第一軍醫(yī)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于（請(qǐng)?jiān)谝韵孪鄳?yīng)方框內(nèi)打“寸）：、保密口，在一年解密后適用本授權(quán)書(shū)。、不保密口。作者簽名：導(dǎo)師簽名：郯荔乏鋤云乞日期：洲年月，日日期：啷年月日碩士學(xué)位論文上】一目雷聲學(xué)造影（，）又稱(chēng)對(duì)比超聲，是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)微循環(huán)血流的影像新技術(shù)。其原理是經(jīng)周?chē)o脈注入含有微氣泡的聲擎造影劑，微泡可通過(guò)肺循環(huán)抵達(dá)左心室，繼之進(jìn)入全身微循環(huán)。當(dāng)微泡通過(guò)微血管床時(shí)，在超聲影像上可見(jiàn)到心肌、肝臟等實(shí)質(zhì)臟器影像對(duì)比增強(qiáng)。由于微泡通過(guò)組織時(shí)完全保持在血管內(nèi)，微泡的大小及變形性與紅細(xì)胞相當(dāng)，可視作一種理想、安全的紅細(xì)胞流動(dòng)的示蹤劑。靶向超聲分子成像是目前分子影像學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而靶向超聲微泡是實(shí)現(xiàn)靶向超聲分子成像的關(guān)鍵。靶向超聲微泡是將配體或抗體裝配在超聲微泡表面而成。靶向超聲分子成像是一門(mén)新興發(fā)展的將超聲造影技術(shù)與靶向超聲微泡相結(jié)合，依靠微泡表面固有的特性或通過(guò)對(duì)微泡進(jìn)行特殊處理，使微泡能滯留在特殊的組織和器官，而對(duì)體內(nèi)組織器官微觀病變進(jìn)行分子水平的探測(cè)與成像的方法。靶向超聲微泡技術(shù)的出現(xiàn)，拓展了傳統(tǒng)超聲微泡技術(shù)的應(yīng)用范圍，其一是發(fā)展一種無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)各種病變組織和器官的分子學(xué)圖像，如血管內(nèi)皮損傷、血栓形成、血管新生和腫瘤等；其二是可能為基因和藥物的靶向釋放提供新的技術(shù)支持，】靶向超聲微泡作為靶向超聲分子成像的基礎(chǔ)，其成功構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)靶向超聲分子成像的關(guān)鍵。超聲造影劑的靶向機(jī)制有兩種：被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向。被動(dòng)靶向是通過(guò)機(jī)體本身固有的防御機(jī)制，即利用負(fù)責(zé)清除異物的巨噬細(xì)胞吞噬造影劑微泡獲得靶向成像或者靶向傳輸和治療。主動(dòng)靶向是通過(guò)在微泡表面上裝配特異性配體和（或）具有靶向性的單克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)，微泡不需要通過(guò)白細(xì)胞的介導(dǎo)，直接與病變組織和器官內(nèi)小血管內(nèi)皮細(xì)胞或血栓等結(jié)合。相對(duì)于被動(dòng)靶向，主動(dòng)靶向具有高度的特異性和靶向性的特點(diǎn)，避免了吞噬細(xì)胞對(duì)微泡的破壞。因此主動(dòng)靶向是目前研究的熱點(diǎn)，也是靶向微泡構(gòu)建的主要方式。而在靶向超聲微泡的構(gòu)建上，如何實(shí)現(xiàn)相關(guān)配體（抗體）與微泡外殼的有效連接是其核心技術(shù)，配體前言和微泡外殼的連接效果將直接影響靶向超聲微泡的靶向效率及主動(dòng)特異效能。目前，在配體的連接方法上主要有離子鍵、物理吸附、耦聯(lián)劑或橋連劑介導(dǎo)連接等共價(jià)結(jié)合法或“抗生物素蛋白生物素復(fù)合體”橋接的非共價(jià)結(jié)合，后者因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而倍受青睞及采用。首先，抗生物素蛋白對(duì)生物素有高度的親和力（以），兩者可以在生理?xiàng)l件下迅速形成穩(wěn)定的結(jié)合體；另外，抗生物素具有四個(gè)獨(dú)立的生物素結(jié)合位點(diǎn)，可極大的提高信號(hào)的強(qiáng)度和探測(cè)的敏感性【。為保證配體的高結(jié)合性和最大的靶向結(jié)合，在微泡外殼與靶向配基之間采用柔軟的、可塑形的多聚空間臂，如聚，醇（）作為連接子，這樣微泡的靶向性顯著優(yōu)越于將配體直接連接到外殼的方式。其不僅能提供配體與受體結(jié)合所需的相對(duì)較長(zhǎng)的接觸時(shí)間與更多的接觸機(jī)會(huì)，而且使配基之間的距離達(dá)至或更遠(yuǎn)，以減少結(jié)合到微泡表面配基之間的相互影響。脂質(zhì)分子與生物膜有較大的相似性與組織相容性，具有可變性，有利于配體的裝配。因此，通過(guò)對(duì)脂質(zhì)微泡表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物分子免疫學(xué)構(gòu)建，有望制備出一系列高效、特異的靶向微泡（見(jiàn)圖）。選擇素在炎癥性刺激的數(shù)分鐘內(nèi)就在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面開(kāi)始“儲(chǔ)存”和表達(dá)，因此通過(guò)研制針對(duì)選擇素的靶向微泡，將有望早期評(píng)價(jià)心臟、腎臟等機(jī)體重要器官血管內(nèi)皮炎癥。等應(yīng)用攜抗選擇素單克抗靶向超聲微泡成功評(píng)價(jià)了血管炎癥，但尚處于試驗(yàn)研究的起步階段，存在諸多問(wèn)題亟待解決，而國(guó)內(nèi)目前尚沒(méi)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬首先制備插入生物素化聚乙烯二醇（，）分子橋的脂質(zhì)超聲微泡，利用生物素抗生蛋白鏈菌素生物素（）特異結(jié)合系統(tǒng)，裝配上抗選擇素單抗，通過(guò)該方法構(gòu)建的攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡，可與血管內(nèi)皮炎癥細(xì)胞表達(dá)的選擇素進(jìn)行高效的靶向結(jié)合。碩士學(xué)住論文：圖特異靶向脂質(zhì)微泡生物學(xué)構(gòu)建示意圖構(gòu)建的攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡是否成功，配體的裝配效率及靶向性如何，需對(duì)其進(jìn)行鑒定。目前用于觀察及評(píng)價(jià)靶向超聲微泡的方法主要有體外與體內(nèi)評(píng)價(jià)。體外評(píng)價(jià)方法：平行板流動(dòng)腔：熒光標(biāo)記法：流式細(xì)胞儀檢測(cè)；液相色譜分析等】。體內(nèi)最常用的方法：通過(guò)目測(cè)超聲造影觀察病變部位是否有特異性增強(qiáng)顯影；靶部位與周?chē)M織造影后定量分析；病理組織學(xué)檢查等【幡。通過(guò)對(duì)靶向微泡的靶向部位進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用熒光顯微鏡能直觀顯示靶向微泡的構(gòu)建過(guò)程，而流式細(xì)胞術(shù)能對(duì)配體結(jié)合率進(jìn)行定量檢測(cè)，因此本研究擬采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)靶向超聲微泡配體連接可靠性進(jìn)行定性和定量檢測(cè)分析。參考文獻(xiàn)【】，列，：打；：。，前言；（）：【】，；（）：【】盯，鋤；（）：【】，圮！；（）：【】，；（）：【】，；（）：【】，（）；（）：【】，（）璐；（）：【，氏只；（）：碩士學(xué)位論文【】，；（）：【】，：】，（）：【】，（）：【】，（）【】鞏，（）：【】，：第一章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的構(gòu)建第一章攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡的構(gòu)建】。一和雷脂質(zhì)超聲微泡主要由脂質(zhì)雙分子層包裹氟碳?xì)怏w構(gòu)成。脂質(zhì)雙分子層與生物膜有較大的相似性與組織相容性，具有可變性，通過(guò)對(duì)脂質(zhì)雙分子層行化學(xué)修飾，裝配上不同特異性配體，有望制備出高效、特異的靶向超聲微泡，如與內(nèi)皮炎癥、血栓、腫瘤細(xì)胞等特異性結(jié)合的靶向微泡。本章擬首先制備插入生物素聚乙烯二醇（）分子橋的脂質(zhì)超聲微泡，利用特異結(jié)合系統(tǒng)，逐步構(gòu)建攜抗選擇素單抗的靶向超聲微泡，并對(duì)靶向超聲微泡的各部位進(jìn)行熒光標(biāo)記。材料與方法一、材料（一）實(shí)驗(yàn)試劑、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇生物素（）：美國(guó)公司、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（）、抗生蛋白鏈菌素（）：美公司、聚醇（）：德國(guó)公司、普洛沙姆（，）：德國(guó)、生物素化抗小鼠選擇素單克隆抗體（）：美國(guó)公司、抗生蛋白鏈菌素（）：美蟊公司、二氯三嗪基氨基熒光素（，）標(biāo)記二抗（抗抗選擇素單抗抗體）：美國(guó)公司、（，一，）：美碩士學(xué)位論文國(guó)公司、熒光生物素（）：美國(guó)公司、蒸餾水、全氟丙烷氣體（天津核工業(yè)理化工程研究院，純度）（二）儀器設(shè)備、型聲振儀（，）、冷凍干燥機(jī)（，）、型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、熒光顯微鏡：（德匡）、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、，美國(guó)；、微量進(jìn)樣器、微量天平（德國(guó)）、庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀（顆粒計(jì)數(shù)儀）二、方法（一）普通脂質(zhì)微泡（）的制備及熒光標(biāo)記稱(chēng)取一定比例的、等脂質(zhì)材料及輔助材料于容器瓶中，加入適量蒸餾水混勻，于加熱的恒溫水浴箱上充分溶解，通入全氟丙烷（）氣體飽和溶液，采用聲振法，制得包裹全氟丙烷氣體的脂質(zhì)微泡，分裝于安瓿中，于冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取一定比例的、等脂質(zhì)材料、輔助材料及（親脂性熒光染料）于容器瓶中，采用同樣方法制得熒光脂質(zhì)微泡（），避光冷藏保存。（二）生物素化脂質(zhì)微泡（）的制各將、等脂質(zhì)材料及輔助材料按一定比例在水性介質(zhì)中混合，邊搖勻邊通入氮?dú)?，在恒溫水浴箱上，使材料充分溶解。通入全氟丙烷（）氣體飽和溶液，采用聲振儀，選擇合適的功率和第一章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的構(gòu)建時(shí)間，超聲振蕩至形成乳白色液體，制得生物素化脂質(zhì)微泡（，）。靜置浮集上層微泡，棄下清液純化微泡。將得到的產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。（三）鏈酶親和素超聲微泡（）的制備及熒光標(biāo)記將制備好的生物素化脂質(zhì)微泡（），參照文獻(xiàn)【，按每個(gè)微泡加入抗生蛋白鏈菌素（親和素）冰上孵育，靜置浮集上層微球，棄下清液除去未結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素。制得鏈酶親和素超聲微泡（，），分裝于安瓿中，冷藏保存?zhèn)溆谩Ｍ瑯臃椒?，將生物素化脂質(zhì)微泡與抗生蛋白鏈菌素直接孵育，制得熒光鏈酶親和素超聲微泡（，），避光冷藏保存。將制得鏈酶親和素超聲微泡（）與熒光生物素（）直接孵育，制得熒光生物素親和素生物素超聲微泡（，），分裝于安瓿中，避光冷藏保存。（四）攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（）的制備及熒光標(biāo)記將制備好的鏈酶親和素超聲微泡（），按每個(gè)微泡加入生物素化抗小鼠選擇素單克隆抗體（￥），冰上孵育，靜置浮集上層微球，棄下清液除去未結(jié)合的抗體。制備完成攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（，）。將制得的靶向超聲微泡，按每個(gè)微泡加入熒光二抗（），冰上孵育，靜置浮集上層微球，棄下清液除去未結(jié)合的熒光二抗，分裝于安瓿中，避光冷藏保存。（五）檢測(cè)各種微泡的理化性質(zhì)采用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀檢測(cè)微泡濃度及粒徑分布。熒光顯微鏡觀察微泡的形態(tài)、大小、分布及熒光情況。碩士學(xué)位論文結(jié)果一、普通脂質(zhì)微泡（）濃度、大小及熒光標(biāo)記普通脂質(zhì)微泡（）的平均粒徑為，濃度約為個(gè)（圖）。熒光顯微鏡下：標(biāo)記的普通脂質(zhì)微泡發(fā)出明亮的紅色熒光（圖）目，甜。，礦”一州酣一一一：坩靜一：一，村：一：耐。、：一，、一“一：，鼉?nèi)缟湟?，一蕾一。鼬麓巷魂，魄，粕重一，口尊越童再塒嗣瞳，卅，射，城圖用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得普通脂質(zhì)微泡的測(cè)量結(jié)果；瑟一一。，。鶩第一章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的構(gòu)建圜百。？。于乙備二、靶向超聲微泡（）濃度、大小及各部位的熒光標(biāo)記攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡（）大小分布均勻，微泡平均粒徑，濃度個(gè)，（圖）；存放個(gè)月后，微泡平均粒徑，濃度個(gè)微泡濃度、粒徑未見(jiàn)明顯變化（圖、圖）。熒光顯微鏡下觀察：生物素化脂質(zhì)微泡女標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素孵育，制得熒光鏈酶親和素超聲微泡（），微泡發(fā)出明亮的綠色熒光（圖）：鏈酶親和素超聲微泡（）加入標(biāo)記生物素，制得熒光生物素親和素生物素超聲微泡（），微泡發(fā)出明亮的綠色熒光（圖）；攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡（）加入二抗孵育后，微泡發(fā)出明亮的綠色熒光（圖）。碩士學(xué)位論文陰臣冀瞄，一，。一：一；：耐：，：，；。；：之。：葺一曲譬柳，篇蚺喇，摹捕，盈一工，露？鈾，螗簟，嘲。，”毒悄蚋謁囊抽，髓一輔，肼柚圖用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡的測(cè)量結(jié)果；第一章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的構(gòu)建圖圖圈、圉分別表示制備后小時(shí)和個(gè)月的靶向超聲微泡（）普通光鏡像（）（），警奄：籀、潼：?。涸矶?。：圖熒光鏈酶親和素超聲微泡（）左圖為昔通光鏡像（右削為熒光鏡像（）碩士學(xué)位論文豳一二抗標(biāo)記捷抗選擇素單抗靶向超聲撒泡（）左圖為普通光鏡像（）右圖為熒光鏡像）（）第一章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的構(gòu)建討論超聲造影（，）又稱(chēng)聲學(xué)造影，是近年發(fā)展起來(lái)的一種評(píng)價(jià)微循環(huán)和組織灌注的新技術(shù)，超聲造影劑與紅細(xì)胞有相似的血管內(nèi)流變學(xué)特征【】，超聲造影成像利用其充當(dāng)流道顯示劑來(lái)判定心肌等組織血流灌注的強(qiáng)度和范圍。隨著基礎(chǔ)理論、造影劑和顯像技術(shù)的迅速發(fā)展，從早期的右心顯影發(fā)展到在毛細(xì)血管水平評(píng)價(jià)組織血流灌注。超聲造影已成為超聲領(lǐng)域中最前沿的跨學(xué)科研究重點(diǎn)，而超聲造影劑的研究也得到了快速發(fā)展。超聲造影劑發(fā)展經(jīng)歷三個(gè)階段。第一代超聲造影劑主要是包裹空氣的微泡造影劑，以、等商用造影劑為代表。其特點(diǎn)是微泡體積小、均勻且可安全通過(guò)肺循環(huán)，但包裹空氣的外殼較厚，諧振能力及穩(wěn)定性差，在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間短，容易破裂，雖能達(dá)到左心室顯像，但不能獲取滿意的心肌顯影。第二代超聲造影劑主要為包裹惰性氣體的微泡造影劑【】，以為代表。由于采用了血液彌散性極差的高分子氟碳?xì)怏w作為微泡內(nèi)的氣體構(gòu)成，使造影劑在穩(wěn)定性和有效性方面均有突破性進(jìn)展，經(jīng)外周靜脈注射后可以使血液產(chǎn)生強(qiáng)散射，并在毛細(xì)血管內(nèi)維持較高濃度，使實(shí)質(zhì)性器官顯影。其優(yōu)勢(shì)在于在合適的超聲強(qiáng)度作用下，氣泡能夠產(chǎn)生非線性震動(dòng)而不破裂。由于其內(nèi)包裹的惰性氣體分子量大，這類(lèi)造影劑有溶解度低、穩(wěn)定性好、微泡能夠產(chǎn)生較好的諧波信號(hào)等特點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)心肌顯影。第三代超聲造影劑即靶向超聲微泡，是在第二代造影劑的基礎(chǔ)上，將靶向于病變組織（如炎癥、腫瘤、血栓等）特定分子的特異配體（抗體）裝配于普通超聲微泡外殼構(gòu)建成靶向微泡。目前尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段。靶向超聲造影成像（）是新興發(fā)展的將超聲造影技術(shù)與靶向超聲微泡造影劑相結(jié)合，能對(duì)體內(nèi)組織器官微觀病變進(jìn)行分子水平的探測(cè)與成像的方法。靶向超聲造影是目前超聲造影的前沿性課題，隨著超聲造影劑在臨床的不斷應(yīng)用與實(shí)踐，使得超聲診斷學(xué)與治療學(xué)發(fā)生了跳躍式的前進(jìn)。靶向超聲造影技術(shù)被譽(yù)為超聲醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的“第三次革命”，它的出現(xiàn)大大拓展了傳統(tǒng)超聲微泡的應(yīng)用范圍，其一可發(fā)展一種無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)各種病變組織和器官的分子學(xué)圖像，如血碩士學(xué)位論文管內(nèi)皮損傷炎癥、血栓形成、腫瘤血管新生等的分子學(xué)成像得以實(shí)現(xiàn)，且其有效性已經(jīng)在各種動(dòng)物模型的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中得到驗(yàn)證【】；其二可能為基因和藥物的靶向釋放提供新的技術(shù)支持，系列研究表明剮】超聲介導(dǎo)的微氣泡破壞作用可明顯增加基因靶向轉(zhuǎn)染效率，是一種良好的基因傳送系統(tǒng)，能經(jīng)靜脈注射達(dá)到靶向治療的目的。本章首先采用聲振法制備了普通脂質(zhì)微泡（）和生物素化脂質(zhì)微泡（），標(biāo)記的普通脂質(zhì)微泡（）在熒光顯微鏡下激發(fā)出明亮的紅色熒光。在生物素化脂質(zhì)微泡（）基礎(chǔ)上，利用生物素抗生蛋白鏈菌素（親和素）生物素（）配體橋連技術(shù)構(gòu)建了攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（），微泡平均粒徑，濃度個(gè)，完全可以滿足超聲造影的需求。靶向微泡放置兩個(gè)月后粒徑和濃度未見(jiàn)明顯變化，說(shuō)明初步制備的靶向微泡已具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。普通光鏡下可見(jiàn)靶向微泡大小分布均勻，熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光。用不同的熒光標(biāo)記物標(biāo)記靶向微泡的各個(gè)部位，均能發(fā)出明亮的綠色熒光，說(shuō)明通過(guò)生物素親合素生物素（）該高效、特異的生物反應(yīng)系統(tǒng)，微泡靶向部位成功構(gòu)建。但由于非特異性結(jié)合會(huì)影響熒光強(qiáng)度，而對(duì)結(jié)果的判斷可能產(chǎn)生干擾作用，因此，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中我們將對(duì)靶向超聲微泡靶向結(jié)構(gòu)連接的可靠性進(jìn)行鑒定。結(jié)論成功制備了普通熒光脂質(zhì)微泡、生物素化脂質(zhì)微泡、鏈霉親和素超聲微泡和攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡；自制的攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡大小分布均勻，微泡的粒徑、濃度均達(dá)到超聲造影的要求。參考文獻(xiàn)【】，地夠，：第一章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的構(gòu)建【】，蜘，（）：】，、歷，（）：【】，（）：】，（）：【】，；：【】，；：【】，誠(chéng)；：】，【】，塒：碩士學(xué)位論文第二章攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定。一鄹吾構(gòu)建好的攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡，需對(duì)其特異性進(jìn)行鑒定。目前用于評(píng)價(jià)靶向超聲微泡與靶分子結(jié)合特異性和有效性的方法主要有：平行板流動(dòng)腔；流式細(xì)胞儀檢測(cè)；通過(guò)目測(cè)超聲造影觀察病變部位是否有特異性增強(qiáng)顯影；靶部位與周?chē)M織造影后定量分析；病理組織學(xué)檢查等。本章擬通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡的構(gòu)建過(guò)程和效果進(jìn)行定性觀察，并利用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)靶向超聲微泡配體連接的可靠性。材料和方法一、材料（一）實(shí)驗(yàn)試劑、第一章已制備：普通脂質(zhì)微泡（）生物素化脂質(zhì)微泡（）鏈酶親和素超聲微泡（）攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（）、抗生蛋白鏈菌素（）：美公司、二氯三嗪基氨基熒光素（，）標(biāo)記二抗（抗抗選擇素單抗抗體）：美國(guó)公司、蒸餾水、全氟丙烷氣體（天津核工業(yè)理化工程研究院，純度）（二）儀器設(shè)備、熒光顯微鏡：（德國(guó)）、微量進(jìn)樣器第二章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、流式細(xì)胞儀（美國(guó)公司）二、方法（一）熒光顯微鏡觀察鑒定靶向微泡鏈酶親和素超聲微泡（）的鑒定：按制備鏈酶親和素超聲微泡的方法，每個(gè)微泡加入（親和素）。以普通脂質(zhì)微泡（）作對(duì)照，分別向普通脂質(zhì)微泡和生物素化脂質(zhì)微泡（），加入等量，孵育、洗滌、純化微泡，置于熒光顯微鏡，對(duì)比觀察兩組微泡的熒光情況。攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（）的鑒定：分別取已經(jīng)制備好的種微泡（、）各，均分為組，每組包括種微泡：、，各。按每個(gè)微泡加入熒光二抗原液（）為標(biāo)準(zhǔn)，將熒光二抗原液倍比稀釋?zhuān)。ǎ?、：）兩個(gè)濃度梯度的熒光二抗分別標(biāo)記兩組微泡。孵育、洗滌、純化微泡，置于熒光顯微鏡，對(duì)比觀察各組微泡的熒光情況。（二）熒光顯微鏡觀察微泡的熒光標(biāo)記情況，將不同微泡的熒光圖片混雜在一起，由操作熒光顯微鏡有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員在不知道制備方法的情況下，隨機(jī)抽取圖片閱讀。并按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行目測(cè)判斷熒光強(qiáng)度分級(jí)：無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光，級(jí)；：僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光，級(jí)；：可見(jiàn)有較明亮的熒光，級(jí)；槲：可見(jiàn)明亮的熒光，級(jí)。（三）流式細(xì)胞術(shù)（）檢測(cè)靶向微泡：標(biāo)記生物素化脂質(zhì)微泡（）以證明抗生蛋白鏈菌素（）結(jié)合在生物素化脂質(zhì)微泡（）表面，即鏈酶親和素超聲微泡（）的構(gòu)建成功；二抗標(biāo)記攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（）以證明生物素化抗選擇素單抗橋連在，即構(gòu)建成功。（）各取個(gè)，其中一管作為對(duì)照，另一管與孵育、洗滌、純化微泡，用流式細(xì)胞儀分析微泡的碩士學(xué)位論文綠色熒光強(qiáng)度及生物素化脂質(zhì)微泡與（親和素）的結(jié)合率。（）各取個(gè)、和，分別與等量二抗直接孵育、洗滌，用流式細(xì)胞儀分析各組微泡的熒光二抗結(jié)合率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩組等級(jí)資料間比較采用檢驗(yàn)，多組等級(jí)資料間比較采用檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)間的比較用單向方差分析，兩兩比較用法檢驗(yàn)。尸表示有顯著性差異（雙側(cè)）。結(jié)果一、微泡熒光強(qiáng)度目測(cè)判斷結(jié)果檢驗(yàn)結(jié)果表明：統(tǒng)計(jì)值為，平均秩和最高，說(shuō)明兩組微泡的熒光亮度有顯著性差異，且的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)“（見(jiàn)表，表）【檢驗(yàn)結(jié)果表明：在二抗?jié)舛龋簳r(shí)：，平均秩和最高，說(shuō)明各組微泡的熒光濃度有顯著性差異，且的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)（見(jiàn)表，表）；在二抗?jié)舛龋簳r(shí)：，平均秩和最高，說(shuō)明各組微泡的熒光強(qiáng)度有顯著性差異，且的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)（見(jiàn)表，表）。第二章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定表兩種徽抗生蛋白鏈菌素后微泡熒光亮度的目測(cè)評(píng)價(jià)（）（）表兩種微泡加入一抗生蛋白鏈菌素后微泡熒光亮度比較注：碩士學(xué)位論文表四種微泡加，入熒光二抗（抗?jié)舛龋海┖笪⑴轃晒饬炼鹊哪繙y(cè)評(píng)價(jià)（）（：）（）表四種微泡加入熒光二抗（二抗?jié)舛龋海┖蟮臒晒饬炼缺容^（：）第二章攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定表四種微泡加入熒光二抗（抗?jié)舛龋海┖笪⑴轃晒饬炼鹊哪繙y(cè)評(píng)價(jià)（）（：）（）表四種微泡加入熒光二抗（二抗?jié)舛龋海┖蟮臒晒饬炼缺容^（：）碩士學(xué)位論文二、靶向結(jié)構(gòu)的熒光鑒定生物素化脂質(zhì)微泡（），加入標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素孵育后形成熒光鏈酶親和素超聲微泡（），在熒光顯微鏡下親和素超聲微泡發(fā)出明亮的綠色熒光（級(jí)）（見(jiàn)圈）；而普通脂質(zhì)微泡（）與標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素直接孵育后，在熒光顯微鏡下普通脂質(zhì)微泡無(wú)熒光顯示，或可見(jiàn)未被洗凈的底色有零星微弱熒光（級(jí)）（見(jiàn)圖）。圖左側(cè)分別為相應(yīng)熒光標(biāo)記微泡的光鏡所見(jiàn)?？惯x擇素單抗靶向超聲微泡（）、鏈酶親和素超聲微泡（）、生物素化脂質(zhì)微泡（）和普通脂質(zhì)微泡（）分別加入等量的熒光二抗孵育、洗滌、純化后。在熒光顯微鏡下在兩個(gè)濃度梯度下均發(fā)出明亮的綠色熒光（級(jí)）（見(jiàn)圖和見(jiàn)圖）。在熒光顯微鏡下（見(jiàn)圖）和（見(jiàn)圖）僅在：稀釋濃度時(shí)顯示微弱的綠色熒光（級(jí)），而在：稀釋濃度時(shí)（見(jiàn)圖）和（見(jiàn)圖）均無(wú)熒光顯示（級(jí)）。在熒光顯微鏡下在兩個(gè)濃度梯度下均無(wú)熒光顯示（級(jí)）（見(jiàn)圖和見(jiàn)圖）。圖左側(cè)分別為相應(yīng)熒光標(biāo)記微泡的普通光鏡所見(jiàn)。：熒光親和素：熒光親和紊圖：普通光鏡像及熒光鏡像（）。（）；（）第二章攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定：圖：、分別加入等量、等濃度熒光抗普通光鏡像及熒光鏡像（）（二抗?jié)舛龋海?，（，碩士學(xué)位論文：圖：、分剮加入等量、等濃度熒光二抗普通光鏡像及熒光鏡像（）（二抗?jié)舛龋海?，日，（，三、流式?xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果與孵育、洗滌后，微泡的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，曲線明顯右移，與的結(jié)臺(tái)率在左右（圖）。由圖、表可知，、和與一二抗結(jié)合率分別為為（工）、（）和（），三組微泡的一二抗結(jié)合率有顯著性差異（，）檢驗(yàn)可知的結(jié)合率與、兩組微泡均有顯著性差異（，），的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與的熒光強(qiáng)度無(wú)差異（）。第二章攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定衛(wèi)正塒咀略，碉廣藥而研研麗圖微泡的的綠色熒光強(qiáng)度直方圖醇口碩士學(xué)位論支圖二抗標(biāo)記、和微泡的綠色熒光強(qiáng)度直方圖時(shí)，州船（）表靶向超盧徽泡（）與熒光抗的結(jié)合率（曲）（）呵（士）第二章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定、平行板流動(dòng)腔鑒定攜抗選擇素靶向超聲微泡（）。影片序列及照片離線分析，選取各分析時(shí)間點(diǎn)上張連續(xù)照片序列，使用自動(dòng)把張圖片進(jìn)行合并后均化，假如微泡靶向結(jié)合在同一位置，那它還是出現(xiàn)在圈片原來(lái)位置上，而在流動(dòng)腔內(nèi)滾動(dòng)及隨流動(dòng)方向游離的微泡，將會(huì)看到一陰影軌跡：平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)顯示可與（一選擇素的段）包被的平行板流動(dòng)腔靶向結(jié)臺(tái)，幽為包被濃度為，以剪切應(yīng)力作用下通過(guò)流動(dòng)腔，取點(diǎn)前后張照片進(jìn)行合并，圖中箭頭所指拖尾的陰影部分為滾動(dòng)的微泡，黑色中間透亮部分為牢固結(jié)合的微泡（見(jiàn)圖）。蘭，。，。竺圖弗在平行板流動(dòng)腔實(shí)現(xiàn)靶向結(jié)臺(tái)碩士學(xué)住論文五、靶向超聲微泡的造影效果經(jīng)靜脈注入攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡（）后，在小鼠缺血再灌注（豫）腎臟獲得滿意的聲學(xué)造影效果（圖）一圈圖小鼠腎臟靶向超聲造影效果削圖為腎臟本底圖像圖為實(shí)驗(yàn)小鼠，腎臟普通臘質(zhì)微泡（）的灌注顯影蚓像蚓為實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟靶向超聲微泡（）的灌注顯影削像）討論血管內(nèi)皮炎癥（貓訓(xùn)齟刪乩）作為與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)的重要病理生理過(guò)程，已經(jīng)在各種臨床試驗(yàn)、基礎(chǔ)研究及流行病學(xué)調(diào)查中得到確證，并日益受到人們的重視。研究表明，選擇素在炎癥性刺激的數(shù)分鐘內(nèi)就在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面開(kāi)始“儲(chǔ)存”和表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞激活、黏附第二章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定并聚集于損傷區(qū)域的血管內(nèi)皮細(xì)胞，釋放多種炎癥介質(zhì)或促炎細(xì)胞因子，引起血管內(nèi)皮炎癥的發(fā)生及發(fā)展，導(dǎo)致組織器官的損傷【叫。因此通過(guò)研制出針對(duì)選擇素的靶向超聲微泡，應(yīng)用靶向?qū)Ρ瘸暎ǎ┻@一新興的超聲成像技術(shù)對(duì)炎癥部位進(jìn)行靶向超聲分子成像，將有望從分子水平對(duì)多種疾病進(jìn)行早期的評(píng)價(jià)和診斷。靶向超聲微泡作為靶向超聲分子成像的基礎(chǔ)，其成功構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)靶向超聲分子成像的關(guān)鍵。而在靶向超聲微泡的構(gòu)建上，如何實(shí)現(xiàn)相關(guān)配體（抗體）與微泡外殼的有效連接是其核心技術(shù)，配體和微泡外殼的連接效果將直接影響靶向超聲微泡的靶向效率及主動(dòng)特異效能。目前，在配體的連接方法上主要有離子鍵、物理吸附、耦聯(lián)劑或橋連劑介導(dǎo)連接等共價(jià)結(jié)合法或“抗生物素蛋白生物素復(fù)合體”橋接的非共價(jià)結(jié)合，后者因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而倍受青睞及采用。首先，抗生物素蛋白對(duì)生物素有高度的親和力（以），兩者可以在生理?xiàng)l件下迅速形成穩(wěn)定的結(jié)合體；另外，抗生物素具有四個(gè)獨(dú)立的生物素結(jié)合位點(diǎn)，可極大的提高信號(hào)的強(qiáng)度和探測(cè)的敏感性。本研究構(gòu)建的攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡采用生物素抗生蛋白鏈霉素生物素（）特異結(jié)合系統(tǒng)，首先制備表面含有生物素化聚乙二醇（）分子橋的脂質(zhì)微泡，然后逐步裝配上抗生蛋白鏈菌素和生物素化的抗選擇素單抗。生物素親合素生物素（，）是一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)，具有很強(qiáng)的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和適應(yīng)性。因此，靶向微泡制備的每個(gè)步驟，都必須去除未結(jié)合的生物素化脂質(zhì)或親和素以純化微泡。另外，從靶向微泡中清除未發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的抗體也是必要的步驟，否則游離抗體將會(huì)與靶向微泡外殼上連接的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶器官的相應(yīng)靶點(diǎn)，從而降低靶向超聲微泡在靶器官的有效黏附率，導(dǎo)致靶向超聲分子成像敏感度的下降。靶向超聲微泡構(gòu)建是否成功，需對(duì)其進(jìn)行鑒定，目前用于觀察及評(píng)價(jià)靶向超聲微泡的方法主要有體外與體內(nèi)評(píng)價(jià)。體外評(píng)價(jià)方法：平行板流動(dòng)腔；熒光標(biāo)記法；流式細(xì)胞儀檢測(cè)等【。體內(nèi)最常用的方法：通過(guò)目測(cè)超聲造影觀察碩士學(xué)位論文病變部位是否有特異性增強(qiáng)顯影；靶部位與周?chē)M織造影后定量分析；病理組織學(xué)檢查掣。本研究采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀對(duì)靶向微泡進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)熒光顯微鏡定性觀察，我們可以看到：普通脂質(zhì)超聲微泡（）與標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素（親和素）直接孵育、洗滌后微泡外殼無(wú)熒光顯示；而生物素，化脂質(zhì)超聲微泡（）加入等量標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素（親和素）直接孵育、經(jīng)反復(fù)洗滌后，在熒光顯微鏡下外殼仍有明亮的綠色熒光（級(jí)）。表明抗生蛋白鏈菌素生物素化脂質(zhì)微泡（）制備成功，而且是通過(guò)生物素抗生蛋白鏈菌素（）結(jié)合系統(tǒng)，使熒光親和素與生物素化脂質(zhì)微泡（）有效結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示：攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（），再與熒光二抗直接孵育、洗滌后，熒光顯微鏡顯示；殼在兩個(gè)濃度梯度下均有明亮的綠色熒光（級(jí)）。表明通過(guò)特異結(jié)合系統(tǒng)，生物素化抗選擇素單克隆抗體有效的連接在抗生蛋白鏈菌素生物素化脂質(zhì)微泡（）表面上，攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（）構(gòu)建成功。而和在二抗：稀釋濃度時(shí)激發(fā)出微弱的綠色熒光（級(jí)），當(dāng)釋稀濃度為：時(shí)和在熒光顯微鏡下無(wú)熒光顯示，可能是由于生物素或親和素與熒光二抗出現(xiàn)非特異性吸附，這種非特異的結(jié)合強(qiáng)度較弱、靈敏度低和有明顯的濃度依賴性?？股鞍祖溇兀ㄓH和素）能與生物素特異性結(jié)合，利用作為熒光探針標(biāo)記生物素化脂質(zhì)微泡（），同理，抗選擇素單抗能與二抗特異性結(jié)合，可利用二抗作為熒光探針標(biāo)記靶向超聲微泡（），運(yùn)用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)與的結(jié)合率及與盯二抗的結(jié)合率。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：生物素化脂質(zhì)微泡（）入孵育、洗滌后，定量隨機(jī)計(jì)數(shù)微泡，其攜帶標(biāo)記熒光的抗生蛋白鏈菌素（親和素）的百分率保持在左右。由圖、表可知：雖然存在非特異性吸附，、都吸附有二抗，但通過(guò)抗選擇素單抗與二抗的特異性結(jié)合，與二抗的結(jié)合率為（士），顯著高于第二章攜抗一選擇素單抗靶向超聲微泡的鑒定和（廬，）。表明通過(guò)生物素抗生蛋白鏈菌素（親和素）生物素（）橋連，本研究有效制備了抗生蛋白鏈菌素生物素化脂質(zhì)微泡（），并在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（）。因此我們也可以得出結(jié)論，流式細(xì)胞儀是定量檢測(cè)靶向微泡配體連接效能的有效方法。，總之，體外熒光法是鑒定靶向微泡配體連接可靠性有效、簡(jiǎn)便的方法，本研究結(jié)果顯示抗選擇素單抗成功通過(guò)親和素橋連有效裝配在表面上。對(duì)其穩(wěn)定性、有效性、安全性尚需結(jié)合其它方法進(jìn)一步的研究。結(jié)論、成功構(gòu)建攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡；、采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)定性和定量證明抗選擇素單抗成功通過(guò)親和素橋連特異有效裝配在生物素化脂質(zhì)微泡（）表面上。參考文獻(xiàn)【】，：，（）：【】，營(yíng)，（）：【】，：，（）：【】，鎖，碩士學(xué)位論文，（）：【】，（）：【】，（）：】，：【】，（）：【】，（）：【】，颶【，（）【】，（）：【】，：全文總結(jié)全文總結(jié)、本研究在國(guó)內(nèi)率先利用生物素抗生蛋白鏈菌素（親和素）生物素（）配體橋連技術(shù)成功構(gòu)建攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡（），大小分布均勻，平均粒徑，濃度個(gè)。、我們采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)率先定性和定量證明抗選擇素單抗成功通過(guò)親和素橋連特異和有效的裝配在生物素化脂質(zhì)微泡（）表面上，研究表明體外熒光法是鑒定靶向微泡配體連接可靠性有效、簡(jiǎn)便的方法。碩士學(xué)位論丈成果、鄭道文，賓建平，農(nóng)盛雄，羅建春，王鵬，吳平生。組織多普勒定量評(píng)價(jià)高血壓與冠心病伴或不伴左室肥厚患者心臟舒縮功能。廣東醫(yī)學(xué)雜志，（），。、鄭道文，賓建平，吳平生。靶向超聲造影成像的研究進(jìn)展。中華超聲影像學(xué)雜志，（），。、鄭道文，楊莉，賓建平，陳少敏，王月剛，吳平生。親和素橋連構(gòu)建攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡及體外熒光鑒定。嶺南心血管病雜志，（）。、鄭道文，賓建平，農(nóng)盛雄，羅建春，王鵬，勞翼，吳平生。組織多普勒成像定量評(píng)價(jià)左室舒張功能。中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，、鄭道文，楊莉，賓建平，陳楚弟，陳少敏，王月剛，吳平生。親和素橋連構(gòu)建攜抗選擇素單抗靶向超聲微泡及體外熒光鑒定。中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志。（已修回）、陳少敏，賓建平，肖文星，楊帆，鄭道文等。超聲造影評(píng)價(jià)多巴胺對(duì)腎臟血流灌注的影響。中華超聲影像學(xué)志，（）、陳少敏，楊莉，賓建平，吳爵非，鄭道文，劉伊麗。攜帶抗選擇素單抗靶向微泡和對(duì)比超聲評(píng)價(jià)腎缺血再灌注損傷。中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志。（已修回）綜述綜述靶向超聲造影成像的研究進(jìn)展鄭道文（綜述）賓建平吳平生（審校）靶向超聲造影成像是新興發(fā)展的將超聲造影技術(shù)與靶向超聲微泡造影劑相結(jié)合，能對(duì)體內(nèi)組織器官微觀病變進(jìn)行分子水平的探測(cè)與成像的方法。靶向超聲造影是目前超聲造影的前沿性課題，隨著超聲造影劑在臨床的不斷應(yīng)用與實(shí)踐，使得超聲診斷學(xué)與治療學(xué)發(fā)生了跳躍式的前進(jìn)。靶向超聲微泡技術(shù)的出現(xiàn)，拓展了傳統(tǒng)超聲微泡技術(shù)的應(yīng)用范圍，其一可發(fā)展一種無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)各種病變組織和器官的分子學(xué)圖像；其二可能為基因和藥物的靶向釋放提供新的技術(shù)支持。目前靶向超聲造影成像成為影像學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文將對(duì)靶向超聲造影劑的構(gòu)建策略及靶向超聲造影成像在炎癥、血管新生及血栓形成等病理生理過(guò)程的應(yīng)用進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。一、靶向造影劑的構(gòu)建策略超聲造影劑與紅細(xì)胞有相似的血管內(nèi)流變學(xué)特征【】，超聲造影成像利用其充當(dāng)流道顯示劑來(lái)判定心肌等組織血流灌注的強(qiáng)度和范圍。靶向超聲造影成像依賴靶向微泡上的特殊配體與內(nèi)皮細(xì)胞表面對(duì)應(yīng)的配基（靶分子）的結(jié)合，選擇性固定在病變組織上。在自由循環(huán)的微氣泡被清除后（通常幾分鐘后），靶向微泡結(jié)合的程度通過(guò)散射回聲增強(qiáng)而被探測(cè)出。超聲造影劑的靶向機(jī)制有兩種：被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向。被動(dòng)靶向是通過(guò)機(jī)體本身固有的防御機(jī)制，即利用負(fù)責(zé)清除異物的巨噬細(xì)胞吞噬造影劑微泡獲得靶向成像或者靶向傳輸和治療。主動(dòng)靶向是通過(guò)在微泡表面上裝配特異性配體和（或）具有靶向性的單克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)，微泡不需要通過(guò)白細(xì)胞的介導(dǎo)，直接與病變組織和器官內(nèi)小血管內(nèi)皮細(xì)胞或血栓等結(jié)合。相對(duì)于被動(dòng)靶向，主動(dòng)靶向具有高度的特異性和靶向性的特點(diǎn)，避免了吞噬細(xì)胞對(duì)微泡的破壞。因此主動(dòng)靶向是目前碩士學(xué)位論文研究的熱點(diǎn)，也是靶向微泡構(gòu)建的主要方式。靶向微泡的構(gòu)建通常有兩種策略。第一種用改變微泡外殼的成分使其更容易附著在白細(xì)胞等病變組織中的細(xì)胞上。例如將帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸（）嵌合到微泡外殼上，由于的加入能增大補(bǔ)體活性，加快補(bǔ)體激活，增強(qiáng)微泡與白細(xì)胞粘附，從而制成了靶向白細(xì)胞造影劑，并已在諸多實(shí)驗(yàn)性應(yīng)用中初見(jiàn)潛力。等【，】首次成功顯示蛋白質(zhì)和脂質(zhì)超聲微泡，通過(guò)激活的白細(xì)胞粘附于“炎癥”（）組織的小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上。他們研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)微泡和脂質(zhì)微泡與白細(xì)胞粘附分子結(jié)合的機(jī)制不同，蛋白質(zhì)微泡通過(guò)整合素（）的介導(dǎo)與白細(xì)胞粘附分子（）結(jié)合，而脂質(zhì)微泡是通過(guò)補(bǔ)體的介導(dǎo)與白細(xì)胞粘附分子（調(diào)理素）結(jié)合，脂質(zhì)微泡與“炎癥”組織小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合效率明顯高于蛋白質(zhì)微泡。第二種常用的靶向策略包括在微泡外殼裝配與疾病相關(guān)的特異配體，如單克隆抗體、糖蛋白、碳水化合物、多肽或者。一般采取共價(jià)靶向結(jié)合或非共價(jià)靶向結(jié)合的方式將配體連接到已制備好的微泡表面。己其中，非共價(jià)結(jié)合多通過(guò)生物素一抗生物素蛋白鏈連接技術(shù)；而共價(jià)結(jié)合多采用羧酸酯類(lèi)衍生物介導(dǎo)配體與微泡外殼連接。為保證配基的高結(jié)合性和最大的靶向結(jié)合，在微泡外殼與靶向配基之間采用柔軟的、可塑形的多聚空間臂，如聚乙二醇（）作為連接子，這樣微泡的靶向性顯著優(yōu)越于將配體直接連接到外殼的方式。其不僅能提供配體與受體結(jié)合所需的相對(duì)較長(zhǎng)的接觸時(shí)間與更多的接觸機(jī)會(huì)，而且使配基之間的距離達(dá)至或更遠(yuǎn)，以減少結(jié)合到微泡表面配基之間的相互影響。靶向微泡要成功地實(shí)現(xiàn)靶向作用，需考慮幾個(gè)因素：微泡的特性、流變學(xué)特征及靶向分子特性。目前用于觀察及評(píng)價(jià)靶向微泡超聲造影劑的方法主要有體外與體內(nèi)評(píng)價(jià)。體外評(píng)價(jià)方法：平行板流動(dòng)腔；熒光標(biāo)記法；流式細(xì)胞儀檢測(cè)；液相色譜分析；童）評(píng)價(jià)其免疫活性；茚三酮實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)最常用的方法：通過(guò)目測(cè)超聲造影觀察病變部位是否有特異性增強(qiáng)顯影；靶部位與周?chē)M織造影后定量分析；病理組織學(xué)檢查，包括病理切片觀察病變部位特異性熒光物質(zhì)顯綜述影情況，電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察微泡在病變部位附著情況。二、靶向超聲造影成像的應(yīng)用炎癥成像許多疾病的發(fā)生發(fā)展都與血管的急慢性炎癥過(guò)程密不可分，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管內(nèi)皮功能紊亂是這一過(guò)程的始動(dòng)因素與中心環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮“炎癥”普遍存在于冠心病、高血壓和糖尿病等危及人類(lèi)健康和生命的三大主要?dú)⑹种?。介?dǎo)炎癥發(fā)生發(fā)展的內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞間細(xì)胞粘附分子在炎癥過(guò)程中大量表達(dá)，通過(guò)研制出針對(duì)細(xì)胞粘附分子的靶向超聲造影劑，對(duì)炎癥部位進(jìn)行靶向超聲造影成像來(lái)評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞粘附分子主要有選擇素、選擇素、等，目前用于靶向超聲造影成像研究較多的是選擇素、。等【】制備出攜抗選擇素單克隆抗體的靶向脂質(zhì)微泡，并以不含抗體的普通脂質(zhì)微泡和含同型對(duì)照抗體的作為對(duì)照組。在鼠提睪肌炎癥模型上，通過(guò)在體顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組微泡比較，更高效地結(jié)合在鼠提睪肌靜脈的炎癥部位。并對(duì)缺血再灌注損傷的小鼠腎臟炎癥模型進(jìn)行超聲造影成像，發(fā)現(xiàn)能明顯增強(qiáng)炎癥組織的超聲成像信號(hào)。等【應(yīng)用白細(xì)胞靶向微泡對(duì)缺血再灌注（）的炎癥模型進(jìn)行了組織成像；等【】用脂質(zhì)體殼的白細(xì)胞靶向微泡超聲造影圖像對(duì)犬心肌缺血再灌注（）模型進(jìn)行了在體無(wú)創(chuàng)觀察，發(fā)現(xiàn)用這種白細(xì)胞靶向微泡進(jìn)行超聲造影，能評(píng)價(jià)缺血再灌注損傷所致心肌炎癥的空間分布和時(shí)間分布。研究顯示，靶向超聲造影圖像顯示的炎癥范圍與檢測(cè)的炎癥范圍相似，而前者有獲得序列靶向圖像的能力，能提供同一動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)心肌缺血再灌注后炎癥信息，可以無(wú)創(chuàng)地、動(dòng)態(tài)地觀察缺血再灌注后心肌炎癥情況的變化，未來(lái)或?qū)⒖梢杂脕?lái)評(píng)估減少再灌注損傷治療新方法的治療效果。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展均伴隨著和水平的增高，并與病變的嚴(yán)重程度成正比。應(yīng)用超聲活性脂質(zhì)體行血管內(nèi)超聲成像已用來(lái)檢測(cè)豬頸動(dòng)脈炎癥硬化模型的和，研究表明造影劑在高切應(yīng)力動(dòng)脈血管內(nèi)也能與這碩士學(xué)位論文些靶分子目標(biāo)附著【】。最近針對(duì)，靶向超聲造影成像已用來(lái)評(píng)價(jià)輕至重度動(dòng)脈硬化疾病大鼠模型的炎癥反應(yīng)。等】研究發(fā)現(xiàn)：在急性心臟移植排斥反應(yīng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞上有細(xì)胞間粘附因子）的大量表達(dá)，通過(guò)制備出結(jié)合抗抗體的靶向造影劑，當(dāng)經(jīng)外周靜脈注入造影劑后，則在心臟排斥區(qū)通過(guò)抗抗體與內(nèi)皮細(xì)胞上的相結(jié)合，可促使超聲造影劑在排斥區(qū)滯留，局部造影劑濃度增加。腸炎時(shí)腸小靜脈黏膜地址素細(xì)胞粘附分子（）過(guò)度表達(dá)，等【】通過(guò)對(duì)小鼠腸炎模型的超聲造影成像，發(fā)現(xiàn)攜抗的靶向微泡能明顯增強(qiáng)炎癥組織的超聲回聲信號(hào)。表明靶向超聲造影成像應(yīng)可用于對(duì)心臟移植排斥反應(yīng)和克隆氏?。ㄑ装Y性腸疾病）的檢測(cè)。血管新生成像血管新生是腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病狀態(tài)的重要過(guò)程。運(yùn)用靶向超聲造影技術(shù)使新生血管分子成像，對(duì)這些疾病進(jìn)行早期診斷，已在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得顯著進(jìn)展。新生血管內(nèi)皮細(xì)胞選擇性上調(diào)整合素，因此通過(guò)制備攜抗整合素單克隆抗體的靶向超聲微泡，可使新生血管分子成像。嘗亭】利用新生血管靶向微泡的超聲造影圖像，在體觀察血管新生，他們把脂質(zhì)微泡表面連接上整合素單克隆抗體或者整合素，這種微泡與新生血管內(nèi)皮合成的（整合素的靶向結(jié)合實(shí)現(xiàn)靶向新生血管超聲造影成像。在體顯微鏡和超聲造影觀察結(jié)果證實(shí)，這種靶向微泡在血管新生處滯留增加。用新生血管靶向微泡進(jìn)行的超聲造影可對(duì)微血管形態(tài)成像，通過(guò)顯示新生血管數(shù)量和空間分布來(lái)評(píng)估微血管對(duì)生長(zhǎng)因子的早期反應(yīng)，為評(píng)估血管新生提供更多信息。這些信息對(duì)指導(dǎo)向缺血組織局部輸送促血管合成蛋白或基因十分有用。腫瘤生長(zhǎng)依賴于豐富的氧和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為此腫瘤通過(guò)新生血管來(lái)增加血液供應(yīng)，使腫瘤生長(zhǎng)迅速；同時(shí)，新生血管表達(dá)大量的特異性抗原，如、等。因此新生血管形態(tài)的成像將為檢測(cè)腫瘤和判斷腫瘤預(yù)后以及評(píng)估腫瘤對(duì)治療的敏綜述感性提供信息。等】應(yīng)用與相剛拘鰳單克隆抗體微泡，發(fā)現(xiàn)超聲造影可定位性評(píng)價(jià)惡性膠質(zhì)瘤的新生血管分布，腫瘤的外周新生血管密度最大，這是因?yàn)閷?shí)質(zhì)腫瘤的生長(zhǎng)主要取決于神經(jīng)血管的生長(zhǎng)和整合素表達(dá)。而】利用能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高度結(jié)合的三肽精氨酸精氨酸亮氨酸（，），作為配體與微泡連接，顯像小鼠腫瘤，同樣發(fā)現(xiàn)腫瘤新生血管區(qū)域相對(duì)正常組織血管區(qū)明顯增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)顯示靶向超聲造影可能成為早期發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤的影像學(xué)新方法。卞愛(ài)娜等【】將單抗結(jié)合到自制的脂質(zhì)體微泡上，在體外試驗(yàn)中能與人肝癌細(xì)胞高效特異結(jié)合，可望下一步研究實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞癌靶向顯影。這些研究結(jié)果表明超聲造影與特異的靶向微泡結(jié)合，不僅能評(píng)價(jià)新生微血管，且可實(shí)現(xiàn)超聲對(duì)惡性腫瘤及轉(zhuǎn)移灶的早期診斷；并有利于超聲引導(dǎo)下活檢時(shí)對(duì)腫瘤組織生長(zhǎng)活躍區(qū)的準(zhǔn)確選擇。血管內(nèi)血栓成像原位血栓和血栓栓塞是許多心腦血管疾病的重要病因之一，而冠脈內(nèi)微血栓是早期心肌再灌注治療后“無(wú)復(fù)流”（）現(xiàn)象的最主要機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用靶向超聲造影技術(shù)，可使血管內(nèi)的血栓成像，能早期準(zhǔn)確和敏感地探測(cè)到心臟內(nèi)、頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈內(nèi)易損粥樣斑塊以及冠脈微循環(huán)內(nèi)的血栓。激活的血小板表面表達(dá)高密度的血小板膜糖蛋白受體，能促進(jìn)血小板的聚集和血栓形成。精氨酸甘氨酸天冬氨酸（）多肽序列是血小板膜糖蛋白受體特異性的識(shí)別、結(jié)合位點(diǎn)。與微泡結(jié)合成血栓特異性靶向微泡造影劑，有可能為血栓的診斷、治療提供一種無(wú)創(chuàng)、有效、價(jià)廉的新方法。（，）是一種血栓靶向的脂質(zhì)體微泡。它在脂質(zhì)微泡的表面連接了一個(gè)可被受體精氨酸甘氨酸天冬氨酸（）結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別的寡肽序列，在超聲作用下可提高對(duì)血栓的識(shí)別能力。顯微鏡觀察顯示靶向微泡粘附到人血栓上，體外超聲顯示血栓成像增強(qiáng)。等進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)能與血栓特異性結(jié)合，明顯提高了超聲對(duì)左房和靜脈內(nèi)微小血栓的顯示，而且在增強(qiáng)聲像圖上測(cè)得的血栓符合實(shí)際大小。碩士學(xué)位論文除了能探測(cè)心臟、動(dòng)脈及靜脈血栓外，血栓特異性靶向微泡在治療領(lǐng)域還有廣闊的臨床應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將高濃度微泡結(jié)合于血凝塊表面還有助于溶栓的可能，暴露于高能超聲后，血凝塊附近的微泡破裂能加速溶栓治療，而且能在無(wú)藥物溶栓治療時(shí)使血凝塊溶解。實(shí)驗(yàn)證明微泡在靠近血栓部位的破裂作用是輔助血栓溶解的治療機(jī)制【引。三前景與展望靶向超聲造影成像已成為影像學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，盡管其目前仍處于實(shí)驗(yàn)研究的起步階段，面臨諸多挑戰(zhàn)和技術(shù)難題，但其高特異性、高敏感性、相對(duì)無(wú)創(chuàng)性、靶向定位及早期定量評(píng)價(jià)等特殊優(yōu)勢(shì)是其他影像學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)檢測(cè)手段所不能比擬的。隨著生成微囊的高分子材料快速發(fā)展和微泡制備工藝的不斷完善，靶向超聲造影劑必將朝著更加個(gè)性化的方向發(fā)展。靶向超聲微泡不僅能應(yīng)用于不同生理和病理狀態(tài)下的超聲造影成像，有助于早期診斷疾?。欢铱衫冒邢虺曃⑴葑鳛閿y帶藥物或治療基因的載體，將可能為臨床治療領(lǐng)域帶來(lái)革命性的進(jìn)展。參考文獻(xiàn)【】，眠，：【】，：【】，：【】，綜述、航，：【】，塒，：【】，：，：【】，、析，：【】，（），：【】，：【】，謝廿（），：【】，：【】，憾，謝，（）：￥碩士學(xué)位論文【】卞愛(ài)娜，高云華，譚開(kāi)彬，等免疫脂質(zhì)體微泡造影劑的制備及體外靶向研究中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，（）：】，也（）：，：【】，：碩士學(xué)位論文致謝首先，感謝我的導(dǎo)師吳平生教授和賓建平教授，忘不了他們的淳淳教誨，忘不了他們的用心良苦：是他們的精心教導(dǎo)、倍加愛(ài)護(hù)使我克服了重重困難；是他們高尚的人格、淵博的知識(shí)、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度、敏銳迅捷的邏輯思維使我受益終身！三年來(lái)，在學(xué)習(xí)上他們悉心指導(dǎo)，耐心講解，不厭其煩；在工作上他們將豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)毫無(wú)保留的悉心傳授；在生活上他們處處為我著想，給予了無(wú)微不至的關(guān)懷。為了我的學(xué)業(yè)能圓滿完成，他們花費(fèi)了大量寶貴的時(shí)間和精力！從課題的設(shè)計(jì)、實(shí)施、總結(jié)到論文的撰寫(xiě)、修改都凝結(jié)了他們的大量心血。在這里我衷心感謝我的導(dǎo)師吳平生教授和賓建平教授！我將努力在以后的工作和學(xué)習(xí)中取得好的成績(jī)，以不辜負(fù)導(dǎo)師的教誨和期望。特別感謝南方醫(yī)院藥學(xué)部楊莉老師對(duì)我實(shí)驗(yàn)課題的悉心指導(dǎo)！衷心感謝劉伊麗教授、張遠(yuǎn)慧教授、黃錚副教授、修建成副主任醫(yī)師、馬立勤副主任醫(yī)師、鄭華主治醫(yī)師在臨床學(xué)習(xí)期間對(duì)我的傾心培養(yǎng)，你們精湛的醫(yī)術(shù)和高尚的醫(yī)德令我終身難忘。衷心感謝許頂立主任、賈滿盈副主任、吳賽珠副主任、侯玉清教授及全體專(zhuān)家教授給予的支持和幫助。衷心感謝心內(nèi)科超聲心動(dòng)圖室謝志斌主任、王鵬副主任技師、劉儉主管技師、楊京山技士給予的支持和幫助。衷心感謝藤中華護(hù)士長(zhǎng)、屠燕護(hù)士長(zhǎng)及全體護(hù)士在我臨床學(xué)習(xí)期間對(duì)我的悉心指導(dǎo)和熱心幫助！感謝學(xué)校、研究生學(xué)院及南方醫(yī)院各