標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室的介紹.doc

標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介 1、 主體結(jié)構(gòu)：主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽(yáng)角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問(wèn)題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡(jiǎn)明，美觀大方，密封性好。2、 標(biāo)準(zhǔn)的三區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：將PCR過(guò)程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和PCR擴(kuò)增檢測(cè)三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個(gè)區(qū)域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)， 同時(shí)各區(qū)通過(guò)氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_(kāi)緩沖區(qū)，緩沖區(qū)和 PCR 擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門(mén)上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過(guò)回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。3、 消毒：在三個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)和三個(gè)緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū) 還設(shè)置移動(dòng)紫外線燈，對(duì)實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。4、 機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗：試劑和標(biāo)本通過(guò)機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。5、 地面地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm800mm）接縫需要小于2mm。6、 照明燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室在建設(shè)的過(guò)程中應(yīng)注意：規(guī)范的安裝流程和全面的服務(wù)流程。嚴(yán)格按照規(guī)范科學(xué)設(shè)計(jì)的安裝流程。安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進(jìn)線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進(jìn)線位置，進(jìn)水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風(fēng)孔、進(jìn)水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸和通風(fēng)口尺寸。1.1.1 PCR 實(shí)驗(yàn)室基本要求2.1 PCR 實(shí)驗(yàn)室依據(jù)所使用的方法可分為試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析等三或四個(gè)區(qū)域。只是使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀、HIV病毒載量測(cè)定儀的PCR實(shí)驗(yàn)室，有上述前面三個(gè)區(qū)域即可。各區(qū)域應(yīng)完全獨(dú)立分隔，不應(yīng)有任何的空氣直通。2.2標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室 產(chǎn)物分析區(qū)或三個(gè)區(qū)域的最后一個(gè)區(qū)域（即擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)），空氣流向應(yīng)由室外向室內(nèi)，可通過(guò)在室內(nèi)設(shè)置通風(fēng)櫥、排風(fēng)扇或其他排風(fēng)系統(tǒng)達(dá)到空氣流由室外向室內(nèi)流動(dòng)的要求。2.3 PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域儀器設(shè)備配備通常如下：2.3.1標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室 試劑準(zhǔn)備區(qū):儀器設(shè)備主要應(yīng)有加樣器、冰箱、天平、低速離心機(jī)、混勻器、可移動(dòng)紫外燈等?？墒褂贸瑑艄ぷ髋_(tái)作為試劑配制操作臺(tái)面。2.3.2標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室 標(biāo)本制備區(qū)儀器設(shè)備主要應(yīng)有生物安全柜（最好為B2, 可避免提取核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本間交叉“污染”，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。此外還應(yīng)配備加樣器、臺(tái)式高速離心機(jī)（冷凍及常溫）、臺(tái)式低速離心機(jī)、恒溫設(shè)備（水浴和/或干浴儀）、冰箱、混勻器和可移動(dòng)紫外燈等。2.3.3標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室 擴(kuò)增區(qū)主要儀器就是核酸擴(kuò)增熱循環(huán)儀（PCR儀，實(shí)時(shí)熒光或普通的）。熱循環(huán)儀的電源應(yīng)專用，并配備一個(gè)穩(wěn)壓電源或UPS，以防止由于電壓的波動(dòng)對(duì)擴(kuò)增測(cè)定的影響。此外，根據(jù)工作需要，還可配備加樣器、超凈臺(tái)等。2.3.4標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室 產(chǎn)物分析區(qū)：本區(qū)所使用的儀器設(shè)備可能有加樣器、電泳儀（槽）、電轉(zhuǎn)印儀、雜交爐或雜交箱、水浴箱、DNA測(cè)序儀、酶標(biāo)儀和洗板機(jī)等。在理想情況下，PCR實(shí)驗(yàn)室試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備、擴(kuò)增三個(gè)區(qū)域可設(shè)置緩沖間。在緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。PCR實(shí)驗(yàn)室平面布置示意圖一般實(shí)驗(yàn)室間隔材料分:彩鋼板,不銹鋼板,理化板等,價(jià)格依次而上,主要考慮不產(chǎn)塵,不滋菌,容易清理就行一般實(shí)驗(yàn)室間隔材料分:彩鋼板,不銹鋼板,理化板等,價(jià)格依次而上,主要考慮不產(chǎn)塵,不滋菌,容易清理就行*衛(wèi)生部PCR研究員李金明(衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心臨床免疫室主任,研究員)的PCR建設(shè)方案再說(shuō)吧！國(guó)外的資料不一定是最好。個(gè)人覺(jué)得李金明的實(shí)驗(yàn)室區(qū)正壓（擴(kuò)增分析區(qū)因?yàn)闆](méi)有緩沖，所以為負(fù)壓），緩沖間負(fù)壓的作法可以更好的防止氣體的外泄及防止試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)四區(qū)之間的氣體相互滲漏。PCR實(shí)驗(yàn)室也可以分為三個(gè)區(qū)，即第三、四區(qū)合為一區(qū)，必須設(shè)立緩沖間。有條件建設(shè)實(shí)驗(yàn)室采用三十萬(wàn)級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)建設(shè)?？照{(diào)系統(tǒng)采用制冷劑各區(qū)獨(dú)立循環(huán)，可以防止氣流交叉。*疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室建設(shè)之PCR 實(shí)驗(yàn)室基本要求:PCR實(shí)驗(yàn)室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實(shí)驗(yàn)，通常應(yīng)經(jīng)過(guò)試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析四個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，若實(shí)驗(yàn)工藝需要，還應(yīng)增加樣品粉碎過(guò)程。一、分散形式PCR實(shí)驗(yàn)室 所謂分散形式PCR實(shí)驗(yàn)室，是指完成上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程的實(shí)驗(yàn)用房彼此相距較遠(yuǎn)，呈分散布置形式。對(duì)于這種布置形式的PCR實(shí)驗(yàn)室，由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)之間不易相互干擾，因此無(wú)需特殊條件要求。 二、組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室所謂組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室, 是指完成PCR四個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的實(shí)驗(yàn)用房相鄰布置，組成獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)域的形式。對(duì)于組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室，由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對(duì)總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣品。如果使用熒光PCR儀，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并。若房間進(jìn)深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。*PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)的設(shè)置，幾個(gè)要注意的問(wèn)題：1、幾個(gè)區(qū)域的大小設(shè)置情況，應(yīng)該是試劑準(zhǔn)備區(qū)、產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)，要小一些。標(biāo)本制備區(qū)應(yīng)大一些。因?yàn)?，?biāo)本制備室要放置一個(gè)生物安全柜為一個(gè)低溫冰箱。2、試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)就設(shè)立緊急洗眼器，以備不時(shí)之需。3、PCR實(shí)驗(yàn)室的潔凈度可以根據(jù)用戶的實(shí)際使用情況和資金的投入來(lái)設(shè)計(jì)。*臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)臨床檢驗(yàn)擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法，制定本標(biāo)準(zhǔn) 一、 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則 （一） 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則 1、 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) 2、 標(biāo)本制備區(qū) 3、 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū) 4、 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū) 如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。 （二）各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。 （三）進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 （四）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開(kāi)各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。 二、 工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn) （一） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) 1、2-8C和-15C冰箱 2、混勻器 3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 4、移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 6、專用工作服和工作鞋 7、專用辦公用品 （二） 標(biāo)本制備區(qū) 1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱 2、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 3、混允器 4、水浴箱或加熱模塊 5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 6、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 7、超凈工作臺(tái) 8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 9、專用工作服和工作鞋 10、專用辦公用品 如需處理大分子DNA，應(yīng)具有超聲波水浴儀。 （三） 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū) 1、 核酸擴(kuò)增儀 2、 微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 3、 可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 5、 專用工作服和工作鞋 6、 專用辦公用品 (四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū) 視檢驗(yàn)方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下： 1、 微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 2、 可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心） 4、 專用工作服和工作鞋 5、 專用辦公用品 為了對(duì)以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復(fù)檢測(cè),需要三個(gè)不同的區(qū)域,每一個(gè)區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細(xì)列出. 1、樣品準(zhǔn)備區(qū) 這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT(mén)用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采 取預(yù)防措施： 1）PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。 2）組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。 3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。 4）DNA樣品應(yīng)該用有專門(mén)的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。 5）大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。 6）管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)，這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。 7）任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門(mén)用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。 2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)。為了避免這一問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。 3、前PCR區(qū) 必須有專門(mén)用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門(mén)用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。 4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作 1）所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。 2）所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的新鮮蒸餾的去離子水，用0.22m過(guò)濾的，并且是高壓滅菌。 3）在20到25貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。 4）所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。 5）所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。 6）新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。 7）樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。 5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物 1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20或4，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。 2）如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。 3）作為一個(gè)規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。 4）陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。 5）當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。 6）由于必須有對(duì)照反應(yīng)，對(duì)照模板的