磷酸三(2氯乙基)酯降解菌的降解條件優(yōu)化研究.doc

磷酸三(2氯乙基)酯降解菌的降解條件優(yōu)化研究 馬明東，趙銀平，趙曉祥 （東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海xx20） 摘要：采用H1菌株降解有機(jī)磷系阻燃劑磷酸三（2氯乙基）酯（TCEP），通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對降解條件進(jìn)行優(yōu)化，得到TCEP的最佳生物降解條件：溫度為30、pH為70、培養(yǎng)時(shí)間為7d、TCEP初始濃度為20mg/L，此條件下TCEP的降解率達(dá)到最大，為8600。其中，溫度對TCEP降解的影響最大，其次是TCEP的初始濃度及pH，培養(yǎng)時(shí)間的影響最小。 關(guān)鍵詞：磷酸三（2氯乙基）酯（tcep）；h1菌株；降解條件；降解率 ：X172；X703：A：04398114（xx）061341-05 DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.06.016 OptimizingDegradationConditionsofTris（2chloroethyl）phosphate DegradingBacteria MAMingdong，ZHAOYinping，ZHAOXiaoxiang （CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering，DonghuaUniversity，Shanghaixx20，China） Abstract：StrainH1wasusedtodegradetris（2chloroethyl）phosphate（TCEP）whichbelongedtoorganophosphorusflameretardantsThedegradationconditionsofTCEPwereoptimizedwithsinglefactorexperimentandorthogonaltestTheresultsshowedthattheoptimaltemperature，pH，degradationtimeandinitialconcentrationofTCEP30，pH70，7dand20mg/L，respectivelyStrainH1degraded8600ofTCEPundertheseconditionsTemperaturegreatlyaffectedthedegradationrateofTCEP，followedbypH，theinitialconcentrationofTCEP，andthedegradationtime Keywords：tris（2chloroethyl）phosphate（TCEP）；H1strain；degradationconditions；degradationrate ：xx0314 基金項(xiàng)目：上海市基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（09JC1400600） 作者簡介：馬明東（1985），男，老撾萬象人，碩士，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)，（電話電子信箱）snouhotmail； 通信作者，趙曉祥，研究員，博士，（電話電子信箱）zxxdhuedu。 有機(jī)磷系阻燃劑中的磷酸酯類（Organophosphateesters，OPEs）具有良好的阻燃性能，與聚合物基材相容性好，耐水、耐熱以及耐遷移等特點(diǎn)，常作為電器、家具、紡織等材料中的添加型阻燃劑14。當(dāng)前，含OPEs的產(chǎn)品在生產(chǎn)、使用以及廢棄回收處理過程中，OPEs極易從這些產(chǎn)品中逃逸揮發(fā)并進(jìn)入周圍環(huán)境中，繼而擴(kuò)散分布在各種環(huán)境介質(zhì)中。目前，OPEs已是污水中的常見污染物，普遍認(rèn)為污水處理廠（WWTPs）出水是地表水OPEs的主要57。在沒有明顯污染源的農(nóng)業(yè)地區(qū)，地表水中的OPEs的污染主要源于覆蓋溫室大棚的塑料薄膜8，垃圾滲濾液中的OPEs是地下水甚至海水中OPEs的主要810。隨著溴系阻燃劑的禁用和限用，OPEs的產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。由于OPEs具有明顯的毒理效應(yīng)，環(huán)境中OPEs污染及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估已經(jīng)成為環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。磷酸三（2氯乙基）酯（TCEP）是最常用的一類磷酸酯，被廣泛應(yīng)用于塑料生產(chǎn)行業(yè)11。目前有機(jī)磷系阻燃劑的主要處理方法是物理化學(xué)方法，但該方法成本高，易帶來二次污染問題。生物降解是消除環(huán)境中有機(jī)磷系阻燃劑的一種經(jīng)濟(jì)有效且無二次污染的方法。本研究采用一株能夠以TCEP為唯一碳源的高效降解菌株H1進(jìn)行試驗(yàn)，并對其降解條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳降解效率，為TCEP的生物修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù)。 1材料與方法 11材料 111試劑TCEP（97，百靈威上海分公司），乙酸乙酯（AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。 TCEP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：以乙酸乙酯為溶劑將TCEP配制成濃度為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 112培養(yǎng)基無機(jī)鹽培養(yǎng)基：葡萄糖3g；（NH4）2SO41g，NaCl02g，MgSO47H2O02g，CaCl22H2O002g，F(xiàn)eCl2001g，MnSO4001g，H2O1000mL，pH70。 富集培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，H2O1000mL，pH70。 分離培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入2的瓊脂。 所有培養(yǎng)基均在121條件下高壓滅菌25min。 113人工生活污水葡萄糖06g，無水乙酸鈉08g，酵母提取物03g，NH4Cl0283g，K2HPO43H2O007g，KH2PO40022g，H2O1000mL。 114儀器氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS，78905975，美國安捷倫公司），紫外可見分光光度計(jì)（UV1800PC，上海美譜達(dá)儀器有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SPH2102C立式雙層搖床（上海世平儀器設(shè)備有限公司），DHG9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），VS8401潔凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），pH計(jì)（上海精科雷磁有限公司）。 12試驗(yàn)方法 121菌種的篩選試驗(yàn)菌種上海松東水環(huán)境凈化有限公司曝氣池中的污泥，該廠采用改良式序列間歇反應(yīng)器（MSBR）工藝，曝氣池污泥顏色為黃褐色，沉降性能好，呈絮狀結(jié)構(gòu)，pH約為70，其MLVSS/MLSS（混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度/混合液懸浮固體濃度）為040。 1）活性污泥的培養(yǎng)。將采集到的活性污泥不間斷曝氣3d，靜置后去除上清液，然后加入等量配制的人工生活污水，其化學(xué)需氧量（COD）約為600mg/L，按照序批式活性污泥法（SBR）工藝（進(jìn)水、曝氣、靜置、排水、閑置）進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)10d后，開始向人工生活污水加入適量TCEP，使污水中TCEP濃度為0.001mg/kg左右，培養(yǎng)1個(gè)月。 2）菌種的馴化。取培養(yǎng)后的活性污泥上清液1mL于100mL富集培養(yǎng)基中，30、160r/min條件下培養(yǎng)。待培養(yǎng)基變渾濁后，取1mL菌液于100mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中TCEP的濃度為10mg/L，使微生物以TCEP為惟一碳源在30、160r/min條件下生長。7d后，按1的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)液于新的TCEP無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在相同條件下梯度增加TCEP濃度，馴化培養(yǎng)兩個(gè)月，TCEP的最終濃度達(dá)到70mg/L。 3）菌種的分離純化。取馴化后的最后一個(gè)周期的菌液適當(dāng)稀釋后均勻涂布于無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基（TCEP濃度為70mg/L）平板上，于30恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)基上長出菌落后，觀察各菌落形態(tài)，并挑取形態(tài)清晰的單一菌落，于分離培養(yǎng)基上劃線分離，反復(fù)純化57次后編號(hào)標(biāo)記。 4）菌種的初篩。將分離得到的菌株分別接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基（TCEP濃度為70mg/L），于30、160r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基的渾濁程度（OD600的大?。﹣砼袛嗑昀肨CEP的情況。挑選生長相對較旺盛的菌株，分別編號(hào)標(biāo)記。 5）菌種的復(fù)篩。將初篩得到的菌株接種于富集培養(yǎng)基中，30、160r/min條件下?lián)u床擴(kuò)大培養(yǎng)后，取適量菌液于6000r/min離心10min，收集菌體并用生理鹽水洗滌菌體3次，最后以等體積的生理鹽水重懸，即得菌懸液。按2的接種量將菌懸液接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基（TCEP濃度為70mg/L）中，30、160r/min條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)。降解7d后采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）測定培養(yǎng)液中TCEP濃度，挑選出降解效果較好的菌株并編號(hào)標(biāo)記。 通過對活性污泥的培養(yǎng)、菌種的馴化、菌種的分離純化、菌種的初篩和復(fù)篩，最終得到7株以TCEP為惟一碳源的降解菌種H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7，并將各個(gè)菌種保存于50的甘油中備用。 122菌懸液的制備取1環(huán)保藏于甘油中的菌株直接在分離培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)2d，然后挑取單菌落于富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，最后按照121中的5）將一定量的新鮮菌液配制成菌懸液備用。 123TCEP降解條件優(yōu)化1）單因素試驗(yàn)。本試驗(yàn)選取不同的菌株、溫度、pH、時(shí)間及TCEP初始濃度這5個(gè)因素作為考察對象，分別研究各因素對TCEP降解效果的影響。各試驗(yàn)均以TCEP為惟一碳源進(jìn)行生物降解，其中試驗(yàn)分別接種H1菌株的菌懸液，試驗(yàn)中無機(jī)鹽培養(yǎng)基中TCEP濃度為40mg/L。菌株：以2的接種量將H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7菌株的菌懸液接種到裝有100mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中（后面錐形瓶試驗(yàn)接種方法一致），pH70、160r/min、30振蕩培養(yǎng)7d。溫度:分別在20、25、30、35、40、45溫度下，pH70、160r/min震蕩培養(yǎng)7d。pH：pH分別為50、60、65、70、75、80、90，160r/min、30振蕩培養(yǎng)7d。TCEP初始濃度：TCEP初始濃度分別為5、10、15、20、30、40、60mg/L的富集培養(yǎng)基，pH70、160r/min、30振蕩培養(yǎng)7d。時(shí)間：pH70、160r/min、30振蕩培養(yǎng)9d。分別測定試驗(yàn)中第七天時(shí)TCEP的降解率，在試驗(yàn)中分別測定1、2、3、4、5、6、7、8、9d時(shí)TCEP的降解率。每個(gè)單因素試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，重復(fù)2次。 2）正交試驗(yàn)。設(shè)置四因素三水平正交試驗(yàn)考察溫度、pH、TCEP初始濃度及時(shí)間對H1菌株降解TCEP的影響，因素水平表見表1所示。按照表1所示條件，各組試驗(yàn)均按2的接種量接種菌株H1菌懸液，160r/min、30搖床培養(yǎng)7d，測定殘余TCEP含量，并計(jì)算其降解率。 124樣品前處理取降解液10mL于分液漏斗中，依次用4、4、2mL乙酸乙酯萃取15min，合并3次萃取液。將萃取液過無水硫酸鈉小柱，然后經(jīng)022m孔徑的尼龍膜過濾，最后采用GCMS測定。 125TCEP濃度測定TCEP濃度采用GCMS法進(jìn)行測定，分析條件如下：氣相色譜條件。色譜柱：HP5（300m025mm025m）；升溫程序：初溫90，以10/min升至230，保持10min；載氣：高純氦氣，純度大于99999；恒流控制：10mL/min；模式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1L；進(jìn)樣口溫度：250。質(zhì)譜條件。離子源：EI，70eV，溫度230；四極桿溫度：150；接口溫度：270；溶劑延遲時(shí)間：5min；掃描質(zhì)量范圍：m/z35350amu；TCEP的特征峰：1173min；特征離子：249，如圖1所示。 2結(jié)果與分析 21TCEP標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確量取一定量的TCEP標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙酸乙酯配制成濃度為5、10、15、20、40、60、80mg/L的TCEP溶液。采用GCMS法分別測定各個(gè)濃度的TCEP溶液，將測得的各濃度溶液相對應(yīng)的峰面積（y）隨TCEP濃度（x）作圖，得到TCEP標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。從圖中可以看出，TCEP在580mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r09983。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y5106x1107。 22TCEP降解條件優(yōu)化結(jié)果 221不同菌株對TCEP降解效果的影響不同菌株對TCEP的降解效果如圖3所示，從圖中可以看出7種菌株對TCEP的降解效果各不相同，其中H1和H2菌株能夠高效降解TCEP，降解率均在78以上，H1菌株的降解率高達(dá)8025。這可能是由于TCEP對其他5種菌株具有一定的抑制作用，導(dǎo)致TCEP利用率的降低。因此，本研究選擇菌株H1作為試驗(yàn)的降解菌株。 222培養(yǎng)時(shí)間對TCEP降解效果的影響菌株H1對TCEP的降解效果隨時(shí)間的變化如圖4所示，從圖中可以看出1d時(shí)TCEP的降解率即達(dá)6414；24d時(shí)TCEP的降解率逐漸增大，4d時(shí)降解率高達(dá)8025；57d時(shí)TCEP的降解率緩慢增大，7d時(shí)降解率為8225；89d時(shí)TCEP基本不降解。因此，本研究選擇的TCEP降解時(shí)間為7d。 223溫度對TCEP降解效果的影響微生物對TCEP的降解是借助相關(guān)酶的催化作用來完成的，而酶的活性只有在一定的溫度范圍內(nèi)才能得以發(fā)揮12，因此溫度是影響TCEP降解的關(guān)鍵因素。由圖5可以看出，溫度對TCEP的降解有較大的影響，菌株H1在2045范圍內(nèi)均可對TCEP進(jìn)行降解。當(dāng)溫度為20時(shí)，TCEP的降解率為8235；隨著溫度的升高其降解率也隨之升高，在2530范圍內(nèi)，TCEP的降解速度加快，降解率均高于8317，30時(shí)的降解效率達(dá)到最大，為8392；而當(dāng)溫度超過30時(shí)，TCEP的降解效率反而減小，45時(shí)的降解效率最小，為7868。結(jié)果表明，溫度為30時(shí)菌株H1對TCEP有較高的降解率，溫度過高或過低均不利于微生物對TCEP的降解，特別是當(dāng)溫度高于30時(shí)，可能會(huì)引起部分胞外酶的失活，從而導(dǎo)致TCEP降解率的降低。 224培養(yǎng)基初始pH對TCEP降解效果的影響pH是影響微生物生長的一個(gè)重要環(huán)境因素，大多數(shù)異養(yǎng)菌和真菌喜好中性環(huán)境，因此pH過高或過低都會(huì)影響微生物的降解能力13。由圖6可以看出，pH為5090時(shí)，菌株H1對TCEP均有降解能力；pH為70時(shí)，TCEP的降解率達(dá)到最大，為8175；pH高于或低于70時(shí)，TCEP的降解率明顯下降。結(jié)果表明，H1菌株在中性環(huán)境時(shí)對TCEP的降解效果最好，而環(huán)境偏酸或偏堿時(shí)，TCEP的降解效果變差。 225初始濃度對TCEP降解效果的影響微生物對污染物的降解率依賴于其自身對污染物的吸收、代謝及污染物的轉(zhuǎn)化程度14。污染物的濃度能夠影響微生物的活性，濃度過高會(huì)抑制微生物的活性，濃度低則不利于污染物的有效降解，但不同化合物產(chǎn)生抑制作用的濃度各不相同，某些情況下高濃度污染物卻能夠促進(jìn)微生物的生長繁殖15。由圖7可以看出，H1菌株對TCEP的降解率隨著TCEP濃度的增加而下降，這可能是由于TCEP對菌株的活性有一定的抑制作用造成的。當(dāng)TCEP濃度較小時(shí)，其降解率較高；隨著TCEP濃度的增加，其降解率呈下降趨勢；當(dāng)TCEP濃度超過30mg/L時(shí)，菌株H1對TCEP的降解率低于8344。結(jié)果表明，TCEP的初始濃度應(yīng)控制在30mg/L以內(nèi)，此時(shí)有利于微生物對TCEP的降解。 23正交試驗(yàn)結(jié)果 首先分析因素A各水平對試驗(yàn)指標(biāo)的影響，A1的影響反映在試驗(yàn)1、2、3中，A2的影響反映在試驗(yàn)4、5、6中，A3的影響反映在試驗(yàn)7、8、9中。由表2可知，kA1、kA2、kA3值均不相等，說明因素A的水平變動(dòng)對試驗(yàn)結(jié)果有影響。在表2中kA2kA1kA3，所以A2為因素A的優(yōu)水平。對于因素B、C、D，從表2中可以確定B1、C3、D2分別為因素B、C、D的優(yōu)水平。四個(gè)因素的優(yōu)水平組合為A2B1C3D2，即培養(yǎng)溫度為30，TCEP初始濃度為20mg/L，時(shí)間為7d，pH為70。 根據(jù)極差R的大小，可以判斷各因素對試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次。R越大，表示因素的水平變化對試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，因素越重要。表2中RARDRBRC，因此各因素對試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序?yàn)锳、D、B、C，即溫度對TCEP的降解影響最大，其次是TCEP初始濃度和pH，時(shí)間的影響最小。 3結(jié)論 單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：培養(yǎng)溫度對TCEP的降解有較大影響，30時(shí)其降解率達(dá)到最大值8392；pH為70時(shí)，菌株H1對TCEP有較強(qiáng)的降解效果，而在偏酸或偏堿環(huán)境中，其降解效率均不及中性環(huán)境；培養(yǎng)降解7d時(shí)，TCEP的降解率達(dá)到最大值8225，故選擇的培養(yǎng)降解時(shí)間為7d；菌株H1對TCEP的降解率隨TCEP濃度的增加而下降，TCEP濃度超過30mg/L時(shí)TCEP的降解率低于8344，因此TCEP的初始濃度應(yīng)控制在30mg/L以內(nèi)。 對菌株H1的降解條件進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)表明：培養(yǎng)溫度為30，TCEP初始濃度為20mg/L，時(shí)間為7d，pH為70是TCEP降解的最佳條件，降解率最大為8600；其中溫度對TCEP降解率的影響最大，其次是TCEP初始濃度及pH，而時(shí)間的影響最小。 參考文獻(xiàn)： 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