PCR-SSP法基因定型解決臨床配血中血型問題.doc

PCR-SSP法基因定型解決臨床配血中血型問題趙志弘何路軍喬芳田亞娟王振雷張虹劉敬閃【摘要】目的利用ABO基因定型技術(shù)解決臨床疑難血型定型1例。方法運(yùn)用血型血清學(xué)方法、PCR-SSP(SequenceSpecificPrimer,SSP)基因定型法對比進(jìn)行1例正反定型不符標(biāo)本的檢測。結(jié)果血清學(xué)方法不能正確定型。PCR-SSP法基因定型結(jié)果是該患者為O1O1V基因型。結(jié)論血型基因定型技術(shù)較血型血清學(xué)方法更準(zhǔn)確、可靠，是血型血清學(xué)技術(shù)的極好補(bǔ)充?！娟P(guān)鍵詞】PCR-SSP；血型血清學(xué)；正反定型不符；ABO基因定型；冷凝集素近些年來，隨著城市人口的激增，血站不僅在采供血量上增長很快，而且在實(shí)際工作中出現(xiàn)了更多的正反定型不符合標(biāo)本，這些標(biāo)本有來自血站內(nèi)部檢驗(yàn)科的，也有來自醫(yī)院臨床的。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法由于其自身局限性，因此面臨很大挑戰(zhàn)。筆者在實(shí)際工作中運(yùn)用ABO基因定型方法解決了一些疑難血型定型的常見問題，現(xiàn)以1例臨床配血中出現(xiàn)的正反定型不符標(biāo)本的鑒定報(bào)告如下。1材料與方法1.1血型血清學(xué)試驗(yàn)按照文獻(xiàn)1操作?？?A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗球蛋白試劑、標(biāo)準(zhǔn)試劑ABO紅細(xì)胞、譜細(xì)胞均由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司制備。1.2血型基因定型PCR-SSP；血型血清學(xué)；正反定型不符；ABO基因定型；冷凝集素采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)技術(shù)。DNA提取嚴(yán)格按照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。引物為采用瑞典隆德Martin.L.Olsson研究小組24與筆者自行設(shè)計(jì)，內(nèi)對照為擴(kuò)增人類生長激素基因(HGH),均由上海生工合成。PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司9700。引物混合物檢測的基因特異性、突變位點(diǎn)和PCR產(chǎn)物片段大小見表1。引物序列見表2。1.2.1PCR反應(yīng)體系總反應(yīng)體系10l,引物濃度10pmol/l,dNTPs濃度10pmol/l,基因組DNA濃度50ng/l,15mMMgCl2(SIGMA公司),內(nèi)對照引物濃度5pmol/l,5U/lTaqDNA聚合酶(Promega,Shanghai)，甘油和甲酚紅終濃度分別為5%和0.01%(SIGMA公司)。表1基因分型引物檢測的基因特異性、突變位點(diǎn)和PCR產(chǎn)物片段大小1.2.2PCR循環(huán)參數(shù)采用熱啟動(dòng)DNA變性技術(shù)96預(yù)置7min,然后按9430s,6630s,721min進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，再72延伸2min。1.2.3電泳PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒別，電壓153V,時(shí)間15min，DNAMarkerDL2000為TRAASTM公司產(chǎn)品，凝膠成像儀拍照觀察結(jié)果(見圖1)。2結(jié)果患者,女,25歲，2011年2月患貧血入住省二院。醫(yī)院在配血中發(fā)現(xiàn)其血型正反定型不符,遂請求本中心配型科鑒定。血清學(xué)鑒定結(jié)果及基因定型結(jié)果分別見表3和圖1。表3患者血清學(xué)結(jié)果圖1表3顯示：該患者正定型為AB型，反定型為O型。存在正反定型不符合現(xiàn)象。圖1顯示：只有1、4泳道擴(kuò)增出了特異性條帶，1、4泳道分別為O1和O1V基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此該患者基因型為O1O1V。3討論患者血型血清學(xué)結(jié)果正反定型不符，正定型為AB型，反定型為O型。因反定型O細(xì)胞、自身細(xì)胞凝集，提示該獻(xiàn)血員血清中存在冷凝集素。37水浴后，正定型抗A、抗B、抗A1、抗AB和反定型O細(xì)胞、自身細(xì)胞凝集消失，證明該患者血清中存在冷凝集素抗體。至此，定型不符的原因找到?；蚨ㄐ蛨D譜顯示出了其O1O1V基因型：1、4泳道為O1和O1V基因，2、3泳道為A基因，3、5、6泳道為B基因?；颊邩颖局辉?、4泳道擴(kuò)增出了特異性條帶。綜上所述，此類標(biāo)本在血站或醫(yī)院血庫的日常工作中會(huì)經(jīng)常遇到，具有較典型的代表性。此套常規(guī)ABO基因定型方法，切合實(shí)際，在3h內(nèi)可完成從DNA抽提到基因擴(kuò)增的完成，效率較高，相對血型血清學(xué)方法，能在較短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確解決疑難血型標(biāo)本的定型問題。此PCR-SSP法較PCR-RFLP法3(限制性內(nèi)切酶法)具有省時(shí)、簡便的特點(diǎn)。雖然血清學(xué)凝集反應(yīng)是鑒定血型的基本方法，但是有其局限性，而以DNA為檢材的基因分型技術(shù)，不受血型抗體來源以及生物活性細(xì)胞的限制。采用高通量基因分型平臺(tái)可以檢測血型基因變異體。當(dāng)今，經(jīng)典免疫血液學(xué)和分子免疫血液學(xué)很自然地整合在一起，形成了“后基因組時(shí)代免疫血液學(xué)”。在整合的前提下，血清學(xué)方法和基因分型方法取長補(bǔ)短，相互補(bǔ)充，不存在誰取代誰的問題。從提高輸血安全性方面考慮，向臨床提供基因分型的血液制品，從供受者表型匹配逐步升級(jí)到基因型匹配，是今后的發(fā)展方向。血清學(xué)技術(shù)相對比較普及，當(dāng)前加強(qiáng)分子生物學(xué)教育顯得刻不容緩5?；蚨ㄐ图夹g(shù)作為血型血清學(xué)方法的極好補(bǔ)充，應(yīng)當(dāng)為廣大血型工作者所熟知和掌握。【參考文獻(xiàn)】1肖星甫輸血技術(shù)手冊成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1992：494-5142OlssonML,ChesterMA.FrequentoccurrenceofavariantO1alleleatthebloodgroupABOlocus.VoxSang，1996,70:26-303劉長利，龔曉燕，王卓妍，等北京地區(qū)漢族人群ABO血型基因分型研究中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2008，16(2):425-4284OkeefeDS,DobrovicA.ArapidandreliablePCR