RT┐PCR分析肉芽組織生長過程中VEGF及β3整合素mRNA的表達(dá).doc

RTPCR分析肉芽組織生長過程中VEGF及3整合素mRNA的表達(dá)作者：張聚良王嶺晉援朝黃慶生金衛(wèi)林【關(guān)鍵詞】逆轉(zhuǎn)錄-PCR關(guān)鍵詞:逆轉(zhuǎn)錄-PCR；新生血管化，病理性；內(nèi)皮生長因子；結(jié)合素類摘要:目的觀察血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）及3整合素mRNA在肉芽組織血管生成中表達(dá)的動態(tài)變化.方法采用RT-PCR法定量分析人正常皮下組織、增殖期肉芽組織（傷后712d）及成熟期肉芽組織（傷后3035d）VEGF及3整合素mRNA的水平.結(jié)果在正常皮下組織中，VEGF及3整合素mRNA呈低表達(dá)，而在增殖期肉芽組織中表達(dá)升高，待肉芽組織完全成熟后二者的表達(dá)又有所降低.結(jié)論VEGF及3整合素mRNA的水平與肉芽組織的血管生長過程呈動態(tài)相關(guān)，提示兩種蛋白質(zhì)可能在肉芽組織血管生成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用.Keywords:reversetranscriptionPCR；neovascularization，pathologic；endothelialgrowthfactors；integrinsAbstract:AIMToobservethedynamicchangesintheex-pressionofvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）andintegrin3mRNAduringtheangiogeneticprocessofgranula-tiontissue.METHODSVEGFandintegrin3mRNAinhumannormalsubcutaneoustissue，proliferativegranulationtissue（712dayspost-injured）andmaturegranulationtis-sue（3035dayspost-injured）werequantitativelyanalyzedwithRT-PCR.RESULTSInnormalsubcutaneoustissue，VEGFandintegrin3mRNAwereexpressedlowwhileinproliferativegranulationtissuetheywereup-regulated.Whengranulationtissuewasmaturecompletely，theexpres-sionofVEGFandintegrin3declinedagain.CONCLUSIONThelevelsofVEGFandintegrin3mRNAarerelatedtothegrowthofvesselsingranulationtissue，whichsuggeststhatthesetwoproteinsmayplayanimportantroleinregulat-ingtheangiogeneticprocessofgranulationtissue.0引言血管生成指在已有血管床基礎(chǔ)上長出新的毛細(xì)血管的過程，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活，細(xì)胞外基質(zhì)的降解，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、移行，管腔結(jié)構(gòu)形成及血管外膜的形成，然而迄今為止確切的機(jī)制尚不清楚.已有研究表明，許多病理過程如腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、糖尿病視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，都與血管生成密切相關(guān)1.生理狀態(tài)下，血管生成僅存在于胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合及女性生殖周期中，與病理性血管生成不同，這些過程中血管的生長受到嚴(yán)格調(diào)控，包括了增殖、成熟、退化三個階段，反映了血管生成的全過程.然而，對這些過程中血管生成的研究卻很少.生長因子和粘附分子作為血管生成的重要調(diào)節(jié)分子，越來越受到人們的重視，其中血管內(nèi)皮生長因子（vas-cularendothelialgrowthfactor，VEGF）和3整合素是近年研究的熱點.本實驗旨在觀察肉芽組織生長過程中VEGF及3整合素mRNA的表達(dá)，揭示它們與生理性血管生成的關(guān)系.1材料和方法1.1材料肉芽組織標(biāo)本均取自我院門診換藥室患者，4例為皮膚撕脫傷，1例為狗咬傷，患者年齡2030歲，排除糖尿病等影響傷口愈合的疾患，分別于傷后712d和3035d取創(chuàng)面組織.正常皮下組織取自我院手術(shù)患者.1.2試劑及儀器異硫氰酸胍、Sarcosyl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTP，RNAsin分別購自原平生物公司和Promga公司；DNATHERMALCYCLER480，美國PE公司；GDS凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司.1.3RTPCR1.3.1引物設(shè)計按文獻(xiàn)報道2，3，VEGF上游引物序列:5-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3，下游引物序列:5-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3，PCR產(chǎn)物為567bp，495bp和363bp，3整合素上游引物序列:5-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3，下游引物序列:5-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3，PCR產(chǎn)物為285bp.1.3.2總RNA提取及定量所取組織用Chom-czynski改良一步法提取總RNA，通過測定A260值計算RNA濃度，A260/A280判定純度.1.3.3RT-PCR反應(yīng)各組織總RNA均取1g（10L），加25mol・；L-1逆轉(zhuǎn)錄引物（下游引物）1L，7010min后立刻冰浴，加入下列成分:DW5L，5xRT緩沖液5L，10mmol・；L-1dNTP各1L，RNasin0.5L（25U），AMV1L（5U），42逆轉(zhuǎn)錄1h，945min，冰浴5min.各取RT產(chǎn)物10L，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同于常規(guī)PCR，循環(huán)溫度為:941min，551min，722min，循環(huán)數(shù)分別采用15，20，25和30，根據(jù)結(jié)果選擇合適循環(huán)數(shù)，避免PCR反應(yīng)平臺期，最終確定為25個循環(huán)，0.2g・；L-1瓊脂糖凝膠觀察結(jié)果.1.3.4熒光分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在UVP凝膠成像系統(tǒng)上攝像，并用相應(yīng)軟件通過對條帶大小及深淺的差別分別對不同組織RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，結(jié)果采用完全隨機(jī)化設(shè)計資料均數(shù)的t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析.2結(jié)果VEGF有多種不同的mRNA拼接產(chǎn)物，本實驗選用引物可擴(kuò)增出VEGF121（363bp），VEGF165（495bp）和VEGF189（567bp）3種形式.電泳結(jié)果表明，VEGF可見3條擴(kuò)增帶，大小同預(yù)期設(shè)計一致（Fig1）3整合素PCR產(chǎn)物為265bp，電泳顯示300bp附近可見明顯擴(kuò)增帶，與預(yù)期一致（Fig2）由電泳結(jié)果可以看出，正常皮下組織中VEGF及3整合素mR-NA水平極低，在增殖期肉芽組織中表達(dá)明顯升高，在成熟期肉芽組織中表達(dá)又降低，而且，在VEGF的3種不同拼接產(chǎn)物中，VEGF165表達(dá)最高.圖像分析定量的結(jié)果表明，在增殖期肉芽組織中，VEGF及3整合素mRNA水平高于成熟期肉芽組織（P<；0.05）及正常皮下組織（P<；0.01，Tab1）.圖1圖2略3討論VEGF是近年發(fā)現(xiàn)的可以特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的生長因子.體外實驗證明VEGF可以直接促進(jìn)EC的增殖，還可以通過提高已有血管的通透性，使血漿蛋白滲入基質(zhì)，利于EC的移行，間接促進(jìn)血管生成4.3整合素屬粘附分子家族成員，可與IIb或V亞基結(jié)合，其中V3分子在血管生成中的作用備受關(guān)注，表達(dá)于細(xì)胞膜表面，識別細(xì)胞外基質(zhì)的RGD序列，對于EC的移行有重要意義5.本實驗表明，正常皮下組織中沒有血管生成的存在，VEGF及3整合素mRNA的表達(dá)很低；在肉芽組織增殖期，HE切片證明EC在局部聚集成團(tuán)，胞質(zhì)增多，增殖明顯，增殖的EC借助與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合移行形成大量新生血管芽，此時VEGF及3整合素水平明顯增高，待肉芽組織完全成熟后，新生血管逐漸成熟退化，二者的表達(dá)也隨之下降，表明VEGF及3整合素可能是血管生成重要的始動分子，對于維持血管生成也有重要作用；同時也提示它們可以作為臨床血管生成治療的“靶分子”.VEGF及3整合素受控表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，缺氧及某些炎癥因子可能參與其中的調(diào)節(jié)6，7.表1不同組織中VEGF及3整合素mRNA表達(dá)水平的定量分析結(jié)果略RT-PCR適于用Northernblot檢測不到的低豐度RNA.實驗證明，同一循環(huán)體系下，模板量在一定濃度范圍內(nèi)時，PCR產(chǎn)物條帶強(qiáng)度與模板量成比例關(guān)系；當(dāng)循環(huán)次數(shù)處于PCR擴(kuò)增的對數(shù)增長期時，PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度同模板量亦成比例關(guān)系8，因此用RT-PCR定量分析mRNA的關(guān)鍵是嚴(yán)格優(yōu)化實驗條件，如模板量及循環(huán)次數(shù)的控制等，本實驗重復(fù)幾次結(jié)果一致.參考文獻(xiàn):1FolkmanJ.Angiogenesisincancer，vascular，rheumatoidandotherdiseaseJ.NatureMed，1995；1（1）:27-37.2TischerE，MitchellR，HartmanT，SilvaM，GospodarowiczD，F(xiàn)iddesJC，AbrahamJA.Thehumangeneforvascularendothe-lialgrowthfactor.MultipleproteinformsareencodedthroughalternativeexonsplicingJ.JBiolChem，1991；266（18）:11947-11954.3FigzgeraldLA，SleinerB，RallSC，LoSS，PhillipsDR.ProteinsequenceofendothelialglycoproteinderivedfromacDNAclone:Identifywithplateletglycoproteinandsimilarityto“inte-grin”J.JBiolChem，1987；262（9）:3936-3939.4AuerbachR，AuerbachW，PolakowskiI.Assaysforangiogene-sis:AreviewreviewJ.PharmacolTher，1991；51（1）:1-11.5AugustinHG，BraunK，TelemenakisI，ModlichU，KuhnW.Ovarianangiogenesis:Phenotypiccharacterizationofendothelialcellsinaphysiologicalmodelofbloodvesselgrowthandregres-sionJ.AmJPathol，1995；147（2）:339-351.6DvorakHF，BrownLF，DetmarM，DvorakAM.Vascularper-meabilityfactor/vascularendothelialgrowthfactor，microvas-cularhyperpermeability，andangiognesisrevie