白色念珠菌細(xì)胞壁β-葡聚糖升白細(xì)胞藥效學(xué)作用的研究.doc

白色念珠菌細(xì)胞壁-葡聚糖升白細(xì)胞藥效學(xué)作用的研究【摘要】目的研究白色念珠菌（CandidaAlbicans）細(xì)胞壁不同溶解性的-葡聚糖（-glucan）對(duì)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致小鼠外周血白細(xì)胞減少的回升作用。方法采用CTX所致的小鼠外周血白細(xì)胞減少模型，研究白色念珠菌細(xì)胞壁-葡聚糖對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響。結(jié)果三種溶解性的白色念珠菌細(xì)胞壁-葡聚糖均能升高小鼠外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)。各組小鼠脾臟指數(shù)增加，脾臟、骨髓巨核細(xì)胞系增生。不溶性的-葡聚糖作用更明顯。結(jié)論白色念珠菌-葡聚糖尤其是不溶性-葡聚糖對(duì)CTX所致的白細(xì)胞減少有回升作用，是一種很有前途的免疫調(diào)節(jié)劑?！娟P(guān)鍵詞】白色念珠菌；-葡聚糖；生物學(xué)活性；提取分析；免疫藥理作用【Abstract】ObjectiveTostudythepharmacologicaleffectofthebasic-glucan，acidic-glucanandinsoluble-glucanextractsofCandidaalbicansontheleukocytopoiesis-promotingintheleukopeniamice.MethodsMiceofeachgroupexcepttheuntreatedcontrolgroupwereadministeredcyclophosphamideintraperitoneally100mg/(kgd)forthreedaystodevelopleucopenia.TheexperimentalgroupwereadministeredthreekindsofCandidaalbicans-glucanintravenouslyforsixdaysseparately.TheperipherialleukocytesofallmicewerecountedbeforetreatedCTX，and1，3，5，7daysaftertreatedCTX.ResultsThreekindsofCandidaalbicans-glucancanincreasethenumbersofleukocytes，neutrophilicgranulocytesandmonocytesintheperipheralblood.Thespleenindexineachgroupanimalareincreased，andmegakaryocytesareincreasedinspleenandmarrow.ConclusionCandidaalbicans-glucanspeciallyinsoluble-glucansisakindofimmunomodulatorwhichcanincreasethenumbersofleukocytesintheperipheralblood.【Keywords】-glucan；Candidaalbicans；leukocyte；immunomodulator-葡聚糖（-glucan）是白色念珠菌細(xì)胞壁中含量最高的多糖。作為一類(lèi)條件致病真菌多糖，白色念珠菌-葡聚糖有著多種生物學(xué)活性和免疫藥理學(xué)作用，在抗炎、抗腫瘤、刺激造血等方面都有很高的藥效學(xué)作用1，但有關(guān)不同性質(zhì)的白色念珠菌-葡聚糖升白細(xì)胞作用的研究甚少。本研究制備三種溶解性的-葡聚糖，觀察其對(duì)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致的小鼠外周血白細(xì)胞減少的回升作用，為進(jìn)一步確證白色念珠菌-葡聚糖刺激造血系統(tǒng)使白細(xì)胞升高的作用機(jī)制，和進(jìn)一步研究白色念珠菌-葡聚糖有效成分或有效因子，為確立藥物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和量效關(guān)系提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1動(dòng)物與試劑昆明種小白鼠，46周齡，體重202g，昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科（云南省實(shí)驗(yàn)質(zhì)量合格證0000481號(hào)）。沙氏液體培養(yǎng)基（Sabouraudsdextroseagar）：蛋白胨10g、葡萄糖40g、溶于1000ml蒸餾水，高壓滅菌后備用；淀粉酶：分子量9600，酶活力：50/mg（上海伯奧生物科技有限公司）；白色念珠菌堿溶性-葡聚糖（Candidaalbicansbasic-glucan，CABBG）、酸溶性-葡聚糖（Candidaalbicansacidic-glucan，CAABG)和不溶性-葡聚糖（Candidaalbicansinsoluble-glucan，CAIBG）：均按文獻(xiàn)方法制備2。1.2儀器LRH-250Z型震蕩培養(yǎng)箱（廣東醫(yī)療器械廠(chǎng)）；81-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器廠(chǎng)）。1.3白念珠菌的培養(yǎng)和三種白色念珠菌-葡聚糖的制備取少量保存于密封無(wú)菌容器中的純白色念珠菌菌落，接種于沙氏液體培養(yǎng)基，接種后37恒溫?fù)u床160次/min震蕩培養(yǎng)67天，3000rpm離心30min，收集菌體，冷凍保存。提取葡聚糖的流程，見(jiàn)圖1。1.4小鼠白細(xì)胞減少模型的建立除空白對(duì)照組外，各組小鼠腹腔注射CTX100mg/(kgd)，連續(xù)3天，建立小鼠外周血白細(xì)胞減少模型。1.5確定三組-葡聚糖的給藥劑量參照急性毒性實(shí)驗(yàn)摸索LD50值，各組給藥劑量最后如表1。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理急性毒性學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Bliss法計(jì)算LD50值。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，所有指標(biāo)均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，組間比較采用方差分析，以P0.05為差異有顯著性。圖1從白色念珠菌提取CABBG、CAABG、CAIBG的流程示意圖Table1Dosedesignofexperiment2結(jié)果2.1急性毒性學(xué)實(shí)驗(yàn)通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)得到LD50值分別為：CABBG36.8937mg/kg，CAABG89.23549mg/kg，CAIBG767.7753mg/kg；95%可信區(qū)間分別為CABBG組32.005242.5289mg/kg，CAABG組76.7182103.8025mg/kg，CAIBG組663.748888.106mg/kg。各實(shí)驗(yàn)組小鼠肉眼觀察，除肝臟增大外未見(jiàn)明顯變化，病理HE切片顯示肝細(xì)胞有不同程度的腫脹和空泡變。2.2外周血白細(xì)胞變化實(shí)驗(yàn)第5、7、9天CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)均顯著增高，其中第7天、第9天，CAIBG組白細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)較陽(yáng)性對(duì)照組rhG-CSF升高，差異有顯著性。Table2Numbersofleukocyteofperipheralbloodineachgroupanimal(xs)注：Note：*P0.05，comparedwiththenormalcontrol；*P0.05，comparedwiththepositivecontrolTable3Numbersofneutrophilicgranulocyteofperipheralbloodineachgroupanimal(xs)注：Note：*P0.05，comparedwiththenormalcontrol；*P0.05，comparedwiththepositivecontrolTable4Numbersofmonocyteofperipheralbloodineachgroupanimal(xs)注：Note：*P0.05，comparedwiththepositivecontrol2.3脾臟、胸腺指數(shù)變化實(shí)驗(yàn)第5、7、9天，各組小鼠胸腺指數(shù)比較，差異無(wú)顯著性(P0.05)。各組小鼠給藥后，脾臟指數(shù)均增加。Table5Theeffectof-glucanonthespleenindexineachgroupanimal(xs)注：Note：*P0.05，comparedwiththepositivecontrol2.4藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)病理組織學(xué)改變脾臟：白髓、紅髓分界不甚清楚，紅髓內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多，與空白對(duì)照組比較，CABBG、CAABG、CAIBG組脾竇出現(xiàn)較多的巨核細(xì)胞；骨髓：實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓細(xì)胞增生活躍，與空白對(duì)照組比較，CABBG、CAABG、CAIBG組的巨核細(xì)胞數(shù)增多，提示巨核細(xì)胞系增生活躍。3討論多能造血干細(xì)胞具有多向分化的潛能，成年小鼠體內(nèi)的多能造血干細(xì)胞主要分布在脾臟和骨髓3。本研究顯示，實(shí)驗(yàn)第7天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)都較rhG-CSF高(P0.05)；實(shí)驗(yàn)第7天、第9天，CAIBG升高外周血白細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)明顯高于CABBG、CAABG和rhG-CSF(P0.05)，說(shuō)明-葡聚糖，尤其是CAIBG可刺激血液系統(tǒng)白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)不同程度的升高。實(shí)驗(yàn)第7天，CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠脾臟指數(shù)均與rhG-CSF差異有顯著性(P0.05)；第9天，CAIBG脾臟指數(shù)較rhG-CSF、CABBG、CAABG組高，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明差異均具有顯著性(P0.05)。與成年小鼠體內(nèi)造血干細(xì)胞的分布一致，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠的組織病理學(xué)改變主要體現(xiàn)在骨髓和脾臟。與空白對(duì)照組比較，三組小鼠脾臟、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)增多，CAIBG組要更明顯。因此，綜合外周血細(xì)胞數(shù)、脾臟指數(shù)、組織改變，我們推測(cè)-葡聚糖在刺激小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)升高的過(guò)程中可能與刺激CFU-S增殖，向粒系、巨核系組細(xì)胞分化，進(jìn)而生成粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。造血器官中基質(zhì)細(xì)胞是造血微環(huán)境中重要的成分，與造血有關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞涉及到巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和載脂肪細(xì)胞。其中，巨噬細(xì)胞被證明是在造血發(fā)生過(guò)程中有重要作用的一個(gè)微環(huán)境因素。巨噬細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞相互作用和分泌CSF、Epo、BPA、PGE和IL-1因子，調(diào)節(jié)所有四系血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化4。以往研究證實(shí)念珠菌多糖可刺激巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子（CK）如IL-6、IL-8、IL-1、TNF等5，6。這些細(xì)胞因子可調(diào)控造血細(xì)胞的增殖活動(dòng)：IL-1、TNF可刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）及粒-巨噬系集落刺激因子（GM-CSF），G-CSF和GM-CSF是使粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的母細(xì)胞增殖分化的特異性誘導(dǎo)劑，并能刺激骨髓向外周血液釋放成熟的中性粒細(xì)胞，縮短中性粒細(xì)胞的成熟期7。同時(shí)，CSF可作用于粒-單系祖細(xì)胞（CFU-GM），誘導(dǎo)其增殖分化。IL-1還能激活干細(xì)胞從G0期進(jìn)入增殖周期，擴(kuò)大干細(xì)胞池；可為早期干細(xì)胞對(duì)CSF起反應(yīng)做準(zhǔn)備，并誘導(dǎo)輔助細(xì)胞產(chǎn)生CSF及其他CK，從而間接調(diào)節(jié)造血。-葡聚糖是念珠菌重要的抗原決定簇8，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上都存在-葡聚糖的特異性受體9。白色念珠菌的三種溶解性的-葡聚糖，在結(jié)構(gòu)上都是符合單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上-葡聚糖受體對(duì)于配體的要求，即能被特異識(shí)別-（13）和-（16）糖苷鍵10。巨噬細(xì)胞作為一類(lèi)抗原遞呈細(xì)胞（APC）攝取-葡聚糖抗原，隨后誘導(dǎo)性的表達(dá)高水平MHC，MHC與Th細(xì)胞上的TCR和CD4相互作用。使Th細(xì)胞功能增強(qiáng)，IL-2分泌增多，IL-2又能保持T細(xì)胞的存活與增殖Th細(xì)胞被激活后刺激B細(xì)胞分化、增殖11。實(shí)驗(yàn)中，小鼠脾臟指數(shù)的明顯增加、脾臟、骨髓細(xì)胞增生，說(shuō)明了-葡聚糖在升高外周血白細(xì)胞的同時(shí)，也對(duì)激活機(jī)體的整個(gè)免疫系統(tǒng)活性產(chǎn)生影響。因此，CAABG、CABBG、CAIBG升高小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的作用可能與各組-葡聚糖能不同程度的被單核、巨噬細(xì)胞識(shí)別從而產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，刺激造血系統(tǒng)和促進(jìn)中性粒細(xì)胞增殖有關(guān)。免疫調(diào)節(jié)劑作為一種免疫治療的藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。多糖作為一類(lèi)免疫調(diào)節(jié)劑，不僅毒副作用小，資源豐富，而且具有明顯的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用。本研究說(shuō)明白色念珠菌-葡聚糖尤其是不溶性的-葡聚糖能顯著增加小鼠脾重，并能對(duì)抗由CTX所致的小鼠脾臟萎縮及白細(xì)胞水平降低，是一種較好的免疫增強(qiáng)物質(zhì)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1KoukiIshitani.AntitumoractivityofpolygalactosamineisolatedfromPaecilomycessp.I-1strain.JPharmacobioDyn，1988，11：58.2GopalPK，SullivanPA，ShepHerdMG.Analysisofwallglucansfromyeast，hypHalandgerm-tubeformingcellsofCandidaalbicans.JGenMicrobiol，1984，130：3295-310.3祝彼得.造血干細(xì)胞研究進(jìn)展.重慶醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1985，10：295.4徐豐彥，張鏡如.人體生理學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1989，952-970.5LIMin，CHENYun，SHAOFeng，etal.IsolationandPurificationoftheAlkali-solubleglucanfromCellWallofCandidaalbicans.ChinJDermatol，2000，33(5)：311-313.6MannersDJ，MassonAJ，PattersonJC，etal.