白細胞介素18、血管內皮生長因子-C及其受體3在大腸癌中的表達和在淋巴結轉移中的意義.doc

白細胞介素18、血管內皮生長因子-C及其受體3在大腸癌中的表達和在淋巴結轉移中的意義作者：陳昊白玲張昶劉毅孟健【摘要】目的探討白細胞介素18（IL-18）、血管內皮生長因子-C（VEGF-C）及其受體3（VEGFR-3）在大腸癌中的表達意義及與淋巴結轉移的關系。方法應用免疫組化MaxVision快捷二步法檢測30例大腸癌組織中IL-18、VEGF-C、VEGFR-3表達情況，并以10例正常黏膜和10例淋巴結轉移性大腸癌組織標本做對照。結果IL-18、VEGF-C、VEGFR-3在大腸癌組織中的表達均明顯高于正常黏膜（P0.05）；IL-18及VEGF-C在淋巴結轉移性大腸癌組織中的表達也高于正常黏膜，且IL-18與VEGF-C的表達呈正相關（P0.05）；VEGF-C在淋巴結有轉移組的表達明顯高于淋巴結無轉移組（P0.05）。結論大腸癌細胞可表達IL-18、VEGF-C、VEGFR-3，其表達與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關；VEGF-C表達與大腸癌淋巴結轉移顯著相關，可作為判斷患者淋巴結轉移的重要指標。【關鍵詞】大腸癌；血管內皮生長因子-C；血管內皮生長因子受體3；白細胞介素18；淋巴結轉移性大腸癌Abstract：ObjectiveToinvestigatetheexpressionsofIL-18,VEGF-CandVEGFR-3inhumancolorectalcancerandtheirsignificanceinlymphaticmetastasis.MethodsImmunohistochemicalMaxVisionmethodwasusedtodetecttheexpressionofIL-18,VEGF-CandVEGFR-3in30specimensofcolorectalcancinoma,10normalmucosaand10lymphnodewithmetastaticcancer.ResultsTheexpressionsofIL-18,VEGF-CandVEGFR-3incolorectalcarcinomaweresignificantlyhigherthanthatinnormalmucosa(P<；0.05).IL-18andVEGF-Cwerehigherinmetastaticlymphnodesthaninnormalmucosa,withthetwoexpressionspositivelycorrelated(P0.05).TheexpressionofVEGF-Cwashigherinthelymphnodewithmetastaticcancerthaninthatwithout(P0.05).ConclusionColorectalcarcinomacellscanexpressIL-18,VEGF-CanditsreceptorVEGFR-3,theirhigherexpressionsarecorrelatedwiththecarcinogenesisanddevelopmentofcolorectalcarcinoma.ThehigherexpressionofVEGF-Ciscloselycorrelatedwithlymphaticinvolvement,andthuscouldbeusedasanimportantpredictivemarkerforlymphaticmetastasis.Keywords:colorectalneoplasm；interleukin18；vascularendothelialgrowthfactor-C；vascularendothelialgrowthfactorreceptor3；lymphnode；metastasis淋巴道轉移是大腸癌進展的重要因素。淋巴管生成（lymphangiogenesis）作為淋巴道轉移的分子機制，近年來越來越受到重視。新近研究表明，血管內皮生長因子-C（vascularendothelialgrowthfactor-C,VEGF-C）可通過VEGF-C/VEGFR-3(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-3)信號通路1介導淋巴管內皮細胞增殖，調節(jié)淋巴管內皮細胞分化和淋巴管增生促進腫瘤淋巴道轉移，被稱為淋巴管生成因子；白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)是新近發(fā)現(xiàn)主要由巨噬細胞和樹突狀細胞分泌的細胞因子，可通過不同的信號轉導途徑起效，具有抗感染、抗腫瘤、介導炎癥反應、誘導靶細胞凋亡等多種生物學活性2。IL-18對淋巴管生成的作用，尚未見報道。我們采用免疫組化MaxVision快捷二步法檢測大腸癌組織中IL-18、VEGF-C（VEGFAb-3）和VEGFR-3(fms-liketyrosinekinase-4,Flt-4)的表達變化規(guī)律，并以正常大腸黏膜和淋巴結轉移大腸癌組織對照，探討其表達意義及與淋巴道轉移之間的關系，旨在為大腸癌的分子靶向治療提供科學依據(jù)。1材料和方法1.1材料111研究對象選取我院外科2003年2007年間手術切除大腸癌組織標本30例，術前未經過任何放射或化學治療?；颊吣挲g3081歲，平均（59.2314.77）歲，男23例、女7例。另選正常大腸黏膜10例和10例轉移性大腸癌淋巴結組織為對照。112試劑兔抗人IL-18濃縮型抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，VEGFAb-3及Flt-4為LabVision-NeoMarkers公司產品，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。1.2方法121免疫組化MaxVision檢測方法5m石蠟切片脫蠟和水化后；用PBS（pH7.4）沖洗3次；高壓鍋熱修復；每張切片加3%的過氧化氫1滴，室溫孵育10min；用PBS沖洗3次；每張切片分別加1滴抗體稀釋度為1100的IL-18、VEGFAb-3或Flt-4；4過夜；用PBS沖洗3次；每張切片加1滴即用型MaxVision試劑，室溫孵育1015min；用PBS（pH7.4）沖洗3次；每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察控制顯色時間；終止顯色后，自來水沖洗，蘇木精復染；自來水沖洗返藍，經梯度乙醇脫水干燥；二甲苯透明，中性樹膠封固。PBS代替一抗做陰性對照。122結果判定標準顯微鏡下觀察細胞，在胞質出現(xiàn)定位明確、染色明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞。按陽性細胞比例，組織蛋白表達強度分為以下幾級：無細胞著色為（-）；陽性細胞數(shù)25%為（+）；陽性細胞數(shù)在25%50%為（+）；陽性細胞數(shù)50%為（+）。組織染色（+）（+）者定為高表達組，（+）者定為低表達組,（-）為陰性。13統(tǒng)計學處理使用SPSS10.0軟件統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的比較采用2檢驗之Fisher確切概率法；相關性用Pearson相關分析；P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2結果21IL-18、VEGF-C、VEGFR3的表達情況211IL-18表達情況IL-18陽性顆粒主要定位于細胞質（圖1），正常大腸黏膜組織的陽性表達率為40%（4/10），4例均為低表達，占100%；大腸癌組織中的陽性表達率為96.67%（29/30），低表達占30%，高表達占70%；淋巴結轉移性大腸癌組織中的陽性率為100%（10/10），低表達占40%，高表達占60%。IL-18在大腸癌組織及淋巴結轉移性大腸癌組織中的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（2=0.333,P=1.000），并以高表達為主；但均高于正常黏膜，且有統(tǒng)計學意義（2=16.264,P=0.000；2=8.143,P=0.011）。圖1IL-18在大腸癌組織的陽性表達（免疫組化，200）212VEGF-C表達情況VEGF-C陽性顆粒主要定位于細胞質（圖2）。正常大腸黏膜組織的陽性表達率為30%（3/10），3例均為低表達，占100%；大腸癌組織中的陽性表達率為80%（24/30），低表達組占40%，高表達占60%；淋巴結轉移性大腸癌組織中的陽性率為100%（10/10），均為低表達。VEGF-C在大腸癌組織及淋巴結轉移性大腸癌組織中的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（2=2.294,P=0.307），在大腸癌組以高表達為主，在后者全部低表達；但兩者均高于正常黏膜，且有統(tǒng)計學意義（2=8.333,P=0.006；2=10.231,P=0.003）。213VEGFR-3的表達情況VEGFR-3陽性顆粒定位于細胞質（圖3）。正常大腸黏膜組織的陽性表達率為30%（3/10），3例均為低表達，占100%；大腸癌組織中的陽性表達率為96.67%（29/30），低表達占10%，高表達占90%；淋巴結轉移性大腸癌組織中的陽性率為60%（6/10），低表達占100%。VEGFR-3在大腸癌組織中的陽性表達率高于淋巴結轉移性大腸癌組織和正常黏膜，且有統(tǒng)計學意義（2=8.989，P=0.010；2=20.312，P=0.000）；淋巴結轉移性大腸癌組織中的陽性表達率與正常黏膜差異無統(tǒng)計學意義（2=1.727，P=0.370）。圖2VEGF-C在大腸癌組織的陽性表達（免疫組化，200）圖3VEGFR-3在大腸癌組織的陽性表達（免疫組化，200）22IL-18、VEGF-C及VEGFR3在大腸癌組織表達與臨床病理特征的關系鑒于在大腸正常黏膜組織中觀察到三者均有（+）的低表達，將與臨床病理特征的關系用高表達組和低表達組進行統(tǒng)計分析，詳見表1。三者表達強度與性別、年齡、組織分化、組織類型、組織分期均無關（P0.05）。IL-18、VEGFR3在淋巴結轉移組的表達強度雖高于無轉移組，但無統(tǒng)計學意義（P0.05）。VEGF-C在淋巴結轉移組的表達明顯高于淋巴結無轉移組，且有統(tǒng)計學意義（2=5.438，P=0.024）。23大腸癌組織中IL-18、VEGF-C及VEGFR-3三者之間表達的相互關系在21例IL-18高表達組織中VEGF-C高表達16例、低表達5例；9例IL-18低表達組織中其高表達2例，低表達7例；兩者表達呈明顯正相關（r=0.505，P=0.004）。在18例VEGF-C高表達組織中VEGFR-3高表達16例，低表達2例；12例VEGF-C低表達組織中其高表達11例，低表達1例；兩者表達無明顯相關（r=0.045，P=0.812）。在27例VEGFR3高表達組織中IL-18高表達19例、低表達8例；3例VEGFR-3低表達組織中其高表達2例，低表達1例；兩者表達無明顯相關（r=0.024，P=0.899）。表1大腸癌組織IL-18、VEGF-C和VEGFR-3表達與臨床病理特征的關系（略）注：2值為(-)和(+)與(+)比較,*P<；0.053討論腫瘤轉移通常是人類癌癥致死的主要原因，在腫瘤轉移過程中血管內皮生長因子及其受體家族發(fā)揮了重要的作用。目前認為，VEGF家族可通過VEGF/VEGFR-1途徑誘導血管生成，VEGF-C/D與VEGFR-2結合可誘導血管的生成，而通過VEGFR-3與VEGF-C/D結合途徑誘導淋巴管生成3。雖然VEGF-C/D在誘導淋巴管或血管生成中的選擇性作用機制還不是十分明確，但阻斷VEGFR-3信號通路可能是抑制腫瘤淋巴道轉移的途徑之一。本實驗結果顯示大腸癌組織中VEGFR-3的陽性率高于正常黏膜和淋巴結轉移性大腸癌組織（P0.05），且處于高表達狀態(tài)；而VEGF-C在大腸癌組織和淋巴結轉移性大腸癌組織中的陽性表達率明顯高于正常黏膜（P0.05）；VEGFR-3在淋巴結有轉移組的表達強度雖高于無轉移組，但差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。VEGF-C在淋巴結有轉移組的表達明顯高于淋巴結無轉移組，且有統(tǒng)計學意義（P0.05）。表明VEGFR-3和VEGF-C均參與了大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，VEGF-C在淋巴結轉移中發(fā)揮了重要作用。提示阻斷VEGF-C/VEGFR-3信號通路，可減緩大腸癌的發(fā)展；VEGF-C可作為大腸癌淋巴道轉移的預測因子。眾所周知，機體的免疫狀態(tài)是導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。IL-18是新近發(fā)現(xiàn)的-干擾素誘導因子,可通過不同的信號轉導途徑起效,并能抑制腫瘤血管的形成,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用4。另有研究報道，IL-18在腫瘤免疫中有可能與IL-2發(fā)揮協(xié)同作用，誘導NK細胞和T細胞產生IL-13，促使Th2分化，從而影響機體細胞免疫狀態(tài)，導致腫瘤的擴散和轉移5，在胃癌6、結腸癌7患者術前血清中IL-18水平明顯高于正常對照組。本實驗結果顯示，大腸癌組織和淋巴結轉移性大腸癌組織中IL-18陽性表達率明顯高于正常黏膜（P0.05），癌組織中有70%的高表達，但與臨床病理特征無關，與VEGF-C的表達呈明顯正相關（P0.05）；表明大腸癌時細胞中IL-18的表達升高，影響機體細胞免疫功能狀態(tài),參與大腸癌淋巴道轉移，導致腫瘤進展。本實驗中3種蛋白均可觀察到細胞核中有表達的現(xiàn)象,經與試劑公司溝通交流后,排除緩沖液pH值的影響，考慮可能為抗體稀釋度較高的原因所致。【參考文獻】1MandriotaSJ,JussilaL,JeltschM,etal.Vascularendothelialgrowthfactor-C-mediatedlymphangiogenesispromotestumormetastasisJ.EMBOJ,2001,20(4):672-682.2UshioS,NambaM,OkuraT,etal.CloningofthecDNAforhumanIFN-inducingfactor,expressioninEscherichiacoli,andstudiesonth