腸內(nèi)營養(yǎng)對梗阻性黃疸幼鼠腸黏膜Bax、Bcl2蛋白表達的影響及意義.doc

腸內(nèi)營養(yǎng)對梗阻性黃疸幼鼠腸黏膜Bax、Bcl2蛋白表達的影響及意義作者：胡鳳愛張帆趙冬梅張璐萍劉燁輝傅廷亮【摘要】目的探討腸內(nèi)營養(yǎng)對梗阻性黃疸幼鼠腸黏膜中Bax、Bcl2表達的影響及意義。方法將40只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、梗阻性黃疸(OJ)組、OJ+能全素組，免疫組織化學(xué)法檢測腸黏膜Bcl2和Bax蛋白的表達。結(jié)果OJ組大鼠腸黏膜Bcl2表達降低，Bax表達升高，Bcl2/Bax比值下降(均P<；0.01)；OJ+能全素組大鼠Bcl2表達增加(P<；0.05)，Bax表達降低(P<；0.01)，Bcl2/Bax比值升高(P<；0.01)。結(jié)論梗阻性黃疸時腸黏膜細胞凋亡顯著增加，應(yīng)用腸內(nèi)營養(yǎng)對腸黏膜損傷有保護作用，其機制可能是與上調(diào)腸黏膜Bcl2蛋白及下調(diào)Bax蛋白有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】梗阻性黃疸；腸內(nèi)營養(yǎng)；Bax；Bcl2【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectsofenteralnutritiononexpressionofBaxandBcl2ingutmucosainratswithobstructivejaundice.MethodsTheWistarratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup，shamoperationgroup，obstructivejaundice(OJ)group，andobstructivejaundicegroupwithnutrison(OJ+N).TheexpressionofBaxandBcl2inintestinalmucosawastestedbyimmunohistochemicalmethods.ResultsTheexpressionofBcl2inintestinalmucosainOJgroupdecreased，whiletheexpressionofBaxincreased，andtheratioofBcl2/Baxdecreased(P<；0.01,respectively)，theexpressionofBcl2inOJ+Ngroupincreased(P<；0.05)，whiletheBaxdecreased(P<；0.01),andtheratioofBcl2/Baxincreased(P<；0.01).ConclusionIntestinalmucosacellapoptosisincreasedsignificantlywhenobstructivejaundiceoccurred.Enteralnutritionhelpslessentheintestinalmucosadamagecausedbyobstructivejaundice，withtheincreaseofBcl2andthedecreaseofBaxinintestinalmucosa.【Keywords】obstructivejaundice，enteralnutrition，Bax，Bcl2梗阻性黃疸(obstructivejaundice，OJ)是外科常見的疾病，是由肝內(nèi)毛細膽管、小膽管、肝膽管、肝總管或膽總管的機械性梗阻所致。小兒梗阻性黃疸見于先天性膽道閉鎖、膽管擴張癥等疾病1。隨著梗阻時間的延長，膽管內(nèi)壓力逐漸升高，肝內(nèi)膽管因膽汁郁積而破裂，膽汁直接或由淋巴液反流入體循環(huán)，結(jié)果使血中結(jié)合膽紅素增高，引發(fā)多種并發(fā)癥,甚至導(dǎo)致多器官損害。細胞凋亡是細胞在自身基因調(diào)控下進行的一種主動死亡，是機體維持自身穩(wěn)定的一種基本生理機制。細胞凋亡過程受到一系列相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和控制：一類為促凋亡基因，如bax、cfos、p53等；另一類是抗凋亡基因，如bcl2、bclw等2。細胞凋亡作為一種細胞死亡的特殊形式，是由機體自主性調(diào)控的，它為我們進一步認識梗阻性黃疸所致的腸黏膜損害提供了一個新的研究方向。目前對細胞凋亡在梗阻性黃疸腸黏膜損害中的作用報道甚少。本實驗采用免疫組化法檢測幼鼠梗阻性黃疸腸黏膜上皮細胞Bax、Bcl2蛋白的表達以及應(yīng)用腸內(nèi)營養(yǎng)對其表達的影響，以探討梗阻性黃疸腸黏膜損傷時細胞凋亡的調(diào)控機制。1材料與方法1.1實驗動物與主要試劑清潔級雄性Wistar大鼠40只，34周齡，體重80100g，購自山東大學(xué)實驗動物中心。Bax、Bcl2免疫組化試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供。能全素由荷蘭Nutrisia公司提供。1.2實驗分組及模型建立1.2.1分組：采用隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組、假手術(shù)組(SHAM)、梗阻性黃疸(OJ)組和OJ+能全素組，每組10只。1.2.2幼鼠OJ模型制作：大鼠術(shù)前禁食12h，禁水4h。氯胺酮(20mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒后，取上腹正中切口，顯露肝十二指腸韌帶，于近肝門處游離膽總管用0號絲線雙重結(jié)扎，關(guān)腹。假手術(shù)組(SHAM)僅做膽總管游離，但不結(jié)扎。OJ組術(shù)后2d經(jīng)采血檢查總膽紅素和直接膽紅素，比正常對照高5倍為模型制作成功的標(biāo)準。模型制作成功后將大鼠置于室溫2226、相對濕度40%70%、安靜、通風(fēng)的環(huán)境中分籠喂養(yǎng),動物給予普通飼料喂養(yǎng)，實驗過程中所有大鼠均予自由飲水。模型制作成功后假手術(shù)組和OJ組分別于10d結(jié)束實驗。OJ+能全素喂養(yǎng)組術(shù)后給予能全素，配制成4.184kJ/ml，能量610kJ/(kgd)，含氮量1.0g/(kgd)，OJ后1d攝入標(biāo)準量的1/3，第2天攝1/2，第3天起攝入全量。每天計劃量分46次給予。1.3觀察指標(biāo)及測定方法1.3.1腸黏膜形態(tài)學(xué)分析：大鼠處死后，切取距回盲部5cm處一段長3cm的小腸，置10%中性甲醛中固定24h后，石蠟包埋，切片厚6m，蘇木精伊紅染色。每標(biāo)本取5張不連續(xù)的切片，每張切片順次取奇數(shù)視野用顯微觀測尺在光鏡下測定絨毛高度和黏膜厚度。1.3.2Bax、Bcl2的免疫組化檢測：參照免疫組化試劑盒說明進行。結(jié)果判斷：細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達細胞，無棕黃色顆粒為陰性表達細胞。每個切片選取細胞分布均勻的5個高倍(400)視野(向同一方向移動切片，不重復(fù)，不重疊)作為觀察區(qū)，分別計數(shù)每個視野中的陰性與陽性細胞數(shù)。1.4統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以xs表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)的兩兩比較(三個手術(shù)組與對照組)用Dunnett法，統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0。2結(jié)果2.1各組實驗鼠存活情況OJ組實驗鼠分別于術(shù)后1d、3d、7d各死亡1只。OJ+能全素組實驗鼠術(shù)后2d、3d和5d各死亡1只。死亡原因為術(shù)后胃擴張、腸麻痹、腸粘連。OJ組術(shù)后9d死亡1只，為膽道穿孔所致腹腔感染。大鼠于術(shù)后12h恢復(fù)活動，膽總管結(jié)扎術(shù)后第48h，OJ組和OJ+能全素組均出現(xiàn)黃色尿液，且有加重趨勢，并于術(shù)后3d出現(xiàn)皮膚黃染。OJ組大鼠5d內(nèi)即出現(xiàn)明顯腸管擴張、腸壁變薄等現(xiàn)象，普遍活動減少，食欲較差。2.2腸黏膜形態(tài)學(xué)改變正常對照組和假手術(shù)組實驗鼠回腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞成高柱狀，無間質(zhì)水腫和中性粒細胞浸潤。OJ實驗?zāi)Ｐ偷幕啬c黏膜絨毛間隙增大，黏膜腺體排列稀疏，杯狀細胞減少，黏膜萎縮變薄。OJ組大鼠回腸絨毛的高度和黏膜厚度明顯低于正常對照組、假手術(shù)組、OJ+能全素組。OJ+能全素組與正常對照組和假手術(shù)組比較，差異無顯著性意義(結(jié)果另文報道)。2.3Bax、Bcl2在腸黏膜上皮的表達Bax和Bcl2在各實驗組均有不同程度的表達(見圖16)，表達的部位在細胞質(zhì)，正常對照組和假手術(shù)組可見較多Bcl2陽性細胞表達，Bax僅有少量表達。各組大鼠腸黏膜Bcl2、Bax陽性細胞數(shù)的百分率比較，經(jīng)方差分析各組均數(shù)間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.46,P<；0.01)。進一步兩兩比較，假手術(shù)組和OJ+能全素組與正常對照組均沒有差別，OJ組Bcl2、Bax陽性細胞數(shù)高于正常對照組(P<；0.01)；OJ+能全素組高于OJ組(P<；0.05)，詳見表1。表1各組大鼠回腸黏膜Bcl2、Bax陽性細胞數(shù)的百分率比較3討論本研究觀察到幼鼠膽總管結(jié)扎后隨著膽紅素值的逐漸升高，出現(xiàn)明顯腸管擴張、腸壁肌層變薄等現(xiàn)象，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)膽道梗阻10d時腸黏膜厚度和絨毛高度明顯減低，說明高膽紅素可以引起腸黏膜損害；OJ組腸黏膜凋亡細胞增加，說明高膽紅素可引起腸黏膜細胞發(fā)生凋亡。正常小腸黏膜上皮是一種動態(tài)的上皮，每38d更新一次，其本身就存在自發(fā)性的凋亡，籍以清除衰老的細胞。其屏障功能的完整性和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定主要依賴于腸黏膜細胞凋亡和增殖之間的相互平衡。細胞凋亡是一種細胞在局部環(huán)境生理性或病理性刺激下引起的非炎癥性死亡，是介于正常與壞死之間的一種病理過程。細胞凋亡與壞死有本質(zhì)的不同，凋亡是一個有基因表達的主動死亡過程。有研究者3將凋亡發(fā)生過程分為四個步驟：即誘導(dǎo)凋亡刺激信號的出現(xiàn)、凋亡誘導(dǎo)階段、凋亡執(zhí)行階段和細胞死亡后解體階段。而Bcl2/Bax基因主要在凋亡執(zhí)行階段發(fā)揮作用。Bax和Bcl2基因是目前最受關(guān)注的與細胞凋亡相關(guān)的基因，Bax基因與Bcl2基因同源，二者可形成異二聚體或Bax與自身形成二聚體，通過轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染實驗研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2對細胞凋亡具有明顯的抑制作用，而Bax拮抗Bcl2，促進細胞凋亡4。因此Bcl2與Bax的比例決定著細胞受凋亡因素刺激后的生存與凋亡5。本研究免疫組織化學(xué)檢測OJ組大鼠腸黏膜上皮細胞Bcl2表達降低，Bax表達升高，Bcl2/Bax比值下降，腸黏膜細胞凋亡增加。毛曉光等6研究發(fā)現(xiàn)OJ時腸黏膜上皮細胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細胞壞死，膜溶解，部分上皮細胞核固縮呈凋亡狀態(tài)，線粒體空泡變性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。OJ時可發(fā)生末段回腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的明顯異常，凋亡現(xiàn)象增多7，8。與本實驗研究結(jié)果一致。梗阻性黃疸腸黏膜損傷發(fā)生細胞凋亡的可能機制為：氧自由基致?lián)p傷：膽道梗阻后腸黏膜上皮氧自由基增多，氧自由基能夠?qū)е翫NA、蛋白質(zhì)、脂膜的氧化損傷，從而導(dǎo)致細胞凋亡。氧自由基增多的原因：一是腸黏膜有效血流量明顯減少，缺氧導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子傳遞障礙，結(jié)果產(chǎn)生大量氧自由基；二是自由基清除酶系在體內(nèi)合成減少，自由基清除能力下降；三是膽鹽阻礙線粒體呼吸鏈的電子傳遞，增加電子外泄率，促進氧自由基的形成。炎性細胞浸潤：膽道梗阻后，由于腸道膽鹽缺乏，清除內(nèi)毒素的能力下降，大量內(nèi)毒素吸收入血，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素具有刺激單核細胞產(chǎn)生TNF等的作用。TNF可能通過激活細胞Ca2+Mg2+依賴的限制性核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致基因組DNA分子降解為寡聚核苷酸片段，引發(fā)細胞凋亡。OJ所導(dǎo)致的腸黏膜屏障功能不全時，細菌菌群移位促進腸黏膜細胞凋亡。隨著腸黏膜屏障功能與細菌移位學(xué)說的提出，腸內(nèi)營養(yǎng)的重視程度日漸提高9。據(jù)證實，腸道黏膜營養(yǎng)物質(zhì)的70%直接來源于腸腔內(nèi)營養(yǎng)物，僅30%來自動脈血液供應(yīng)10。腸內(nèi)營養(yǎng)循生理途徑給予營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)素經(jīng)門靜脈入肝臟，有利于蛋白質(zhì)合成，而且通過腸黏膜與營養(yǎng)素的接觸，直接向腸黏膜提供其代謝所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，能促進腸黏膜上皮的增生，維持腸黏膜的結(jié)構(gòu)和功能，促進消化液的分泌，改善腸黏膜和肝臟的血液供應(yīng)，防止腸黏膜酸毒和通透性增加，維持分泌型免疫球蛋白SIgA的產(chǎn)生，使得腸腔細菌能有效包被，內(nèi)毒素能有效清除。腸內(nèi)營養(yǎng)能促進腸道運動功能的恢復(fù)，促進腸黏膜一氧化氮的釋放，降低內(nèi)毒素血癥和菌群移位的發(fā)生。能全素是整蛋白型腸內(nèi)營養(yǎng)制劑，生物利用度高。本研究結(jié)果顯示OJ+能全素組比OJ組腸黏膜的厚度和絨毛高度顯著增加，與假手術(shù)組以及正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。支持OJ幼鼠給予腸內(nèi)營養(yǎng)能有效的維持腸黏膜的完整性。OJ+能全素組可見較多Bcl2陽性細胞表達，而Bax陽性表達細胞散在分布，Bcl2/Bax陽性細胞比值顯著升高，腸黏膜細胞凋亡受到抑制。腸內(nèi)營養(yǎng)可增強小腸黏膜細胞Bcl2的表達，說明Bcl2參與腸內(nèi)營養(yǎng)抑制腸黏膜細胞凋亡的保護機制，這可能是腸內(nèi)營養(yǎng)減輕梗阻性黃疸腸黏膜損傷的機制之一?！緟⒖嘉墨I】1傅廷亮,張文同,陳強譜,等.腸內(nèi)營養(yǎng)對梗阻性黃疸幼鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響J.中華小兒外科雜志,2006，27(3):166168.2宋少莉,周斌,王宏亮,等.Bax、Bcl2在兔梗阻性黃疸腎損傷作用的實驗研究J.西北國防醫(yī)學(xué)雜志,2004，25(5):339342.3劉婧,李兆申,宛新建,等.凋亡相關(guān)基因Bcl2/Bax和Fas/Fasl在應(yīng)激性潰瘍發(fā)生發(fā)展過程中的表達及作用J.中華醫(yī)學(xué)雜志,2003，83(6):504509.4WolterKG,HsuYT，SmithCL，etal.MovementofBaxfromthecytosoltomitochondriaduringapoptosisJ.CellBiol,1997，13(9):12811292.5MichaelCR,MatlewJB,VirginiaCP.Modulationofapoptosisbythewidelydistributedbcl2homologybaxJ.Nature,1995，374:736738.6毛曉光,楊志偉,李建國,等.人重組生長激素對梗阻性黃疸大鼠腸源性細菌/內(nèi)毒素移位的影響J.中華肝膽外科雜志,2005，11(6):407410.7SileriP,MoriniS,SicaGS,etal.BacterialtranslocationandintestinalmorphologicalfindingsinjaundicedratsJ.DigDisSci,2002，47(5):929934.8ScopaCD,KoureleasS,TsamandasAC,etal.Beneficialeffectsofgrowthhomeoneandin