利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素.doc

利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素摘要：利用重組酵母菌生成人胰島素為以下流程：獲得目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌工程菌發(fā)酵產(chǎn)物分離純化產(chǎn)品檢驗(yàn)。其中前三個(gè)流程為產(chǎn)人胰島素酵母工程菌的構(gòu)建，根據(jù)人胰島素的氨基酸序列和酵母偏愛的密碼子， 采用基因半合成技術(shù)合成人胰島素基因。將合成的胰島素基因克隆到pPIC9質(zhì)粒，構(gòu)建了畢赤(Pichia)酵母重組表達(dá)載體pPINS319，用BglII線性化后用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入畢赤酵母GSll5菌株，經(jīng)過營養(yǎng)篩選和PCR 復(fù)篩，得到含人胰島素基因的畢赤酵母工程菌株。后三個(gè)流程為胰島素的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，通過補(bǔ)料-分批發(fā)酵獲得發(fā)酵液，分離純化后獲得人胰島素。純化后的重組人胰島素產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE檢測，氨基酸組成分析及小鼠驚厥實(shí)驗(yàn)證明制得產(chǎn)品為有生物活性的人胰島素。關(guān)鍵詞：重組酵母；人胰島素；發(fā)酵；純化；鑒定Using recombinant yeast to produce human insulin HuSheng 1142043040Abstract：The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as follow:get purpose geneconstruct the recombinant plasmidconstruct the genetic engineering bacteriafermentation of engineering bacteriumseparation and purification of the productidentification of the product. The front three processes is building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized according to the amino acid sequence of human insulin and yeast preferential codons. The insulin gene was cloned in to pPIC9 vector and expression vector pPINS319 was constructed. The expression vector was digested with BgllI and then used to transform Pichia Pastoris GSll5 by electroporation. The expression analysis showed that the insulin gene w s able to expressed efficiently in Pichia Pastoris. The posterior three processes is large-scale production by fermentation.Through fed - batch fermentation getting fermentation liquor, separation and purification the fermentation liquor getting human insulin.The final products purified by supedrex 75showed one band by SDS-PAGE analysis and were identical with the native human insulin by all critetia employed.(SDS-PAGE analysis,amin acid composition analysis and bioidentity assay)Keywords：recombinant yeast;human insulin; fermentation;purification;identification胰島素是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于人類的基因重組藥物。最初的重組表達(dá)是通過大腸桿菌分別表達(dá)出胰島素的A鏈和B鏈?，F(xiàn)在，胰島素作為重組蛋白產(chǎn)品，主要有兩條途徑獲得。一條途徑是在大腸桿菌中表達(dá)胰島素前體的包涵體，通過溶解和復(fù)性等過程獲得胰島素。另外一條途徑是通過酵母表達(dá)系統(tǒng)，分泌表達(dá)可溶性的胰島素前體進(jìn)入培養(yǎng)液。由于對(duì)釀酒酵母大規(guī)模培養(yǎng)有豐富的經(jīng)驗(yàn)，使其成為了第一個(gè)分泌表達(dá)胰島素前體的酵母系統(tǒng)。雖然釀酒酵母仍然是主要的胰島素產(chǎn)品表達(dá)系統(tǒng)，近些年幾個(gè)備選的表達(dá)系統(tǒng)也提供了可能性。其中，畢赤酵母是一種非常有用并且優(yōu)勢明顯的表達(dá)宿主。尤其是它強(qiáng)有力的醇氧化酶啟動(dòng)子，受甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)調(diào)控，通過簡單培養(yǎng)可以達(dá)到較高的細(xì)胞密度，能夠穩(wěn)定且高水平表達(dá)外源蛋白。利用重組酵母菌生成人胰島素為以下流程：獲得目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌工程菌發(fā)酵產(chǎn)物分離純化產(chǎn)品檢驗(yàn)。其中前三個(gè)流程為產(chǎn)人胰島素酵母工程菌的構(gòu)建；后三個(gè)流程為胰島素的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。本報(bào)告將從兩個(gè)方面來介紹，如何利用重組酵母菌生成人胰島素。產(chǎn)物檢驗(yàn)產(chǎn)物分離工程菌發(fā)酵構(gòu)建基因工程菌構(gòu)建重組質(zhì)粒獲得目的基因產(chǎn)人胰島素畢赤酵母工程菌的構(gòu)建胰島素大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)人胰島素畢赤酵母工程菌的構(gòu)建1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌種和質(zhì)粒E. coli DH5、Pichia pastoris GSll5、pPIC9購自Invitrogen公司；pMD18-T購自TaKaRa公司。1.1.2 試劑和酶限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、5磷酸化酶、Klenow大片段及去磷酸化酶均購自TaKaRa公司；pfuDNA 聚合酶、Taq-plus、胰蛋白酶和羧肽酶B購自上海生工生物工程有限公司；PCR回收試劑盒購自TaKaRa公司；四個(gè)片段基因均委托上海博亞生物技術(shù)公司合成；其它常規(guī)生化試劑均購自國內(nèi)有關(guān)公司。1.2 方法1. 2. 1 胰島素基因的克隆參考159種在酵母中表達(dá)的蛋白，每種氨基酸均選擇酵母中高頻使用的密碼子，將人胰島素基因設(shè)計(jì)為兩兩末端互補(bǔ)的四個(gè)片段分別進(jìn)行化學(xué)合成，經(jīng)變性、退火以及KlenowI補(bǔ)平，獲得完整的胰島素基因片段。用于酶促合成胰島素基因的四個(gè)片段長度都為59 bp：Frg1:5-AGCGGATCCATGTTCGTTAATCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAGGCTTTGTA-3Frg2:5-CTAGTCTTTGGAGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACCACAAACCAA GTACAAA GCCTCAAC-3Frg3:5-ACTCCAAAGACTAGAAGAGGTTCTAGAAAGGGTATCGTTGAACAATGTTGTACTTCTAT-3Frg4:5-GCCGTCGACTTAATTACAGTAATTTTCCAATTGGTACAAAGAACA TA TA GAA GTACAAC-3上述四個(gè)片段中：Frgl的5和Frg2的3含有15個(gè)互補(bǔ)堿基；Frg2的5和Frg3的3含有14個(gè)互補(bǔ)堿基；Frg3的5和Frg4的3含有14個(gè)互補(bǔ)堿基。將四個(gè)片段等量混合, 經(jīng)過高溫變性和迅速退火后，四個(gè)片段通過互補(bǔ)堿基進(jìn)行配對(duì)，由于Frg2和Frg3 的5，經(jīng)過了磷酸化處理，在Klenow聚合酶的作用下，缺口處從3向5進(jìn)行延伸合成完整的人胰島素基因。用聚丙烯酰胺凝膠回收195196bp的片段，克隆到pMDl8-T載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5，進(jìn)行方向鑒定后，委托上海生工生物工程有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，判斷酶促合成的胰島素基因是否已經(jīng)正確克隆到pMDl8-T的EcoRV多克隆位點(diǎn)，基因堿基序列是否與原設(shè)計(jì)序列完全吻合。所克隆的胰島素基因命名為ins319，此載體命名為pMINS319。1. 2. 2 畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1. 2. 2.1 表達(dá)載體pPINS319的構(gòu)建：根據(jù)pPIC質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的序列特點(diǎn)，為確保表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)信號(hào)肽酶切割后產(chǎn)生精確的胰島素蛋白N末端，并能直接進(jìn)行定向克隆，重新設(shè)計(jì)上游和下游引物，在上游引物5端添加pPIC9質(zhì)粒XhoI位點(diǎn)處的12個(gè)堿基(包括XhoI位點(diǎn)和編碼信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)兩個(gè)氨基酸的序列，5-CTCGA GAAAAGATTCGTTAATCAACACTT-3，下游引物添加EcoRI位點(diǎn)(5-GAA TTCCCGTCGACTTAA TTACA-3。以此引物和pMINS319質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，SDS2PAGE電泳回收擴(kuò)增的胰島素基因片段，將該片段和質(zhì)粒pPIC9分別用X hoI和EcoRI酶切，電泳回收大片段；將酶切的基因片段與pPIC9大片段混合，用T4連接酶連接，構(gòu)建成畢赤酵母表達(dá)載體pPIN319。1. 2. 2.2表達(dá)載體pPINS319的酶切鑒定：為確證胰島素基因克隆到了pPIC9上，采用X hoI和EcoRI雙酶切鑒定pPINS319，并利用瓊脂糖凝膠電泳(2 %瓊脂糖凝膠) 檢測，若泳道出現(xiàn)一條9.2 kb和200 bp左右的電泳條帶，表明重組質(zhì)粒pPINS319含有所預(yù)期的基因片段。1. 2. 2.3 畢赤酵母電擊轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子檢測：重組質(zhì)粒pPIN319用BglII酶切使之線性化，然后用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GSll5感受態(tài)細(xì)胞。在MD培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天后，長出大約200個(gè)轉(zhuǎn)化子。挑取20個(gè)轉(zhuǎn)化子接種在MM培養(yǎng)基上，有11個(gè)轉(zhuǎn)化子在以甲醇做為唯一碳源的MM培養(yǎng)基上能夠緩慢生長(Huts型)。為確證胰島素基因已整合到畢赤酵母菌株GSll5染色體上，分別提取11個(gè)經(jīng)過初步篩選的陽性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，并以之為模板進(jìn)行PCR鑒定。陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果(2%瓊脂糖凝膠)。 胰島素大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)1 菌體培養(yǎng)1.1 搖瓶培養(yǎng)方法溫度30，搖床轉(zhuǎn)速230r/min，搖瓶裝液量30mL/300mL三角瓶。1.2 分批補(bǔ)料發(fā)酵方法1.2.1 種子液制備從新鮮YPD平板上挑取單菌落，接入含BMGY培養(yǎng)基50mL/300mL的搖瓶，30、230r/min下培養(yǎng)20h，作為一級(jí)種子。再以10的接種量接入BMGY培養(yǎng)基50mL（10瓶），同樣條件下培養(yǎng)18h，至OD600為20左右，作為發(fā)酵罐種子液。1.2.2 分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)在12.8L全自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行，發(fā)酵罐中裝入改良BSM培養(yǎng)基6L，按8接種，培養(yǎng)過程中通氣量不小于10L/min，通過改變攪拌轉(zhuǎn)速保持溶氧水平不低于30，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.6。菌種生長初期DO較高，隨著茵體的生長，耗氧量增加，DO不斷下降。待DO降到30以下時(shí)，提高轉(zhuǎn)速，當(dāng)攪拌速率達(dá)到800r/min，解除溶氧攪拌關(guān)聯(lián)。當(dāng)DO陡然上升（表明甘油已經(jīng)耗盡，耗時(shí)約16h），開始補(bǔ)加50甘油(含12mL/LPTMl)，并控制流加速度維持DO在30-40，當(dāng)發(fā)酵液的OD600至300左右時(shí)，開始加入甲醇（含12mL/LPTMl）誘導(dǎo)，甲醇補(bǔ)加速率由低到高，甘油補(bǔ)加速率逐漸降低最后停止，該過度階段約維持4-6h。根據(jù)溶氧的變化及尾氣分析儀在線檢測到的C02變化情況及時(shí)調(diào)整甲醇和氮源補(bǔ)加速率，適時(shí)放罐。2 人胰島素前體的純化與后加工超濾系統(tǒng)簡介：由氮?dú)怃撈?、超濾杯、超濾膜組成。本系統(tǒng)工作壓力 0.2MP左右（不要超過 0.3MP）；膜使用前要進(jìn)行預(yù)處理，使用后要清洗。膜的預(yù)處理：對(duì)于新的膜直接用去離子水浸泡半小時(shí)后即可使用。使用過的膜應(yīng)用0.1%的氫氧化鈉溶液浸泡，再用去離子水浸泡半小時(shí)，沖洗至 pH 值呈中性，即可使用。膜的清洗與保存：膜使用后立即用去離子水反復(fù)沖洗幾遍，再用 0.1%的氫氧化鈉溶液沖洗兩遍，保存于 0.1%的氫氧化鈉溶液中，并需每周更換一次此 0.1%氫氧化鈉浸泡溶液。2.1 人胰島素前體的純化1）發(fā)酵液400mL預(yù)處理：6000r/min5min，取上清液；2）超濾（100K的膜）處理發(fā)酵液上清，收集濾出液；3）超濾（30K的膜）處理濾出液，收集濾出液；4）超濾（6K的膜）處理濾出液，待濾出液在350mL左右，停止超濾，往杯內(nèi)加入 150mL蒸餾水，繼續(xù)超濾，至濾出液達(dá)150mL左右，停止超濾，收集超濾杯中溶液；5）丙酮沉淀人胰島素前體：在上一步收集的溶液中慢慢加入4倍體積-20預(yù)冷的丙酮，邊加邊攪拌，4沉淀2小時(shí)；6）輕輕傾去丙酮溶液，收集沉淀，低溫下真空干燥，收集人胰島素前體粗品；停止超濾，收集超濾杯中溶液；5）丙酮沉淀：在上一步收集的溶液中慢慢加入 4 倍體積-20預(yù)冷的丙酮，邊加邊攪拌，4沉淀 2 小時(shí)；6）輕輕傾去丙酮溶液，收集沉淀，低溫下真空干燥，收集蛋白粗品。2.2 胰島素純化多步層析精細(xì)純化得到的胰島素在冷凍干燥之前，常采用多次結(jié)晶和洗滌工藝進(jìn)一步去除雜質(zhì)、提高產(chǎn)品純度。相比傳統(tǒng)晶體沉降或離心收集工藝，中空纖維0.45微米濾膜可以有效截留胰島素晶體，快速減小樣品體積，從而實(shí)現(xiàn)高效的胰島素晶體收集。此外，封閉的操作系統(tǒng)最大程度避免敞口操作，保證終產(chǎn)品質(zhì)量安全。3 產(chǎn)品檢測3.1 SDS-PAGE分析通過15%SDS-PAGE,用0.3%的考馬斯亮藍(lán)R250染色,對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行鑒定。3.2 氨基酸組成分析通過氨基酸組成分析證明本工藝制備的重組人胰島素樣品的氨基酸組成與標(biāo)準(zhǔn)人胰島素基本一致。3.3 hl生物活性的鑒定取5只昆明種清潔級(jí)小白鼠(雄性20一249)，按每209體重皮下注射hI樣品1.25，U注射后2h內(nèi)均出現(xiàn)降血糖陽性反應(yīng),其中有4只驚厥。隨即腹腔注射1ml 5%葡萄糖注射液，驚厥現(xiàn)象消失。表明制得的hI樣品具有很好的降血搪活性。預(yù)期結(jié)果1 基因半合成技術(shù)合成人胰島素基因用聚丙烯酰胺凝膠回收195196bp的片段，克隆到pMDl8-T載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5，進(jìn)行方向鑒定后，委托上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果表明，酶促合成的胰島素基因已經(jīng)正確克隆到pMDl8-T的EcoRV多克隆位點(diǎn)，基因堿基序列與原設(shè)計(jì)序列完全吻合。2 畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建采用X hoI和EcoRI雙酶切鑒定pPINS319，并利用瓊脂糖凝膠電泳(2 %瓊脂糖凝膠) 檢測，若泳道出現(xiàn)一條9.2 kb和200 bp左右的電泳條帶，表明重組質(zhì)粒pPINS319含有所預(yù)期的基因片段。3 畢赤酵母電擊轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子檢測為確證胰島素基因已整合到畢赤酵母菌株GSll5染色體上，分別提取11個(gè)經(jīng)過初步篩選的陽性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，并以之為模板進(jìn)行PCR鑒定。陽性轉(zhuǎn)化子的PCR 鑒定結(jié)果(2%瓊脂糖凝膠)11個(gè)M u t s型轉(zhuǎn)化子中有兩個(gè)(轉(zhuǎn)化子4 和轉(zhuǎn)化子9)擴(kuò)增出了約200 b 的目的基因片段，表明在這兩個(gè)轉(zhuǎn)化子中，ins319胰島素基因已經(jīng)成功地整合到了GSll5的基因組DNA上。4 胰島素鑒定通過SDS-PAGE，然后進(jìn)行免疫印跡，呈現(xiàn)兩條特異條帶，由此確定表達(dá)的蛋白確實(shí)是human Insulin。通過氨基酸組成分析證明本工藝制備的重組人胰島素樣品的氨基酸組成與標(biāo)準(zhǔn)人胰島素基本一致。取5只昆明種清潔級(jí)小白鼠(雄性20一249)，按每209體重皮下注射hI樣品1.25，U注射后2h內(nèi)均出現(xiàn)降血糖陽性反應(yīng),其中有4只驚厥。隨即腹腔注射1ml 5%葡萄糖注射液，驚厥現(xiàn)象消失。表明制得的hI樣品具有很好的降血搪活性。討論在酵母高表達(dá)基因中，某些密碼子幾乎不使用或使用頻率