（蔬菜學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）黃瓜韌皮液中的mRNA和蛋白質(zhì)對(duì)油菜素內(nèi)酯的響應(yīng)研究.pdf

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要 摘要 油菜素內(nèi)酯( b r s ) 是一種新型的類(lèi)甾醇激素，除了在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面起重 要的作用外，在植物對(duì)生物和非生物逆境的抗逆反應(yīng)調(diào)控中扮演著重要的角色。研 究蔬菜等農(nóng)作物韌皮液中的基因、蛋白等物質(zhì)對(duì)b r s 的響應(yīng)不僅對(duì)于揭示植物地上 部和地下部間通過(guò)信號(hào)通訊協(xié)同植物生長(zhǎng)、發(fā)育、抗逆等反應(yīng)的機(jī)制具有重要的理 論意義，而且對(duì)于蔬菜作物生長(zhǎng)發(fā)育及抗性調(diào)控途徑的探索也具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。 本文以主要設(shè)施蔬菜黃瓜為研究對(duì)象，從韌皮液m r n a 和蛋白質(zhì)物質(zhì)的運(yùn)輸著 手，通過(guò)結(jié)合利用消減雜交技術(shù)( s s h ) 和r t - p c r ( r e a l t i m ep c r ) 技術(shù)，從黃瓜 韌皮液中克隆獲得了一系列黃瓜代謝途徑中對(duì)表油菜素內(nèi)酯( e b r ) 響應(yīng)的關(guān)鍵基 因；研究還從蛋白質(zhì)組學(xué)方面，利用2 d p a g e 技術(shù)迸一步研究了響應(yīng)e b r 的黃瓜 韌皮蛋白，并就e b r 對(duì)黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育及抗性的影響機(jī)制進(jìn)行了探討。所取得的主要 結(jié)果如下： 1 ) 在e b r 對(duì)黃瓜韌皮液r n a 轉(zhuǎn)錄本影響的研究過(guò)程中，構(gòu)建了黃瓜韌皮液 受e b r 處理之后的消減抑制雜交( s s h ) 文庫(kù)，共獲得6 5 0 個(gè)克隆，隨機(jī)2 6 0 個(gè)克 隆進(jìn)行測(cè)序分析，得到2 8 個(gè)獨(dú)立基因，根據(jù)b l a s t x 分析推測(cè)這些基因編碼的蛋 白功能，可以分為能量與光合作用，運(yùn)輸通道，蛋白合成，細(xì)胞骨架，細(xì)胞分裂和 分化，激素響應(yīng)及逆境調(diào)控和其它相關(guān)的7 大類(lèi)，其中參與脅迫響應(yīng)的基因占較大 比側(cè)，表明e b r 誘導(dǎo)了抗性相關(guān)基因，生長(zhǎng)素和茉莉酸響應(yīng)基因在s s h 文庫(kù)中出 現(xiàn)，表明e b r 可能與其它植物生長(zhǎng)物質(zhì)互作。 2 ) e b r 處理黃瓜葉片6h 后，編碼c 6 0 、c 4 5 3 、c 5 6 8 、c 6 8 1 、c 5 7 9 、c 5 9 4 、 c 5 6 4 、c 6 2 3 、c 6 3 7 、 c 4 2 0 等基因的表達(dá)均上調(diào)，說(shuō)明e b r 促進(jìn)了這些基因的表 i 達(dá)。 3 ) 韌皮蛋白雙向凝膠電泳結(jié)果表明e b r 處理葉片6h 后，韌皮液中蛋白組成 發(fā)生了明顯的改變，2 8k d a 蛋白點(diǎn)表達(dá)明顯高于對(duì)照，另外三個(gè)蛋白點(diǎn)( 6 0 k d a 、 7 5k d a 、9 5k d a ) 則明顯弱于對(duì)照，說(shuō)明e b r 可能影響了相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn) 或抑制了蛋白的合成并通過(guò)韌皮部運(yùn)輸?shù)狡渌鞴佟?綜合以上結(jié)果我們認(rèn)為，表油菜素內(nèi)酯促進(jìn)了黃瓜韌皮液中特定m r n a 和蛋白 i l 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 表達(dá)的變化，m r n a 和蛋白通過(guò)韌皮液運(yùn)輸?shù)狡渌L(zhǎng)器官，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育 及抗性。 關(guān)鍵詞：黃瓜，韌皮液，長(zhǎng)距離運(yùn)輸，消減抑制雜交文庫(kù)，雙向凝膠電泳，信號(hào)運(yùn) 輸，抗性 i l l a b s t r a c t b r a s s i n o s t e r o i d s ( b r s ) ，an e w k i n do fs t e r o i d a lh o r m o n e sp l a yi m p o r t a n tr o l e sn o t o n i vi np l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n tb u ta l s oi nr e s p o n st ob i o t i ca n da b i o t i cs t r e s s e s t h ep l a n tl o n g d i s t a n c et r a n s l o c a t i o ns y s t e m sp l a y e dac r i t i c a lr o l ei nt h ed e v e l o p m e n to f a ne f f e c t i v ew h o l e p l a n tc i r c u l a t o r ya n dc o m m u n i c a t i o nn e t w o r k s t u d y i n gt h er e s p o n s e o fp h i o e ms a pm r n a sa n dp r o t e i n st ob r sm a yb eh e l p f u lt or e v e a lt h er o l e so fp h l o e m i n f o 冊(cè)a t i o nn e t w o r ki nc o o p e r a t i n gp l a n tg r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n ds t r e s s t o l e r a n c e b e 鉚e e na e r i a la n du n d e r - g r o u n do r g a n s t h es t u d yi sa l s oo fs i g n i f i c a n ti m p o r t a n c ef o r d e v e l o p m e n t i n gm e t h o d s t oi m p r o v es y s t e m i c a l l yt h ew h o l e p l a n ts t r e s sr e s i s t a n c e c u c u m b e r ( c u c u m i ss a t i v u sl ) w a su s e dt os t u d yt h eb r s - r e g u l a t e dm r n a s a n d p r o t e i n si np h l o e ms a p t h r o u g ht h ee s t a b l i s h m e n to fs u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v el i b r a r y i n t e r r o g a t e db yb i o i n f o r m a t i ct o o l s ，t h o s et r a n s c r i p t ss p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di nr e s p o n s e t oe b ri n t h em e ta _ b o l i cn e t w o r ko fc u c u m b e rw e r ei n d e n t i f i e d t h er e l i a b i l i t y o ft h es u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v el i b r a r yw a sa l s ov e r i f i e db yu s i n gr t - p c rm e t h o d m e a n w h i l e ，c h a n g e si n p r o t e o m eo fp h l o e ms a pa f t e re b r t r e a t m e n tw e r es t u d i e db y2 d p a g e t h ef i n d i n g sa r e a sf o l l o w s ： 1 、ac d n al i b r a r yo fg e n e sw h i c hw e r ep r e f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d i nt h ee b r - t r e a t e d p h i o 弓ms 印w a sc o n s t r u c t e db ys u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) t os t u d y t h e e f f e c t so fb r so nm et r a n s c r i p t si nc u c u m b e rp h l o e ms a p ，6 8 0c l o n e sw e r eo b t a i n e d ，a n d 2 6 0c i o n e sw e r er a n d o m l ys e l e c t e df o rs e q u e n c i n g ，r e s u l t i n gi n2 8u n i q u et r a n s c r i p t sa n d f a l lt h e mi n t os e v e nc a t e g o r i e sa f t e ra n a l y z e db yb l a s t xa n dg o ：e n e r g yg e n e r a t i o n a n dp h o t o s y n t h e s i s t r a n s p o r t a t i o nc h a n n e l s ，t r a n s p o r t a n ds y n t h e s i so fp r o t e m ， c y t o s k e l e t o n ，c o n t r o lo fc e l ld i v i s i o n ，h o r m o n er e s p o n s ea n dr e g u l a t i o no f s t r e s sr e s p o n s e t h eh i g ho c c u r r e n c eo fs t r e s sr e l a t e dg e n e si n t h es s he d n al i b r a r yp o i n t st o a n i m p o r t a n tr o l e so fb r si n s t r e s sr e s p o n s e t h ea p p e a r a n c eo fa u x i na n dg i b b e r e l l i n r e s p o n s ef a c t o rg e n e si nt h el i b r a r ys u g g e s t st h a tt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e n b r sa n do t h e r h o r m o n e sm a ye x i s t 2 、r t - p c rv e r i f i e dt h a te b rf o l i a ra p p l i c a t i o nm r n a l e v e l si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y f o rt h o s eg e n e s ：c 6 0 、c 4 5 3 、c 5 6 8 、c 6 8 1 、c 5 7 9 、c 5 9 4 、c 5 6 4 、c 6 2 3 、c 6 3 7 、 c 4 2 0 ，t h i sp r o v et h a te b rp r o m o t et h i sg e n e se x p r e s s i o n 3 ) 碼e 細(xì)d i m e n s i o n a lp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i so fc u c u m b e rp h l o e m p r o t e i nr e v e a l e dt h a t6ha f t e ro 1m g u 1e b rf o l i a ra p p l i c a t i o nt h ea b u n d a n c eo fa2 8 k d ap r o t e i nw a su p r e g u l a t e da n dt h r e eo t h e rp r o t e i n ( 6 0 k d a 、7 5k d a 、9 5 k d a ) w e r e d o w n r e g u l a t e db ye b r t h i ss u g g e s t s t h a te b ri n d u c es y n t h e s i so fs o m er e l a t e dp r o t e l n s i nc u c u m b e rl e a v e sa n dt r a n s p o r tt oo t h e ro r g a n st h r o u g h t h ep h l o e mt r a n s l o c a t i o ns t r e a m - i nc o n c l u s i o n ，e b ri n f l u e n c e st h ee x p r e s s i o no fr n a a n dp r o t e i ni nc u c u m b e r p h l o e ms a p w eh y p o t h e s i z et h a tb r sr e g u l a t es y s t e m i c a l l yt h ed e v e l o p m e n t 嘰d s t r e s s r e s i s t a n c eo fd i s t a n to r g a n sb ym r n a a n dp r o t e i nt r a f f i c k i n gt h r o u g ht h ep h l o e m k e yw o r d s ：c u c u m i ss a t i v u sl p h l o e ms a p ，l o n g d i s t a n c em o v e m e n t ，s u p p r e s s l v e s u b t r a c t i v eh y b r i d i s a t i o n ，p r o t e i n ，m r n a ，t w o - d i m e n s i o n a p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，r e s i s t e n c e v 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 縮略詞 a b a b l b r s b r l l c c c m n a c p c m p p l 6 c o 2 dp i a g e e b l e b r e g t a f d a f t i e f k n l l c m l d m m a p s m d a m p n p c p c r p p 2 p rp r o t e i n s p t g s r t p c r 縮略詞 a b s c i s i ca c i d b r a s s i n o l i d e b r a s s i n o s t e r o i d s b r a s s i n o s t e r o i dr e c e p t o r c o m p a n i o nc e l l c u c u r b i tm a x i m an o n a u t o n o m o u sc e l l p r o t e i n p u m p k i np h l o e m r n ab i n d i n gp r o t e i n s 16 一k dc 。m a x i m ap h l o e mp r o t e i n c o n s t a n s t w od i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s 2 4 一e p i b r a s s i n o l i d e 一 e p i b r a s s i n o l i d e e t h y l e n eg l y c o lt e t r a a c e t i ca c i d f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e f l o w e r n 、j gl o c u st l s o e l e c t r i cf o c u s i n g k n o t t e d 】 l a s e rc a p t u r em i c r o d is s e c t i o n l o n gd i s t a n c em o v e m e n t a s s e m b l ym a p s m a l o n y l a l d e h y d e m o b i l ep r o t e i n n u c l e a rp r o t e i nc o m p l e x p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p p 2 p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n s p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g q u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c r 脫落酸 油菜素內(nèi)酯 油菜素甾醇類(lèi) 油菜素內(nèi)酯受體 伴胞細(xì)胞 葫蘆科非細(xì)胞自主蛋白 南瓜韌皮r n a 結(jié)合蛋白1 6 鋅指蛋白 雙向凝膠電泳 2 4 表油菜素內(nèi)酯 表油菜素內(nèi)酯 乙二醇二乙醚二胺四乙酸 熒光素二乙酸酯 開(kāi)花信號(hào)分子 等電聚焦 玉米同源域蛋白 激光顯微切割 長(zhǎng)距離運(yùn)輸 裝配m a p s 丙二醛 可運(yùn)輸?shù)牡鞍?核酸蛋白復(fù)合體 聚合酶鏈反應(yīng) 韌皮蛋白2 病原相關(guān)蛋白 轉(zhuǎn)錄后基因沉默 實(shí)時(shí)定量p c r 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 縮略詞 s a s e s a r s d s p i a g e s s h s u t l s a l i c y l i ca c i d 水楊酸 s i e v e - t u b ee l e m e n t篩管分子 s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e 系統(tǒng)獲得抗性 s o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d e 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺 g e le l e c t r o p h o r e s i s 凝膠電泳 s u p p r e s s i v es u b t r a c t i v eh y b r i d i s a t i o n 削減抑制雜交 s u c r o s et r a n s p o r t e rr n a 編碼的葉蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)子 i l 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 獨(dú)創(chuàng)性生聲明 浙江大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或 撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得逝姿盤(pán)堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而 使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明 確的說(shuō)明并表示謝意。 學(xué)位論文作者簽名：耄降乎 簽字日期：髫年 多月 1 3 日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 本學(xué)位論文作者完全了解逝江盤(pán)堂 有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送 交本論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)逝姿態(tài)堂可以將 學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和傳播，可以采用影印、縮印 或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)) 學(xué)位論文作者簽名： 研茜午 簽字日期：1 巾s 年 占月7 ；日 導(dǎo)師簽名： 簽字日期：a 墻年6 月”日 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文致謝 致謝 本論文是在導(dǎo)師喻景權(quán)教授、周艷虹博士的悉心指導(dǎo)下完成的。從論文的選題、 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作到論文的撰寫(xiě)、修改和定稿，凝聚了導(dǎo)師許多的心血和智慧。 兩年來(lái)，學(xué)業(yè)、生活等各方面都得到了導(dǎo)師無(wú)微不至的關(guān)心和照顧；導(dǎo)師淵博的學(xué) 識(shí)，敏銳的思維，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，以及嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范潛移默化 地影響著我，使我不僅接受了全新的思想觀念，領(lǐng)會(huì)了基本的思維方式，掌握了通 用的研究方法，而且還明白了許多待人接物與為人處世的道理，這一切我將受用終 生。我愿借此機(jī)會(huì)向?qū)煴硎局孕牡母兄x! 祝愿導(dǎo)師合家歡樂(lè)，一生平安! 在研究期間，還得到了師愷、傅豐慶、丁桔、夏曉劍、王虹、張韻、姜玉萍、 李蘋(píng)芳、丁小濤等中心大樓南樓3 8 3 生理生化實(shí)驗(yàn)室?guī)熜纸愕苊脗冊(cè)趯?shí)驗(yàn)及生活中給 予的諸多幫助及勉勵(lì)；2 0 0 6 級(jí)蔬菜專(zhuān)業(yè)全班同學(xué)的關(guān)心，在此一并表示由衷的感謝。 特別感謝家人二十多年的關(guān)愛(ài)和支持，正是他們默默無(wú)聞的奉獻(xiàn)和一貫的支持 與鼓勵(lì)，才使我健康成長(zhǎng)并順利地完成了數(shù)年的求學(xué)生涯。他們一點(diǎn)一滴的教導(dǎo)我 將銘記于心，他們不求回報(bào)的付出永遠(yuǎn)是我進(jìn)取向上的動(dòng)力。衷心地祝愿他們身體 健康、永遠(yuǎn)快樂(lè)! 最后，非常感謝在我成長(zhǎng)過(guò)程中所有支持、鼓勵(lì)和幫助過(guò)我的老師、親人、同 學(xué)、領(lǐng)導(dǎo)和朋友，我愿在未來(lái)的學(xué)習(xí)和工作中，以更好的成績(jī)來(lái)答謝所有這些關(guān)心 我的人。同時(shí)向參加論文評(píng)閱及答辯委員會(huì)的各位專(zhuān)家、教授致以誠(chéng)摯的謝意! 郭銀平 2 0 0 8 年5 月于浙江大學(xué)華家池畔 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 前言 第一章前言 1 植物韌皮部大分子運(yùn)輸研究進(jìn)展 1 1 植物韌皮部結(jié)構(gòu)概述 在高等植物中，水分和有機(jī)物的運(yùn)輸，主要由徽管系統(tǒng)承擔(dān)。微管系統(tǒng)包括木 質(zhì)部和韌皮部，木質(zhì)部主要負(fù)責(zé)運(yùn)輸水分、無(wú)機(jī)鹽以及a b a 等小分子物質(zhì)，韌皮 部主要運(yùn)輸光合產(chǎn)物，包括糖，淀粉，氨基酸，多肽等。輸導(dǎo)組織是植物體中擔(dān)負(fù) 物質(zhì)長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)闹饕M織，根部從土壤中吸收的水分和無(wú)機(jī)鹽，由它們運(yùn)送到地 上部。葉片的光合產(chǎn)物，則由它們運(yùn)送到根、莖、花、果實(shí)中去。植物體各部分之 間經(jīng)常進(jìn)行的物質(zhì)的重新分配和轉(zhuǎn)移，也要通過(guò)輸導(dǎo)組織來(lái)進(jìn)行( 圖1 ) 。 韌皮部是一種復(fù)合組織，包含篩管分子、篩胞、伴胞、薄壁細(xì)胞、纖維等不同 類(lèi)型的細(xì)胞，其中與有機(jī)物的運(yùn)輸直接有關(guān)的是篩管分子或篩胞。篩管分子是管狀 細(xì)胞，在植物體中縱向連接，形成長(zhǎng)的細(xì)胞行列，稱(chēng)為篩管，它是被子植物中長(zhǎng)矩 離運(yùn)輸光合產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。 篩管分子只具初生壁。壁由果膠和纖維素組成。在它的上下端壁上分化出許多 較大的孔，稱(chēng)篩孔，具篩孔的端壁特稱(chēng)篩板。粗的原生質(zhì)聯(lián)絡(luò)索穿過(guò)篩孔使上下鄰 接的篩管分子的原生質(zhì)體密切相連，在各聯(lián)絡(luò)索的周?chē)须蓦召|(zhì)鞘包圍。篩管分子 的側(cè)壁具有許多特化的初生紋孔場(chǎng)，稱(chēng)為篩域，其上的孔較一般薄璧細(xì)胞壁上初生 紋孔場(chǎng)的孔大，比胞間連絲更粗的原生質(zhì)絲在此通過(guò)，這使篩管分子與側(cè)鄰的細(xì)胞 有更密切的物質(zhì)交流。 篩管分子的側(cè)面通常與一個(gè)或一系列伴胞細(xì)胞( c c ) 相毗鄰，伴胞是與篩管分 子起源于同一個(gè)原始細(xì)胞的薄壁細(xì)胞，具有細(xì)胞核及各類(lèi)細(xì)胞器，與篩管分子相鄰 的壁上有稠密的篩域，反映出二者關(guān)系密切。篩管的運(yùn)輸功能與伴胞的代謝緊密相 關(guān)。 篩管運(yùn)送養(yǎng)分的速度每小時(shí)可達(dá)1 0 l o o c m ，通常，篩管功能只有一個(gè)生長(zhǎng)季， 少數(shù)植物可更長(zhǎng)，如葡萄、椴、堿蓬的篩管可保持二至多年。在衰老或休眠的篩管 中，在篩板上會(huì)大量積累胼胝質(zhì)，形成墊狀的胼胝體( c a l l u s ) 封閉篩孔，當(dāng)次年春 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文h 0 再 v 震 b 圖1 植物微管系統(tǒng)在遠(yuǎn)距離器官之間的信息 通訊中作為通道。( a ) 木質(zhì)部和韌皮部的作用 原理簡(jiǎn)圖。( b ) 微管橫切面( 源自：l o u g ha n d l u c a s 2 0 0 6 ) 。 f i g 1t h ep l a n tv a s c u l a rs y s t e mf u n c t i o n sa s t h ec o n d u i tf o rl o n g d i s t a n c ec o m m u n i c a t i o n b e t w e e n d i s t a n t l y l o c a t e d o r g a n s ( d ) s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no ft h ex y l e ma n d p h l o e m ，i l l u s t r a t i n gt h ef u n d a m e n t a lf e a t u r e t h a t ，i nc o n t r a s tt ot h ea n i m a lh n g d o m ，t h e f l o wp a t h w a yi s n o n c i r c u l a t o r yi nn a t u r e ( 6 ) t r a n s v e r s es e c t i o no far o o td e m o n s t r a t i n gt h e p h y s i c a ls e p a r a t i o no f t h ep h l o e ma n dx y l e mt i s s u e s ( f r o m ：l o u g ha n dl u c a s 2 0 0 6 ) 季篩管重新活動(dòng)時(shí)，胼胝體能消失，聯(lián)絡(luò)索又能重新溝通。此外，當(dāng)植物受到損傷 或其他外界刺激時(shí)，篩管分子也能迅速形成胼胝質(zhì)，封閉篩孔，阻止?fàn)I養(yǎng)物的流失。 因此，韌皮部在植物的物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中，特別是葉片和根部之間的物質(zhì)以及信 息互換中扮演著重要的角色。目前，植物韌皮部的研究日益深入，微管運(yùn)輸?shù)臋C(jī)理 不斷完善，在植物信號(hào)物質(zhì)的研究中，具有理論性意義。 1 2 韌皮部r n a 和蛋白質(zhì)的運(yùn)輸 近年來(lái)，學(xué)者對(duì)韌皮部有廣泛的研究，韌皮部是高等植物體內(nèi)大分子物質(zhì)運(yùn)輸 的網(wǎng)絡(luò)體系，是光合產(chǎn)物從植物體的源運(yùn)輸?shù)綆?kù)的主要通道。韌皮部的進(jìn)化史反映 出植物與外界環(huán)境的交流，例如，成熟的器官或分裂中的萌芽感受外界環(huán)境的信號(hào) 等。這個(gè)長(zhǎng)距離信號(hào)運(yùn)輸系統(tǒng)產(chǎn)生的結(jié)果，可以使正在形成中的器官能更好的向著 產(chǎn)生，成熟，功能化的方向發(fā)展。韌皮液中除光合產(chǎn)物和一些其他的小分子物質(zhì)以 外，還有一系列的大分子物質(zhì)，除了傳統(tǒng)意義上的蛋白質(zhì)和一些調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的小 分子物質(zhì)，還有r n a s 。目前已經(jīng)報(bào)道了韌皮部中幾種類(lèi)型的r n a 分子，如細(xì)胞 r n a ，病原體r n a ，小r n a s ( y o o 和l u c a s ，2 0 0 4 ) 和基因沉默相關(guān)的成分等， 在近來(lái)的研究進(jìn)展中認(rèn)為，這些大分子物質(zhì)是植物體內(nèi)信號(hào)物質(zhì)長(zhǎng)距離運(yùn)輸系統(tǒng)的 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 h u 舌 一部分，在韌皮部中具有調(diào)節(jié)運(yùn)輸，感應(yīng)環(huán)境信號(hào)和病原物的功能。 隨著r n a 分子在基因表達(dá)調(diào)控中重要作用的發(fā)現(xiàn)，r n a 分子如何在植物體內(nèi) 運(yùn)輸移動(dòng)，如何在目標(biāo)組織中發(fā)揮作用等問(wèn)題引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。 目前對(duì)于攜帶信息的大分子物質(zhì)( 包括轉(zhuǎn)錄因子和m r n a 分子) 在細(xì)胞和整個(gè)植 物系統(tǒng)間運(yùn)輸?shù)纳钊胙芯?，產(chǎn)生了維管植物細(xì)胞間信號(hào)的新概念。大分子物質(zhì)在細(xì) 胞間和整個(gè)植物中的運(yùn)輸，分別發(fā)生在胞間連絲和植物維管系統(tǒng)兩種特殊結(jié)構(gòu)中 ( o p a r k a ，1 9 9 9 ；l u c a s ，1 9 9 6 ) 。 m r n a 分子作為遺傳信息的載體，在產(chǎn)生它們的細(xì)胞中發(fā)揮作用。近來(lái)研究表 明，m r n a 也作為一個(gè)活躍的信號(hào)分子，調(diào)控基因表達(dá)和植物發(fā)育( d o e r i n g s a a d ， 2 0 0 4 ) ，而各種類(lèi)型的r n a 分子從合成位點(diǎn)長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)街参锊煌鞴俚恼{(diào)控機(jī)制 ( y o o 等，2 0 0 4 ) ，逐漸成為人們的研究熱點(diǎn)。 對(duì)于植物系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)膔 n a 類(lèi)型，目前已知主要有3 種r n a 分子能夠進(jìn)行系統(tǒng) 運(yùn)輸，即植物病毒基因組r n a 、轉(zhuǎn)錄后基因沉默的r n a 信號(hào)和內(nèi)源特異m r n a 分 子。 植物病毒基因組r n a 的研究一般通過(guò)接種，把病毒感染到宿主植物細(xì)胞中進(jìn) 行表達(dá)，黃瓜花葉病毒接種到南瓜上，感染其核酸( r n a 或d n a ) ，并結(jié)合特定的 可運(yùn)輸?shù)牡鞍? m p ) ，形成核酸蛋白復(fù)合體( 1 9 9 6 ；g i | b e r t s o n 和l u c a s ，1 9 9 6 ) 通 過(guò)伴胞篩管運(yùn)輸( l u c a s 等，2 0 0 2 ) ，在感染的過(guò)程中，病毒的可運(yùn)輸?shù)鞍自诎榘?導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的r n a 分子發(fā)生異常的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育( a a r t ， 2 0 0 4 ) ，進(jìn)一步說(shuō)，改變韌皮部中長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)膍 r n a 的數(shù)量和種類(lèi)( r u i z m e d r a n o 等，2 0 0 7 ) ，是導(dǎo)致病毒影響植物發(fā)育的主要原因，最近有用建立抑制差減文庫(kù)的手 段來(lái)研究病毒對(duì)植物的作用危害，結(jié)果顯示，病毒感染植物的韌皮液中只有極少的 m r n a 數(shù)量的改變，說(shuō)明，m r n a 在進(jìn)入植物細(xì)胞時(shí)，即伴胞和篩管間的信號(hào)大分 子物質(zhì)的交換時(shí)，有一個(gè)高級(jí)篩選調(diào)控機(jī)制( z a m b r y s k i 等，2 0 0 2 ；a o k i 等，2 0 0 5 ) 病毒可運(yùn)輸?shù)鞍? m p ) 不能大量的改變內(nèi)源m r n a ，但在感染的植株內(nèi)，仍有少量的 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子能夠被病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生，進(jìn)而影響植株的正常發(fā)育 ( r u i z m e d r a n o ，2 0 0 7 ) 。 在非自主細(xì)胞基因沉默的研究上，采用轉(zhuǎn)基因和病毒侵染的方法居多，轉(zhuǎn)基因 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 剛茜 沉默可能會(huì)引起直接自發(fā)的基因沉默或在主要區(qū)域被誘導(dǎo)后在整個(gè)植株內(nèi)傳播 ( v o i n n e t 和b a u l c o m b e ，1 9 9 9 ；v o i n n e t 等，1 9 9 8 ) ，相似地，病毒引起的基因沉默 并不一定在被侵染的器官( r u i z m e d r a n o 等，2 0 0 4 ) ，信號(hào)物質(zhì)最先在伴胞中合成， 繼而在韌皮部中運(yùn)輸?shù)街参锏母鱾€(gè)器官( g i l b e r t s o n 等，1 9 9 6 ；k l a h r e ，2 0 0 2 ；s m i t h ， 2 0 0 7 ) 。 刊篡e n d o g 善e n o u s 三倉(cāng) o a廠k j ” 二r n a z i pc o d 吖伶 卜_ j ffj 叩e 導(dǎo)：端_ 心 夕 廣伊卻o 。刪n c i i n g p 吲百n 心乞口。 鄉(xiāng)|口o o 廁b 眥n o n n - c u c e l l e - a 叫u t o 刪n o m n o c 。u s m 一似 “js u p r a c 3 e i l u l a r 。p 診 岔緄。n 洲a 圖2 非自主細(xì)胞r n a 在韌皮液中運(yùn)輸調(diào)控機(jī)理：模型中r n a 分子結(jié)合c i s a c t i n g 序列，即伴胞中 細(xì)胞特異z i p 編碼結(jié)合蛋白，通過(guò)胞間連絲運(yùn)輸?shù)胶Y分子中。 ( 源自：l u c a s 2 0 0 1 ) f i g 2p o t e n t i a lm e c h a n i s mf o rr e g u l a t i n gt h et r a n s p o r to fn o n - c e l l a u t o n o m o u sr n a i n t ot h ep h l o e m t r a n s l o c a t i o ns t r e a m i nt h i sm o d e l ，n o n c e l l a u t o n o m o u sr n am o l e c u l e sc o n t a i nc i s a c t i n gs e q u e n c e e l e m e n t s ，t e r m e d z i pc o d e s ，w h i c h f u n c t i o ni nc o m b i n a t i o nw i t hc o m p a n i o nc e l l s p e c i f i cz i p c o d e b i n d i n gp r o t e i n s ，t r a n s p o r tt h r o u g ht h ep l a s m o d e s m a t at os i e v ee l e m e n t ( f r o m ：l u c a s 2 0 0i ) 在已知的r n a 系統(tǒng)運(yùn)輸中( c i t o v s k y ，2 0 0 0 ) ，內(nèi)源m r n a 細(xì)胞間運(yùn)輸?shù)纳飳W(xué) 意義最引入關(guān)注。在韌皮部中還發(fā)現(xiàn)其他內(nèi)源m r n a ，在某種機(jī)制作用下定位于特 殊組織，如c m p p l 6 是南瓜的一個(gè)韌皮蛋白，在c c s e 之間以序列非特異方式運(yùn)輸 r n a ( r u i z m e d r a n o 等，1 9 9 9 ) 。利用r t - p c r 方法在異質(zhì)嫁接南瓜的韌皮液，檢 測(cè)出有近1 0 0 種m r n a 存在于韌皮部中，對(duì)其中一個(gè)m r n a 轉(zhuǎn)錄物c m n a c p 做了 詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄本從南瓜砧木移動(dòng)到黃瓜接穗的分生組織中，由于 c m n a c pm r n a 的選擇性，還需要一個(gè)蛋白質(zhì)特異地識(shí)別這個(gè)m r n a 并將此m r n a 4 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文前言 運(yùn)輸?shù)巾敹私M織，即c m p p l 6 蛋白( x o c o n o s t l e c a z a r e s 等，2 0 0 2 ) 。有關(guān)c m n a c p m r n a 或其他m r n a 長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)纳飳W(xué)基本原理已有報(bào)道( r u i z m e d r a n o 等， 1 9 9 9 ) ，微注射實(shí)驗(yàn)表明，n t n c a p p i 在介導(dǎo)選擇性蛋白的細(xì)胞間運(yùn)輸中的作用 ( r u i z m e d r a n o 等，1 9 9 9 ) ，n c a p ( n o n c e l la u t o n o m o u sp r o t e i n ) 傳遞到胞間連絲的模 型具有選擇性，并且可以對(duì)植物中r n a 運(yùn)輸?shù)纳飳W(xué)機(jī)制其進(jìn)行調(diào)控。 目前，韌皮部?jī)?nèi)蛋白質(zhì)的研究目益深入，其中，擬楠芥光周期誘導(dǎo)花芽分化的 基因的特性已經(jīng)研究比較深入，光周期途徑中，完整信號(hào)的主要部分是c o 蛋白 ( p u t t e r i l l 等，1 9 9 5 ) 和r n f 類(lèi)激酶抑制蛋白f t ( k a r d a i l s k y 等，1 9 9 9 ；k o b a y a s h i 等，1 9 9 9 ) 。f t - m r n a 是韌皮部中可運(yùn)輸?shù)拈_(kāi)花信號(hào)分子，和c o 相反，f t 蛋白不 單在源器官的伴胞中表達(dá)會(huì)引起開(kāi)花，在其他器官( 分生組織) 表達(dá)也會(huì)引起植物 開(kāi)花( a n 等，2 0 0 4 ) ，以此證實(shí)f t 的表達(dá)是被c o 所控制( s a m a c h 等，2 0 0 0 ) ，且 f t 是促進(jìn)植物開(kāi)花的必要條件( k a r d a i l s k y 等，1 9 9 9 ；k o b a y a s h i 等，1 9 9 9 ) ，這些 都證實(shí)f t 是開(kāi)花信號(hào)系統(tǒng)中的重要組成部分。 在植物韌皮部中，大分子信號(hào)物質(zhì)如：d n a 、r n a 、蛋白質(zhì)以及多肽的運(yùn)輸具 有特殊形式( h a y w o o d ，2 0 0 2 ；w u ，2 0 0 2 ) ，m r n a 與特定的蛋白形成核蛋白復(fù)合 物在植物韌皮部進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸ig o m e z 和p a l l a s ，2 0 0 4 ；j a n s s e n ，2 0 0 1 ) ，韌皮部 中的p 蛋白在大多數(shù)被子植物韌皮部中存在，這些蛋白在伴胞中合成，通過(guò)胞間連 絲進(jìn)入到篩管中進(jìn)而在整個(gè)植株運(yùn)輸( g o l e c k i ，1 9 9 9 ；a o k i ，2 0 0 5 ) 。r n a 的長(zhǎng)距 離運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)：r n a 結(jié)合活性、胞間連絲通道尺寸大小的可改變性、核蛋白復(fù)合 體的形成和內(nèi)源或病原菌r n a 結(jié)合等。嫁接試驗(yàn)表明c m m l e c l 7 是可運(yùn)輸?shù)捻g皮蛋 白，可以從甜瓜接穗運(yùn)輸?shù)侥瞎险枘局?，并且可運(yùn)輸性和r n a 結(jié)合活性也被證實(shí) ( g o m e z ，2 0 0 5 ) 。c m p p l 6 和c m p p 3 6 蛋白作為分子伴侶加強(qiáng)內(nèi)源m r n a 在韌皮 部的運(yùn)輸功能，南瓜的韌皮液蛋白c m n a c p m r n a 與它們的同源m r n a 分子一起 從伴胞運(yùn)輸?shù)胶Y分子( r u i z m e d r a n o 等，1 9 9 9 ；x o c o n o s t l e c a z a r e s ，2 0 0 2 ) 。 韌皮液中m r n a 和蛋白可以運(yùn)輸?shù)介L(zhǎng)距離的器官中反映出，可能存在一個(gè)機(jī)制 來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗性。而探明植物韌皮系統(tǒng)中這種發(fā)揮重要作用的相關(guān)基 因和蛋白，對(duì)于從植物個(gè)體整合的角度解析植物地上部地下部、各個(gè)器官之間如何 通過(guò)信號(hào)通訊機(jī)制相互協(xié)調(diào)其生長(zhǎng)發(fā)育及抗性調(diào)控過(guò)程有著重要的意義。 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文前言 2 油菜素內(nèi)酯及其生理作用 油菜素內(nèi)酯是美國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)家g r o v e 等( 1 9 7 9 ) 首次從油菜花粉中分離、鑒定 的一種能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的甾族化合物。迄今，油菜素內(nèi)酯作為一種新型植物生長(zhǎng)激 素，已受到人們的廣泛重視，至少己有4 0 余種與油菜素內(nèi)酯有關(guān)的化合物，從植物 中分離出來(lái)，它們總稱(chēng)為油菜素甾醇類(lèi)( b r a s s i n o s t e r o i d s ，簡(jiǎn)稱(chēng)b r s ) ( m a n d a v a 等， 1 9 8 8 ；m o o r e 等，1 9 8 9 ) 。這類(lèi)化合物的生理活性功能不同于五大類(lèi)植物激素( 生長(zhǎng) 素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯) ，因此，將它作為第六大類(lèi)植物激素( m o o r e 等，1 9 8 9 ) 。 表油菜素內(nèi)酯( e b r ) 是其中的一種。它的生理作用引起了人們的廣泛注意。 人們最初發(fā)現(xiàn)它與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，并在生理和分子生物方面進(jìn)行了 較為深入的研究。后來(lái)還發(fā)現(xiàn)b r 與植物的脅迫反應(yīng)也很密切關(guān)系，可提高植物的 抗逆性( s a t e e s hk ，2 0 0 6 ) 。 目前，b r 的主要生理功能及作用機(jī)理表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 1 促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。適宜濃度的b r 能促進(jìn)許多植物的幼莖伸長(zhǎng)，其活性 是其它激素的1 0 0 1 0 0 0 倍，但高濃度的b r 會(huì)抑制營(yíng)養(yǎng)器官的伸長(zhǎng)( 魯旭東等， 2 0 0 5 ) 。 2 提高光合速率。b r 對(duì)葉片中光合產(chǎn)物運(yùn)輸有促進(jìn)作用。可改善源一庫(kù)的關(guān)系， 能促進(jìn)同化物的運(yùn)輸和再分配( 侯雷平等，2 0 0 1 ；胡文海等，2 0 0 6 ) 。 3 保幼延衰作用。b r 有利于切花瓶插期間鮮重的保持、瓶插前期還原糖含量 的增加以及延緩花瓣和葉片質(zhì)膜透性的增大( 儲(chǔ)昭慶等，2 0 0 6 ) 。 4 提高植物的抗冷性。表油菜素內(nèi)酯在低溫下可以減緩黃瓜幼苗葉綠素的降解 和電解質(zhì)的外滲，保護(hù)生物膜，從而延緩黃瓜幼苗冷害癥狀的出現(xiàn)及生長(zhǎng)的恢復(fù)。 ( y u 等，2 0 0 2 ；丁錦新等，1 9 9 8 ；k a g a l e 等，2 0 0 7 ) 。 5 促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)開(kāi)花。b r 是首先從花粉中分離出來(lái)的，而花粉又是 b r 含量最豐富的器官，b r 還可誘導(dǎo)雌雄同株異花的西葫蘆雄花序開(kāi)出兩性花或雌 花( 谷端銀等，2 0 0 6 ) 。 6 其它生理功能。b r 能夠提高作物抗熱性、抗旱性，抗病性等。表油菜素內(nèi) 6 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文前言 酯( e b r ) 對(duì)黃瓜種子浸種2 4h ，能提高幼苗對(duì)熱激的忍耐性，降低植物水分的蒸 騰量，提高植物抗旱能力( k a g a l e 等，2 0 0 7 ) ；b r 也能提高植物對(duì)鹽害( c l o u s e ， 1 9 9 8 ) 、除草劑、藥害、真菌侵入等逆境的抵抗力( c u t k e r 等，1 9 9 1 ；k h r i p a c h 等， 1 9 9 6 ) ，因此有人將其稱(chēng)為“逆境緩和激素”( 尚慶茂等，2 0 0 6 ) 。 在逆境條件下，b r s 可能是通過(guò)減輕植株的膜脂過(guò)氧化作用，穩(wěn)定膜系統(tǒng)的結(jié) 構(gòu)與功能，減緩丙二醛( m d a ) 的積累，維持較高的抗氧化酶活性，從而減輕逆境 對(duì)植株幼苗的傷害( 朱誠(chéng)，1 9 9 6 ；c i o u s e ，1 9 9 8 ；a n u r a d h a 和r a o ，2 0 0 1 ；鄒華文 和陳鳳玉，2 0 0 1 ) 。 b r s 還可以提高植株體內(nèi)抗性物質(zhì)的含量，k u l a e v a 等( 1 9 9 1 ) 觀察到高溫脅 迫下小麥葉片細(xì)胞中的熱激蛋白顆粒( h s p s ) 以小簇聚集在一起，且b r s 處理葉片 的小簇中h s g s 的平均數(shù)目和平均大小都高于未處理葉片。b r s 處理能減少馬鈴薯 植株晚疫病菌侵染的發(fā)生，其抗性的增加與脫落酸( a b a ) 、乙烯的增加及酚類(lèi)和 萜類(lèi)物質(zhì)的變化有關(guān)( k h r i p a c h 等，1 9 9 6 ) ， 近年來(lái)，許多學(xué)者在分子水平上對(duì)b r s 誘導(dǎo)的抗逆機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。在 干旱和冷害條件下，表油菜素內(nèi)酯( e b r ) 誘導(dǎo)的抗性與抗性相關(guān)基因的表達(dá)密切 相關(guān)( k a g a l e 等，2 0 0 7 ) 。在生物脅迫中，b r 誘導(dǎo)煙草抗病性的提高與水楊酸( s a ) 誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因( p r ) 表達(dá)的增加無(wú)關(guān)，這表明b r 誘導(dǎo)的抗性機(jī)制與系統(tǒng)獲得 抗性( s a r ) 和機(jī)械傷害誘導(dǎo)抗性不同( n a k a s h i t a 等，2 0 0 3 )