（營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)專業(yè)論文）離子液體介導(dǎo)的嘔吐毒素酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究.pdf

摘要 摘要 目前，常規(guī)酶聯(lián)免疫反應(yīng)體系普遍存在靈敏度、穩(wěn)定性、特異性不夠完善等問題， 而咪唑類離子液體作為綠色反應(yīng)介質(zhì)可改善和提高酶反應(yīng)的活性、穩(wěn)定性和立體選擇 性。本課題以辣根過氧化物酶( h l 沖) 為研究對(duì)象，通過篩選結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上呈規(guī)律性遞 變的對(duì)稱性咪唑離子液體，應(yīng)用于辣根過氧化物酶催化反應(yīng)，篩選出能夠促進(jìn)h r p 活性 的友好型離子液體，將其應(yīng)用于吐毒素酶聯(lián)免疫檢測(cè)介質(zhì)體系中，與傳統(tǒng)不含該液體的 免疫檢測(cè)體系相比，該離子液體的介入能夠提高酶聯(lián)免疫檢測(cè)的靈敏度、重現(xiàn)性等特性。 首先，研究了辣根過氧化物酶( h r p ) 在含有三種離子液體1 正丁基3 甲基咪唑四氟 硼酸、1 一異丁基3 甲基咪唑四氟硼酸( 【f b m i m 】b f 4 ) 及1 仲丁基3 甲基咪唑四氟硼酸體系 中的反應(yīng)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，h r p 在含適量【i - b m i m b f 4 ( 濃度變化范圍0 0 0 3 5 9 m l , - - 0 0 17 9 m 1 ) 體系中的催化活性及穩(wěn)定性高于其他體系；反應(yīng)溫度和p h 對(duì)含離子液體的 反應(yīng)介質(zhì)中酶活力的影響規(guī)律與不含離子液體時(shí)的規(guī)律相似。與不含該離子液體的反應(yīng) 介質(zhì)相比，h r p 在含 i - b m i m b f 4 的體系中催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率( ) 和米氏常 數(shù)( ) 均升高。 其次，通過e d c 法合成d o n 完全抗原，d o n 與b s a 的初始摩爾比為7 0 ：1 ，得到d o n 完全抗原中d o n 與b s a 的摩爾比為1 1 8 ：1 。通過紅外光譜掃描以及e l i s a 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 d o n b s a 的偶聯(lián)成功。用d o n b s a 免疫新西蘭大白兔，得到抗體的最高效價(jià)為5 1 2 0 0 。 利用間接競(jìng)爭(zhēng)免疫方法得到最佳抗原抗體工作濃度分別為1 ：1 0 0 和1 ：6 4 0 0 ，進(jìn)一步得到其 i c s o 值為5 4 9 5 n g m l 。 最后，將【f b m i m b f 4 離子液體應(yīng)用于d o n 酶聯(lián)免疫檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)體系中該 離子液體的濃度為0 0 1 4 9 m l 時(shí)，其i c 5 0 值為3 3 1 1 n g m l ，比不含該液體時(shí)靈敏度提高 了約3 9 7 ；測(cè)定體系中離子液體濃度為0 和0 0 1 4 9 m l 時(shí)各孔的的重現(xiàn)性試驗(yàn)，兩者 的變異系數(shù)分別為3 9 9 和1 1 4 ，表明離子液體的介入提高了反應(yīng)的重現(xiàn)性。另外， 做了啤酒樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，當(dāng)體系中含有 f b m i m b f 4 濃度為0 0 1 4 9 m l 時(shí)，其樣品 加標(biāo)回收率為9 3 1 - - - 9 8 6 ，變異系數(shù)平均值為5 o ，比不含離子液體時(shí)提高了約十個(gè) 百分點(diǎn)。 關(guān)鍵詞：辣根過氧化物酶；離子液體；嘔吐毒素；l 一異丁基一3 一甲基咪嘩四氟硼酸；酶聯(lián) 免疫檢測(cè) a b s t r a c t a b s t r a c t t h e r eo f t e ne x i s t sm a n yi m p e r f e c ti s s u e si ne n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ，s u c ha ss e n s i t i v i t y ，s t a b i l i t y ，s p e c i f i c i t ya n do t h e ri s s u e sa n ds oo n a so n ek i n do f g r e e nr e a c t i o nm e d i u m ，i m i d a z o l ei o n i cl i q u i d s ( i l s ) c a ni m p r o v ea n de n h a n c et h ea c t i v i t yo f e n z y m er e a c t i o n s t a b i l i t y ，a n ds t e r e o s e l e c t i v e b u tt h ei m p a c to ft h el a wi sn o tc l e a rn o w h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) i st h em o s tc o m m o n l yu s e di ne n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( e l i s a ) i nt h es u b j e c t 。f i l t e r e das e r i e so fs t r u c t u r ea n dt h en a t u r eo ft h es y m m e t r yo f r e g u l a r l yg r a d e di m i d a z o l ei o n i cl i q u i d s ，a p p l i e dt h e mt oh o r s e r a d i s ho x i d e c a t a l y z e dr e a c t i o n ， a n dt h e ns e l e c t e do n ek i n do ff r i e n d l yi l sa g a i n s th r p a n dt h e nu s e di ti nt h e d e o x y n i v a l e n o l ( d o n ) e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a ym e d i as y s t e m c o m p a r e dw i t l l t h et r a d i t i o n a “m m u n es y s t e mt h a tt h et h et h i si o n i cl i q u i dw a sn o ti n v o l v e di n s e n s i t i v i t y r e p r o d u c i b i l i t ya n do t h e rc h a r a c t e r i s t i c sw a si m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y f i r s t l y ，t h er e s p o n s ec h a r a c t e r i s t i c so fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) i ns u c hs y s t e m s c o n t a i n i n gc o n t a i n i n gl b u t y l - 3 一m e t h y l i m i d a z o l i u mt e t r a f l u o r o b o r a t e ，1 - i s o b u t y l 一3 - m e t h y l i m i d a z o l i u mt e t r a f l u o r o b o r a t e ( 【f - b m i m b f 4 ) a n d1 - b u t y l 一3 一m e t h y l i m i d a z o l i u mw a s s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ec a t a l y t i ca c t i v i t ya n ds t a b i l i t yo fh i 心i sb e t t e rt h a no t h e r s y s t e m s ，w h e ni tc o n t a i n e da p p r o p r i a t e 【i - b m i m b f 4 ( 0 0 0 3 5 9 m lt oo 0 17 9 m 1 ) i nt h es y s t e m a n dt h el a wo ft e m p e r a t u r ea n dp hi n f l u e n c i n go nh r pi ss i m i l a rt ot h es y s t e mt h a t 【i - b m i m b f 4w a sn o tc o n t a i n e d a n dc o m p a r e dw i t hn o n - i o n i cl i q u i dr e a c t i o nm e d i u m ，t h e v m a xa n dk mo fh r pw e r ei n c r e a s e d s e c o n d l y t h ec o n j u g a t i o no fd o na n db o v i n es e r u ma l b u m i nb s aw e r ep r o d u c e d a c c o r d i n gt ot h em e t h o do fe d cc a t a l y z e a n dt h ei n i t i a lm o l a rr a t i oo fd o n a n db s aw a s 7 0 ：1 ，c o m p a r e dt ot h em o l a rr a t i oo f “8 ：li nt h ec o m p l e t ea n t i g e n t h r o u g hi n f r a r e d s p e c t r o s c o p ya n dt h ee l i s at e s t ，v e r i f i e dt h ec o u p l i n go fd o n b s ai ss u c c e s s f u l u s i n gt h e t h er a b b i t sw e r ei m m u n i z e db yi n i e c t i o no fd o n b s a ，t h em o s te f f e c t i v ea n t i b o d yw a s a b o u t5l ，2 0 0 t h r o u g hi n d i r e c tc o m p e t i t i v ei m m u n o a s s a ym e t h o d 。t h eb e s tw o r k c o n c e n t r a t i o no fa n t i g e n - a n t i b o d ya n d a n t i g e nw a s1 ：6 4 0 0a n d l 10 0r e s p e c t i v e l y ，a n di t si c 5 0 v a l u ew a sa b o u t5 4 9 5 n g m 1 f i n a l l y ， i - b m i m b f 4i o n i cl i q u i d sw a su s e di nd o n e l i s a t h er e s u l t ss h o w e dt h a t w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft h i si o n i cl i q u i dw a so 014 9 m li nt h es y s t e m t h ei c 5 0v a l u eo fw a s a b o u t3 31 1n g m 1 w h o s es e n s i t i v i t yw a si n c r e a s e da b o u t3 9 7 t h a nt h a tt h el i q u i dw a sn o t c o n t a i n e d d e t e r m i n a t i o no ft h er e p r o d u c i b i l i t yo fe x p e r i m e n t s w h e nc o n t e n to fi o n i cl i q u i d i nt h es y s t e mw e r e0 014 9 m la n do g m 1 t h e i rc o e f f i c i e n t so fv a r i a t i o nw e r e1 14 a n d3 9 9 i ti n d i c a t e dt h a tt h ei n v o l v e m e n to fi o n i cl i q u i d si m p r o v e dt h er e p r o d u c i b i l i t yo ft h er e a c t i o n i na d d i t i o n ，s a m p l e so fb e e rs t a n d a r da d d i t i o nr e c o v e r ye x p e r i m e n tw a sm a d e a n dt h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es a m p l er e c o v e r yw a s9 3 1 9 8 6 w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f f - b m i m l b f 4w a s0 014 9 m lt h es y s t e m ，a n dt h ea v e r a g ec o e f f i c i e n to fv a r i a t i o no f5 0 ，w h i c hw a s i n c r e a s e db ya b o u t10p e r c e n t a g ep o i n t st h a nt h i st i o n i cl i q u i d sw a sn o tc o n t a i n e d k e y w o r d s ：h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ； i o n i c l i q u i d s ；d e o x y n i v a l e n o l ； a b s t r a c t 1 一i s o b u t y l - 3 - m e t h y l i m i d a z o l i u mt e t r a f l u o r o b o r a t e ；e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取 得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文 中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含本人為獲得江南 大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我- - n 工作的同志 對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 簽 名：奎壘寶 日 期： 迎宰，i 目 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定： 江南大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允 許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫 進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文， 并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。 保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 簽名：奎壘室導(dǎo)師簽名：邋選 日 期： 醴13 ：瑪 1 引言 1 引言 1 1 離子液體簡介 室溫離子液體【l j 是由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成的、在室溫或室溫附近溫 度下呈液體狀態(tài)的鹽類，以下簡稱離子液體。它是從傳統(tǒng)的高溫熔鹽演變而來的，但與 一般的離子化合物有著非常不同的性質(zhì)和行為，最大的區(qū)別在于一般離子化合物只有在 高溫狀態(tài)下才能變成液態(tài)，而離子液體在室溫附近很大的溫度范圍內(nèi)均為液態(tài)，最低凝 固點(diǎn)可達(dá)9 6 0 c 【2 j 。近年來，作為一類環(huán)境友好的化合物，室溫離子液體的研究備受關(guān)注。 離子液體又稱室溫熔融鹽，是在室溫及相鄰溫度下完全由離子組成的有機(jī)液體物質(zhì)，其 具有一系列的優(yōu)點(diǎn)：幾乎沒有蒸汽壓，不揮發(fā)，無色，無嗅，具有較大的液相范圍，較 好的化學(xué)穩(wěn)定性和較寬的電化學(xué)窗口。通過對(duì)正、負(fù)離子的設(shè)計(jì)，可以合成各種對(duì)無機(jī) 物、有機(jī)物和聚合物的溶解性不同的室溫離子液體。室溫離子液體這些特殊性能，不僅 為化學(xué)研究提供了一個(gè)嶄新領(lǐng)域，而且對(duì)解決現(xiàn)代工業(yè)帶來的環(huán)境污染問題將會(huì)有突破 性進(jìn)展，是一種理想的綠色化學(xué)溶劑1 3 5 1 。 近年來，離子液體作為綠色反應(yīng)介質(zhì)已成功地用于某些酶催化反應(yīng)。z h a o 等【6 】研究 了不同介質(zhì)中枯草桿菌蛋白酶( a l c a l a s e ) 催化n 乙酰氨基酸酯水解反應(yīng)；l a s z l o 等研究了 c i 胰凝乳蛋白酶在離子液體中催化n 乙酰l 苯丙氨酸乙酯與1 丙醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)；l a u 掣7 j 研究了脂肪酶( c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s eb ) 在 b m i m b f 4 中催化辛酸乙酯和辛酸的氨 解反應(yīng)；k i m 等埔j 報(bào)道了皺落假絲酵母脂肪酶( c a n d i d ar u g o s al i p a s e ) 在兩種離子液體 【b m i m p f 6 和 m o e m i m p f 6 催化糖的選擇性?；磻?yīng)；o k r a s a = 等【9 】將離子液體【b m i m 】p f 6 作為反應(yīng)介質(zhì)用于葡萄糖氧化酶過氧化物酶催化硫化物立體選擇性氧化反應(yīng)。在許多 情況下，酶在離子液體中的催化活性、( 立體、區(qū)域) 選擇性及穩(wěn)定性與在傳統(tǒng)的水相介 質(zhì)或有機(jī)介質(zhì)中有較大的差異，一些酶的活性及選擇性甚至得到了提高。例如，以含離 子液體的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)，木瓜蛋白酶催化對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯不對(duì)稱水解反 應(yīng)的酶活性、對(duì)映選擇性及穩(wěn)定性均顯著提高【l0 1 。因此，以離子液體或含離子液體的混 合體系為反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行酶催化反應(yīng)已引起廣泛關(guān)注，有關(guān)研究進(jìn)展迅速。但除了 心z y s z t o 辟1 1 1 在離子液體 b m i m p f 6 中研究了過氧化物酶和葡萄糖氧化酶對(duì)硫代苯甲醚 的催化氧化特性之外，迄今未見辣根過氧化物酶在1 異丁基3 甲基瞇唑四氟硼酸反應(yīng)介 質(zhì)中催化活性的研究報(bào)道。近年來，離子液體已在分析化學(xué)獲得廣泛應(yīng)用 1 2 1 3 】。有研究 表明，離子液體常作為一些特殊的溶劑被應(yīng)用于分析檢測(cè)中f l4 1 。李在均等【1 5 】研究了新型 1 烷基2 ，3 二甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體過氧化氫酶電極電化學(xué)性能與應(yīng)用。s h e i l a n b a k e re ta l i j6 j 研究發(fā)現(xiàn)，一些半抗原、抗體在含有適量離子液體的溶液及崮相載體上 仍具有較高的親和力和識(shí)別能力。 目前，國內(nèi)外有關(guān)離子液體的研究主要集中在離子液體的制備【1 7 。9 1 、物理和化學(xué)性 質(zhì)的表征【2 m 2 、催化合成反應(yīng)【2 2 _ 2 3 1 、電化學(xué)0 2 4 。2 7 1 等方面。離子液體物性的研究是其應(yīng)用 于反應(yīng)、分離和免疫電化學(xué)等工業(yè)過程的前提，也是最基本、最黿要的研究課題，這方 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 面的研究報(bào)道近年呈迅速增加趨勢(shì)。離子液體作為溶劑或催化劑已成為綠色化學(xué)的重要 組成部分。 1 2 脫氧雪腐鐮刀茵烯醇簡介 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇( d e o x y n i v a l e n o l ；縮寫d o n ) ) ，又稱嘔吐毒素( v o m i t o x i n ) 屬單端孢 霉烯族化合物。最早于1 9 7 0 年在日本香川縣的一次赤霉病大麥中毒的病毒中發(fā)現(xiàn)，1 9 7 2 年，由日本的m o r o o k a 等首次從赤霉病大麥中分離，y o s h i z a w a 等闡明了這種新的真 菌毒素的結(jié)構(gòu)，并將其命名為4 - - d e o x y n i v a l e n o l ( d o n ) 。1 9 7 3 年v e s o n d e r 等在美國從被 鐮刀菌污染的玉米中分離出了同樣的化學(xué)物質(zhì)，因?yàn)樵摲N物質(zhì)可以引起豬產(chǎn)生嘔吐癥 狀，故命名為嘔吐毒素1 2 8 - 2 9 l 。目前，研究資料表明，d o n 主要由鐮刀菌屬f u s a r i u m 的幾 個(gè)種產(chǎn)生，尤其是禾谷鐮刀菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) 和黃色鐮刀菌( f u s a r i u m c u l m o r u m ) 【3 0 1 。 ：。d h 霉 一” 圖1 一ld o n 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 f i gl 一1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fd o n d o n 的化學(xué)名稱為3q ，7q ，1 5 一三羥基草鐮孢菌9 烯8 酮，分子式為c 1 5 h 2 0 0 6 ，分 子量2 9 6 3 。屬于b 型單端孢霉烯族化合物，其結(jié)構(gòu)如圖1 1 所示。 1 2 1d o n 的理化性質(zhì) ：。 d o n 的結(jié)晶為無色針狀，熔點(diǎn)為1 5 1 1 5 3 ，不飽和酮基的存在使得其在短波紫外下 有吸收峰，但與許多其它物質(zhì)在此處的紫外吸收峰相重疊，屬非特征性的。d o n 易溶于 極性的溶劑如水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，不溶于正己烷和乙醚。d o n 耐熱、耐壓，在弱酸中部不分解，加堿、高壓以及熱蒸汽的處理可以破壞其部分毒力1 3 1 1 。 d o n 在甲醇中不穩(wěn)定，2 2 天后被轉(zhuǎn)化為其它產(chǎn)物1 32 。d o n 的耐藏力也很強(qiáng)，據(jù)報(bào)道病 麥經(jīng)四年的貯藏，其中的d o n 仍能保留其原有的毒性。 嘔吐毒素( d o n ) 屬于小分子半抗原，有免疫反應(yīng)性，無免疫原性，只有將其與大 分子載體蛋白偶聯(lián)，才能作為免疫原，這種人為制備的小分子半抗原與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物 稱為人工抗原?？捎玫妮d體蛋白有牛血清白蛋白( b s a ) 、兔血清白蛋白( r s a ) 、牛 甲狀腺球蚩白( b t g ) 以及雞卯清白蛋白( o v a ) 等，其中以b s a 、o v a 最為常用 3 3 1 。 1 引言 蛋白質(zhì)和半抗原的結(jié)合是通過游離的氨基、羧基、酚基、巰基、咪唑基、吲哚基和胍基 等活性基團(tuán)的縮合。連接的方法有物理法和化學(xué)法，物理吸附的載體有淀粉、聚乙烯吡 咯烷酮、硫酸葡聚糖、羧甲基纖維素等，是通過電荷和微孔吸附半抗原?；瘜W(xué)法是利用 功能基團(tuán)把半抗原連接到載體上，常用的方法有戊二醛法、碳二亞胺法、活潑酯法、亞 胺酸酯法和鹵代硝基苯法等【3 4 1 。半抗原與載體連接時(shí)應(yīng)該注意：帶游離氨基或游離羧基 以及兩種基團(tuán)都有的半抗原，羧基可用混合酸酐法和碳化二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定 的肽鍵。同樣，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合；帶有羥基、酮基、醛基的半抗原， 如醇、酚、多糖、核酸以及淄族激素等，它們都不能直接與載體蛋白相連接，需要用化 學(xué)法在半抗原上引入羧基后才能與載體相連接；芳香族半抗原由于環(huán)上帶有羧基，它鄰 位上的氫很活潑，極易取代。根據(jù)嘔吐毒素本身的結(jié)構(gòu)特性，需要用化學(xué)方法在嘔吐毒 素上引入羧基后才能與載體相連，然后應(yīng)用碳二亞胺法合成完全抗原1 3 5 1 ，該法可分為兩 種，一種是在有機(jī)相中進(jìn)行反應(yīng)的二環(huán)已基碳二亞胺法( d i c y l o c h e x y l c a r b o d i i m i d e ，簡稱 d c c ) ，另一種是在水相中進(jìn)行反應(yīng)的對(duì)乙基一n ，n 一二甲基丙基碳二亞胺法 ( 3 m e r c a p t o p r o p i o n i ca c i d ，1 - e t h y l - 3 一( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e ，簡稱e d c ) 。 d c c 法需要在嚴(yán)格的無水條件下進(jìn)行反應(yīng)，所用的有機(jī)溶劑需預(yù)先脫水處理，需要干燥 的反應(yīng)環(huán)境；e d c 法可以直接在水相中進(jìn)行，但e d c 需要超低溫( - 2 0 ) 避光保存。 1 2 2d o n 的危害及其作用機(jī)制 1 2 2 1d o n 對(duì)植物的危害 姚泉洪等( 1 9 9 1 ) 研究指出，d o n 在病麥粒水浸濾液體積百分比大時(shí)可抑制小麥芽 鞘生長，體積百分比小時(shí)卻促進(jìn)其生長。黃曉敏等( 1 9 9 1 ) 指出，d o n 在高濃度下可導(dǎo) 致原生質(zhì)膜損傷而使原生質(zhì)體失活，降低存活率，而低濃度時(shí)卻能提高存活率。劉宗鎮(zhèn) 等( 1 9 9 1 ) 研究指出，在小麥組織培養(yǎng)中，適當(dāng)體積的d o n 具有抑制誘導(dǎo)小麥愈傷組織 的效應(yīng)，從而促進(jìn)愈傷組織根分化和再生植株的生長，說明d o n 具有類生長激素的作用。 1 2 2 2d o n 對(duì)人和動(dòng)物的危害 動(dòng)物的急性毒性與動(dòng)物的種類、年齡、性別和給藥途徑有關(guān)。動(dòng)物種屬差異較大， 中毒的癥狀可能有所不同。比如，馬、豬、猴、兔子、貓和鴿子對(duì)d o n 毒素很敏感，極 易出現(xiàn)中毒癥狀，但牛、羊和成年的雞、鴨就非常不敏感。雄性動(dòng)物比較敏感，經(jīng)口毒 性小于皮下注射，對(duì)于不同動(dòng)物的半數(shù)致死量( l d 5 0 ) 如下表1 1 所示1 3 圳。動(dòng)物的d o n 急性中毒癥狀主要表現(xiàn)為站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍、嘔吐、食欲下降等。一般毒素灌胃1 - 6 天動(dòng)物死亡，生理解剖可見胃粘膜充血脫落1 37 。豬對(duì)d o n 最敏感，尤其是母豬，主要是 采食量降低，甚至拒食和嘔吐。 人的急性中毒癥狀是胃部不適、惡心、嘔吐、頭痛、頭暈、腹痛、腹瀉等。還可有 全身無力、口干等癥狀，少數(shù)患者有發(fā)燒、顏面潮紅等癥狀。急性中毒死亡者較少。 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 表1 1 不同染毒途徑的l d 5 0 t a b 1 - 1l d s of o rd i f f e r e n tc o n t a m i n a t i n gw a y s 1 2 2 3d o n 的致嘔吐作用 幾乎所有的單端孢霉烯族毒素都有可引起鴨雛、貓、狗、豬、鴿子等動(dòng)物的嘔吐。 豬對(duì)d o n 的致吐作用最敏感，約為其他動(dòng)物的1 0 0 2 0 0 倍。d o n 還可引起拒食反應(yīng)， 其對(duì)于不同動(dòng)物的致吐劑量如表1 2 所示。致嘔吐作用的機(jī)理除了d o n 對(duì)粘膜的刺激 作用外，同時(shí)也有對(duì)中樞神經(jīng)的作用1 36 | 。國內(nèi)曾有人以含d o n 毒素1 8 - 2 0 m g k g 的赤霉 病小麥，按0 5 5 0 的不同比例混入飼料中，喂養(yǎng)大鼠1 8 個(gè)月，發(fā)現(xiàn)高比例組動(dòng)物睪 丸、子宮、肝、腎臟受到一定的損害。 表1 2 不同染毒途徑的d o n 致吐劑量 t a b 1 - 2v o m i t i n gd o s eo fd o ni nd i f f e r e n tw a y s 1 2 2 4d o n 的細(xì)胞毒性 d o n 具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，對(duì)原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、植物細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等均具 有明顯的毒性作用。p r e l u s k y 等1 9 9 2 年報(bào)道，豬喂給嘔吐毒素，能提高腦中5 羥色胺 ( s e r o t o n i n ) 和5 一羥引哚乙酸( 5 一h y d r o x y i n d 0 1 e a c e t i ca c i d ) 的濃度，對(duì)腦神經(jīng)產(chǎn)生麻痹 作用。p r e l u s k y 等1 9 9 3 年進(jìn)一步證明，即使是低劑量的d o n 就能引起豬腦中5 羥引哚 乙酸水平的提高【3 8 j 。 1 2 2 5d o n 的遺傳毒性 長期攝入被d o n 污染的病麥或粗毒素對(duì)動(dòng)物有一定的毒性，可影響動(dòng)物的生長、繁 殖率和子代的1 字活率，甚至呵使生長停滯，形成“僵鼠”，并產(chǎn)生對(duì)心、肝、腎的傷害， 嚴(yán)霞時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡。但不同種屬、性別的動(dòng)物對(duì)d o n 的敏感程度不一，豬足 最敏感的動(dòng)物，反芻動(dòng)物比其它動(dòng)物受的影響小，奶牛的健康狀況、產(chǎn)奶量、攝食量幾 乎不受影響，牛奶中也槍測(cè)不至i j d o n 及其脫氧產(chǎn)物【3 9 1 。 4 i 引言 1 2 2 6d o n 的免疫毒性 研究表明，d o n 可能對(duì)免疫系統(tǒng)有影響。d o n 既是一種免疫抑制劑，又是一種免疫 促進(jìn)劑，其作用與劑量有關(guān)。在體內(nèi)d o n 可以抑制對(duì)病原體的免疫應(yīng)答，同時(shí)又可以誘 發(fā)自身的免疫反應(yīng)。d o n 引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的疾病與人類i g a 腎病及其相似，同時(shí) d o n 還可以誘發(fā)輔助性t 細(xì)胞超誘導(dǎo)產(chǎn)物細(xì)胞因子的產(chǎn)生，激活巨噬細(xì)胞、t 細(xì)胞產(chǎn)生 炎癥前細(xì)胞因子【4 0 】。 1 2 2 7d o n 的三致( 致癌、致畸、致突變) 作用 國內(nèi)外對(duì)此研究結(jié)果不太一致，但多數(shù)研究結(jié)果均表明d o n 具有致畸、胚胎毒性， 可能是一種潛在的致癌物質(zhì)。d o n 的誘癌實(shí)驗(yàn)尚未成功，國內(nèi)外也無其致癌作用的明確 報(bào)道，因此其致癌作用尚無定論。但流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，d o n 與食管癌的發(fā)病率呈正相 關(guān)【4 1 1 。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，長時(shí)間小劑量喂食被嘔吐毒素污染的飼料，可以誘發(fā)不同器官 的腫瘤。i s e r s o n 等進(jìn)行的d o n 慢性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物發(fā)生肝癌1 4 2 。l a m b e rl a 等用大鼠進(jìn)行了d o n 兩階段皮膚誘癌、促癌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明d o n 不是一種致癌劑或誘 癌劑，但皮膚組織學(xué)發(fā)現(xiàn)d o n 誘發(fā)彌漫性磷狀上皮增生【4 3 1 。v e s e l y 等研究t d o n 對(duì)三日 齡雞胚的毒性作用，經(jīng)8 天孵化后發(fā)現(xiàn)d o n 的毒性作用劑量范圍很窄，為1 - 3 m g k g 體重， 實(shí)驗(yàn)組雞胚有頭部畸形、身體發(fā)育畸形，畸形率明顯高于對(duì)照組】。 1 2 3d o n 的污染情況 d o n 的污染廣泛存在于全球各國，中國、日本、美國、前蘇聯(lián)、南非等均有報(bào)道。 d o n 主要污染小麥、大麥、燕麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，如面包、餅干、 麥制點(diǎn)心等。另外，在動(dòng)物的奶、蛋中均有發(fā)現(xiàn)d o n 殘留。d o n 對(duì)于糧谷類的污染狀 況與產(chǎn)毒菌株、溫度、濕度、通風(fēng)、日照等因素有關(guān)。小麥赤霉病主要分布在潮濕的溫 帶地區(qū)，我國大部分地區(qū)又恰恰處于這一地帶，這是我國d o n 污染較嚴(yán)重的原因之一， 在多雨年份d o n 的污染狀況則更為嚴(yán)重，赤霉病麥中毒也是我國最主要的真菌性食物中 毒之一，這也越來越引起了人們的重視。 d o n 毒性較低，但它最易出現(xiàn)，廣泛存在于溫?zé)釒У貐^(qū)的飼料中，因此在谷物中d o n 中毒發(fā)病率最高。例如：在日本，小麥和大麥中的d o n 濃度為4 0 p p m ：在加拿大，安大 略地區(qū)白色冬小麥中的d o n 濃度為8 5 p p m 。對(duì)一些亞洲國家的未加工的農(nóng)產(chǎn)品和加工過 的飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，中國的飼料樣本中，含有一定量的嘔吐毒素。超過7 0 的 樣本被嘔吐毒素污染。2 0 0 0 年的樣本中嘔吐毒素的最高含量達(dá)到4 5 8 2 垤k g l 4 5 1 。2 0 0 3 年 中國配合飼料樣品中嘔吐毒素的陽性檢出率為1 0 0 ，平均含量為6 0 0 燦g k g ；據(jù)報(bào)道，2 0 0 5 年中國飼料原料的嘔吐毒素檢出率為1 0 0 ，對(duì)人類的健康產(chǎn)生威脅。美國食品及藥物 管理局( f d a ) 規(guī)定食物中嘔吐毒素的安全標(biāo)準(zhǔn)是l0 0 0 1 a g k g ，嘔吐毒素的含量超過 l 0 0 0 垤l ( g 就會(huì)對(duì)人及一些動(dòng)物健康產(chǎn)生損害1 4 剛。 1 2 4d o n 的檢測(cè) 目前，檢鋇j j d o n 的方法很多，主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的與要求來確定選擇哪種方法。 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 真菌毒素含量的檢測(cè)方法可分為3 類：( 1 ) 生物學(xué)檢測(cè)法，包括皮膚毒性實(shí)驗(yàn)、致嘔吐實(shí) 驗(yàn)、種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)等；( 2 ) 理化檢測(cè)方法，包括層析、氣相色譜、液相色譜、氣( 液) 質(zhì)聯(lián)用等；( 3 ) 免疫化學(xué)檢測(cè)法，目前較為常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( e l i s a ) 。 1 2 4 1 薄層色譜法( t l c ) 這是g b t 5 0 0 9 1 1 1 - 2 0 0 3 采取的谷物及其制品中嘔吐毒素的檢測(cè)方法，其檢測(cè)限為 l m g k g 。適用于谷物( 小麥、玉米、大麥等) 及其制品( 蛋糕、餅干、面包等) 和中嘔吐 毒素的測(cè)定。谷物及其制品中的嘔吐毒素經(jīng)乙腈水( 8 4 ：1 6v 廠v ) 提取、凈化、濃縮和硅膠 g 薄層展開后，加熱薄層板。在制備薄層板時(shí)加入三氯化鋁，使d o n 在波長3 6 5 n m 紫外 光下顯藍(lán)色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。 1 2 4 2 高效液相色譜法( h p l c ) d o n 經(jīng)h p l c 分離后可用熒光檢測(cè)器( n u o r e s c e n c e d e t e c t o r ，f l d ) 、紫外檢測(cè)器( u l t r a v i o l e td e t e c t o r ，u v ) 、二極管陣列檢測(cè)儀( d i o d ea r r a yd e t e c t o r ，d a d ) 檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明， d a d 比f l d 的效果好：不需衍生；d a d 最低檢出限比f l d 要低；d a d 檢測(cè)比f l d 響應(yīng)強(qiáng)。 2 0 0 1 年m a t e o 使用d a d 的最低檢出限可達(dá)5 1 a g k g ，而f l d 的最低檢出限為2 5 r t e d k g 。谷物 中d o n 的h p l c - u v 的最低檢出限可達(dá)1 0 0 1 6 0 0 p , g k g ；h p l c - m s 可達(dá)1 2 4 0 1 t g k g ； h p l c f l d 可達(dá)2 0 r t g k g 。 1 2 4 3 氣相色譜法( g c ) 運(yùn)用氣相色譜檢測(cè)d o n 需要通過d o n 上的三個(gè)羥基使之衍生成為七氟丁酰 ( h e p t a f l u o r o b u t y r y l ，h f b ) 、三氟乙酰( t r i f l u o r o a c e t y l ，t f a ) 或三甲基硅烷( t r i m e t h y l s i l y l ， t m s ) 化衍生物。 1 2 4 4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 免疫酶技術(shù)( e i a ) 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的與游離的酶標(biāo)記物而 分為均相( h o m o g e n o u s ) 和異相( h e t e r o g e n o u s ) 兩種類型。在異相法中，又包括液相 異相酶免疫測(cè)定和固相酶免疫測(cè)定二種。固相酶免疫測(cè)定也稱為e l i s a ，是目前臨床檢 驗(yàn)中應(yīng)用較廣的免疫測(cè)定方法。 小分子的e l i s a 測(cè)定法一般有三種競(jìng)爭(zhēng)分析模式：包被特異性抗體直接競(jìng)爭(zhēng)法【4 7 1 、 包被抗原直接競(jìng)爭(zhēng)法以及間接競(jìng)爭(zhēng)法【4 9 5 1 】( 也稱為抑制性測(cè)定法【5 2 】) 。間接競(jìng)爭(zhēng)e l i s a 法的基本步驟是：包被完全抗原同時(shí)加入已知抗體和待測(cè)抗原加入酶標(biāo)二抗一 一加入底物顯色液。該法主要應(yīng)用于未知抗原的檢測(cè)。 1 2 5 目前的各種檢測(cè)方法的比較 薄層色譜法t l c 雖然操作簡便，曾被廣泛應(yīng)用，但是，處理樣品時(shí)工作量大；在檢測(cè) 過程中操作人員必須直接接觸標(biāo)準(zhǔn)品，危害到操作人員的身體健康，而且本方法在提取 過程中需要使用大量的有機(jī)溶劑，這樣就會(huì)對(duì)劇圍環(huán)境也會(huì)產(chǎn)生彳i 利影響；靈敏度差， 提高靈敏度必須改進(jìn)樣品的提取和凈化方法，改進(jìn)和提高薄層色譜分析性能，這樣就增 6 1 引言 加了勞動(dòng)強(qiáng)度和檢測(cè)成本。 高效液相色譜法( h p l c ) 和氣相色譜( g c ) 可以精確地對(duì)樣品中的嘔吐毒素進(jìn)行定性 定量分析。但這兩種方法所需色譜儀、檢測(cè)器等價(jià)格昂貴，而且樣品前處理比較復(fù)雜， 操作時(shí)需要專門的技術(shù)人員，不便推廣應(yīng)用。另外，它們也不適合大批量樣品的檢測(cè)。 酶聯(lián)免疫吸附法( e l i s a ) 快速、靈敏、準(zhǔn)確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器 設(shè)備，且對(duì)樣品純度要求不高，特異性強(qiáng)，特別適用于大批量樣品的檢測(cè)，發(fā)展非常迅 速。簡化了樣品預(yù)處理和純化過程。但是由于免疫酶的活性非常不穩(wěn)定，在應(yīng)用過程中 很容易受到操作條件的影響，反應(yīng)試劑需低溫保存。在實(shí)際操作過程中很難達(dá)到這一要 求，使得免疫酶的活性大大降低，從而影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)用時(shí)還必須通過多次洗 滌，才能使反應(yīng)產(chǎn)物和游離底物進(jìn)行分離，影響到結(jié)果的重復(fù)性，而且檢測(cè)時(shí)間較長， 無法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。 1 - 3 本課題的意義及主要研究內(nèi)容 近幾年來，食品安全成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。嘔吐毒素( d o n ) 是植物真菌產(chǎn)生的有 害次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧 食制品，人和動(dòng)物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。另外，它 還常與其它的霉菌毒素如黃曲霉毒素共同污染農(nóng)作物，進(jìn)入人體后可以相互影響，對(duì)人 類的健康構(gòu)成了很大的威脅。為了降低嘔吐毒素對(duì)人類的危害，各國不斷制定盡可能低 的食品中嘔吐毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，通過質(zhì)檢機(jī)構(gòu)進(jìn)行監(jiān)督實(shí)施。酶聯(lián)免疫吸附法( e l i s a ) 始于二十世紀(jì)七十年代，是一種把抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有 機(jī)結(jié)合起來的檢測(cè)技術(shù)。將特定的抗原或抗體吸附于聚苯乙烯微孔板( 或其它固相載體) 上，是進(jìn)行此類分析的前提，且后續(xù)測(cè)定結(jié)果的好壞，與免疫分子固相化狀況密切相關(guān)。 現(xiàn)行的固相免疫測(cè)定中抗體( 抗原) 分子在固相載體的固定主要基于被動(dòng)的物理吸附， 游離物和標(biāo)記結(jié)合物的分離必須通過多次反復(fù)洗滌，存在分析時(shí)間偏長、靈敏度較低、 結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度不夠穩(wěn)定等等問題，而限制了方法的進(jìn)一步應(yīng)用?？乖c抗體的 特異結(jié)合，主要是基于抗原和抗體表位( 決定簇) 分子結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型的互補(bǔ)，以及由 多種因素造成二者分子間引力參與下發(fā)生的可逆性免疫反應(yīng)；酶與底物的相互作用也具 有高度特異性，其催化過程也依賴于與底物相互作用的界面效應(yīng)。而傳統(tǒng)e l i s a 所用的 不均相介質(zhì)體系不能為毒素抗體、抗原和酶的活性保持或發(fā)揮提供最佳的微環(huán)境，選用 能夠提高檢測(cè)特性友好型反應(yīng)介質(zhì)有望使上述問題得到很好的解決。 因此，本課題擬在前期工作的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建在結(jié)構(gòu)、組成及性質(zhì)上呈規(guī)律性遞變的 烷基咪唑類離子液體，通過篩選結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上呈規(guī)律性遞變的對(duì)稱性咪唑離子液體，將 其應(yīng)用于辣根過氧化物酶催化反應(yīng)及嘔吐毒素酶聯(lián)免疫檢測(cè)的介質(zhì)體系。初步研究友好 型離子液體微環(huán)境特性( 內(nèi)部極性、p h 、粘性、碳鏈團(tuán)簇行為和表面研究層離子分布等) 對(duì)辣根過氧化物酶、酶標(biāo)二抗或抗體結(jié)構(gòu)的影響；建立嘔吐毒素酶聯(lián)免疫反應(yīng)模型，通 過分析友好型離子液體中酶活性、二抗穩(wěn)定性、抗體效價(jià)和反應(yīng)特異性，考察離子液體 對(duì)免疫反應(yīng)的影響規(guī)律性，為成功構(gòu)建離子液體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)體系奠定理論基礎(chǔ)。 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 課題綜合免疫化學(xué)和綠色化學(xué)工程兩學(xué)科知識(shí)的特點(diǎn)，從方法、原理及應(yīng)用基礎(chǔ)展 開交叉綜合研究，為建立新的快速檢測(cè)方法打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。研究成果將為設(shè)計(jì)生 物友好型離子液體提供理論基礎(chǔ)，為真菌毒素免疫分析領(lǐng)域，乃至整個(gè)酶聯(lián)免疫方法學(xué) 領(lǐng)域的研究提供一條新思路，項(xiàng)目完成對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的市場(chǎng)監(jiān)督、進(jìn)出口檢驗(yàn)，以及消除西 方國家針對(duì)我國的“技術(shù)壁壘”都具有重要的意義。 本論文主要研究內(nèi)容： 選擇結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上呈規(guī)律性遞變的對(duì)稱性咪唑離子液體，將其應(yīng)用于辣根過氧 化物酶( h r p ) 催化反應(yīng)，從中篩選出促進(jìn)酶活力的友好型離子液體，初步研 究h r p 在含有該離子液體體系中的反應(yīng)規(guī)律和機(jī)制。 利用生物合成方法制備嘔吐毒素完全抗原，并驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)以及免疫原性；免疫 新西蘭大白兔獲得抗嘔吐毒素多克隆抗體，然后對(duì)其純化以及鑒定。 建立嘔吐毒素酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系，對(duì)相關(guān)參數(shù)優(yōu)化，建立最佳的檢測(cè)條件；將 篩選出的友好型離子液體應(yīng)用于e l i s a 檢測(cè)體系，并與傳統(tǒng)e l i s a 檢測(cè)體系的一 些指標(biāo)女 1 i c 5 0 、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、特異性等作對(duì)比。 2 材料與方法 2 材料與方法 2 1 實(shí)驗(yàn)材料 辣根過氧化物酶( h r p ) 嘔吐毒素( d o n ) 標(biāo)準(zhǔn)品 3 甲基咪唑 丁二酸酐( 琥珀酐) 雞卵清蛋白( o v a ) 牛血清白蛋白( b s a ) 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔i g g 包被抗原( d o n - o v a ) 免疫抗原( d o n b s a ) 抗d o n 抗體 3 0 過氧化氫 1 乙基一3 ( 3 二甲胺丙基) 碳二亞胺鹽 酸鹽( e d c ) 二甲基甲酰胺( d m f ) 吡啶 考馬斯亮藍(lán)g 2 5 0 乙醇 t w e e n 2 0 鹽酸( a r ) 氫氧化鈉 碳酸鈉 碳酸氫鈉 氯化鈉 氯化鉀 磷酸二氫鉀 磷酸氫二鈉 檸檬酸 雙氧水 超純水 愈創(chuàng)木酚 四甲基聯(lián)苯胺( t m b ) 新西蘭長耳白兔( 雌性，1 5 2 k g ) 完全以及不完全弗氏佐劑 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 實(shí)驗(yàn)室自制 實(shí)驗(yàn)室自制 實(shí)驗(yàn)室自制 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司