（食品科學(xué)專業(yè)論文）米根霉發(fā)酵產(chǎn)L乳酸的中和劑研究及代謝通量分析.pdf

米根霉發(fā)酵產(chǎn)l 乳酸的中和劑研究及代謝通量分析 摘要 在米根霉發(fā)酵產(chǎn)l 乳酸過(guò)程中，一般采用c a c 0 3 作為酸中和劑，不僅l 乳酸損失大，且環(huán)境污染嚴(yán)重。為降低l 乳酸生產(chǎn)成本，尋求替代c a c 0 3 的新 型中和劑，本文通過(guò)搖瓶發(fā)酵優(yōu)化得出以c a c 0 3 、n a o h 溶液和氨水作為中和 劑的最適培養(yǎng)基組成，通過(guò)罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)確定了c a c 0 3 、n a o h 溶液和氨水的最 適中和劑濃度，并在最適濃度基礎(chǔ)上考察了米根霉的菌體形態(tài)和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)， 實(shí)現(xiàn)了n a o h 溶液和氨水作為中和劑的半連續(xù)發(fā)酵，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行代謝通量分 析。主要研究結(jié)論如下： 1 通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化得出采用c a c 0 3 、n a o h 溶液和氨水作為 中和劑時(shí)的培養(yǎng)基組成：( 1 ) 以c a c 0 3 作為中和劑的最優(yōu)培養(yǎng)基組成：葡萄糖 1 2 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 44 0 9 l ，k h 2 p 0 40 1 5 9 l ，n a h 2 p 0 40 2 0 9 l ，z n s 0 4 。7 h 2 0 o 2 2 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 3 5 9 l 。( 2 ) 以n a o h 溶液作為中和劑的最優(yōu)培養(yǎng)基組 成：葡萄糖1 2 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 44 0 9 l ，m g s 0 4 。7 h 2 0o 3 5 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 0 o 2 2 9 l ，n a h 2 p 0 40 1 0 9 l ，k h 2 p 0 40 1 5 9 l 。( 3 ) 以氨水作為中和劑的最優(yōu)培 養(yǎng)基組成：葡萄糖1 2 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 4 1 0 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 3 5 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 0 0 2 2 9 l ，n a h 2 p 0 40 1 5 9 l ，k h 2 p 0 4o 1 5 9 l 。 2 n a o h 溶液和氨水作為中和劑時(shí)，添加c a 2 + 后l 乳酸產(chǎn)量平均提高7 3 倍；通過(guò)罐發(fā)酵得出米根霉發(fā)酵產(chǎn)l - 乳酸的最適p h 值為5 5 士0 2 ，n a o h 溶液、 氨水溶液作為中和劑的最佳濃度分別為1 0 m o l l 、2 5 ，通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)得出 c a c 0 3 最佳濃度為6 0 9 l ；在最適n a o h 溶液、氨水、c a c 0 3 濃度基礎(chǔ)上進(jìn)行 罐發(fā)酵得菌絲體小球直徑分別為0 2 1 2 m m 、1 2 2 2 m m 、o 8 1 8 r a m ，殘?zhí)欠謩e 為2 5 8 9 l 、1 3 7 9 l 、2 2 7 8g l ，l - 乳酸產(chǎn)量分別為7 4 3 4 9 l 、8 0 6 1 9 l 、7 5 8 0 9 l ， 發(fā)酵強(qiáng)度分別為1 0 3 9 ( l h ) 、1 1 2 9 ( l h ) 、1 4 0 9 ( l h ) ；而使用n a o h 溶液和 c a c 0 3 復(fù)合中和劑、氨水和c a c 0 3 復(fù)合中和劑時(shí)發(fā)酵強(qiáng)度皆為1 1 8g ( l h ) ，高 于n a o h 溶液、氨水的發(fā)酵強(qiáng)度，低于c a c 0 3 的發(fā)酵強(qiáng)度。 3 在米根霉半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，使用n a o h 溶液作為中和劑時(shí)，l 乳酸平 均發(fā)酵強(qiáng)度為1 5 3g ( l h ) ，以氨水作為中和劑時(shí)，l 一乳酸平均發(fā)酵強(qiáng)度為1 6 5 g ( l h 1 ，高于分批發(fā)酵的產(chǎn)酸強(qiáng)度。 4 簡(jiǎn)單構(gòu)建了米根霉a s 3 8 1 9 胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)模型。應(yīng)用代謝通量分析法，分 別以1 0 m o l l n a o h 溶液、2 5 氨水、6 0 9 l c a c 0 3 作為中和劑時(shí)不同發(fā)酵階段胞 內(nèi)代謝通量分布的變化。以n a o h 溶液為中和劑，第1 2 h 、3 6 h 、6 0 h 產(chǎn)物l 乳酸 的流量速率分別為0 9 3 m m o l g h 、2 0 5 m m o l g h 和5 8 3 m m o l g h ：以氨水為中和 劑時(shí)，第1 2 h 、3 6 h 、6 0 h 產(chǎn)物l 一乳酸的流量速率分別為1 4 8 m m o l g h 、2 0 2 m m o l g h 、5 9 4 m m o l g h ；以c a c 0 3 作為中和劑，第1 2 、3 0 h 、4 8 h 產(chǎn)物l 乳酸的 流量速率分別是1 0 5 4 m m o l g h 、4 7 2 m m o l g h 、7 3 0 m m o l g h 。 關(guān)鍵詞：米根霉；l 乳酸：中和劑；半連續(xù)發(fā)酵；代謝通量分析 i i s t u d yo nn e u t r a l i z e r so f l - l a c t i ca c i d p r o d u c e db yr h i z o p u so r y z a ea n dm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s a b s t r a c t c a c 0 3w a sc o m m o n l yu s e da sa na c i dn e u t r a l i z e ri nt h ep r o c e s so fp r o d u c i n g l l a c t i ca c i db yr h i z o p u so r y z a e c a s 0 4r e s i d u ef r o mt h er e c o v e r yp r o c e d u r en o t o n l yc a u s e dt h el o s so fl - l a c t i ca c i dd u r i n gf i l t r a t i o nb u ta l s ob r o u g h te n o r m o u s e n v i r o n m e n t a lp r e s s u r e s t h e r e f o r e ，i no r d e rt or e d u c ep r o d u c t i o nc o s t 。t os e e ka n e wn e u t r a l i z e ri n s t e a do fc a c 0 3 ，c a c 0 3 、n a o hs o l u t i o na n da m m o n i aw e r e r e s e a r c h e dr e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o no ft h et h r e ed i f f e r e n t n e u t r a l i z e r sw e r eo p t i m i z e dt h r o u g hf e r m e n t i n gb ys h a k ef l a s k s ；t h eo p t i m a l n e u t r a l i z e rc o n c e n t r a t i o no fc a c 0 3 、n a o hs o l u t i o na n da m m o n i aw e r ed e r i v e db y t a n kf e r m e n t a t i o n ，m o r p h o l o g yo fr h i z o p u so r y z a ea n df e r m e n t a t i o nk i n e t i c sw e r e s t u d i e db a s e do nt h e o p t i m a l n e u t r a l i z e r c o n c e n t r a t i o n ； a c h i e v e dt h e s e m i c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o nw i t hn a o hs o l u t i o na n da m m o n i aa st h en e u t r a l i z e r ， a n dm a d er e s e a r c hb a s e do nm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s t h em a i nf i n d i n g sw e r ea s f o l l o w s ： 1 t h ec u l t u r em e d i u mi n g r e d i e n tw i t hc a c 0 3 、n a o hs o l u t i o na n da m m o n i aa s t h en e u t r a l i z e rw e r eo p t i m i z e db yt h ec o m b i n a t i o no fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ( 1 ) t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o nw i t hc a c 0 3a st h e n e u t r a l i z e r ：g l u c o s e 12 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 4 4 0 9 l ，k h 2 p 0 4 0 15 9 l ，n a h 2 p 0 4 0 15 l ，z n s 0 4 7 h 2 00 2 2 9 l ，m g s 0 4 。7 h 2 00 35 9 l ，c a c 0 36 0 9 l ( 2 ) t h e o p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o nw i t hn a o hs o l u t i o n a st h e n e u t r a l i z e r ：g l u c o s e 1 2 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 44 0 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 3 5 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 00 2 2 9 l ，n a h 2 p 0 4 0 1 0 l ，k h 2 p 0 40 1 5 9 l ( 3 ) t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o nw i t ha m m o n i aa s t h e n e u t r a l i z e r ：g l u c o s e1 2 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 41 0 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 00 3 5 9 l ， z n s 0 4 。7 h 2 00 2 2 9 l ，n a h 2 p 0 40 15 9 l ，k h 2 p 0 4o 15 9 l 2 e f f e c t so fc a 2 + o nl - l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nw e r es t u d i e dw i t hn a o h s o l u t i o na n da m m o n i aa st h en e u t r a l i z e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta f t e ra d d i n gc a 2 + t h ea v e r a g ep r o d u c t i o no fl - l a c t i ca c i dw a s7 3t i m e sm o r et h a nt h ec o n t r o lo n e ； t h eo p t i m u mp hv a l u eo fl l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nb yr h i z o p u so r y z a ew a s5 54 - 0 2 ，t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fn a o hs o l u t i o n 、a m m o n i aa st h en e u t r a l i z e rw e r e 1 0 m o l l 、2 5 b a s e do nt a n kf e r m e n t a t i o nr e s p e c t i v e l y ，t h eo p t i m u mc a c 0 3a d d i n g a m o u n tw a s6 0 9 lb a s e do ns h a k ef l a s kf e r m e n t a t o n ；f e r m e n t a t i o no nt h eo p t i m u m n a o h 、a m m o n i a 、c a c 0 3c o n c e n t r a t i o n ，t h ep h y s i c a lf o r mo fr h i z o p u so r y z a ew e r e i u n i f o r mp e l l e tw i t hd i a m e t e ro f0 2 1 2 r a m 、1 2 2 2m m 、0 8 1 8 m m ，r e s i d u a ls u g a r w e r e2 5 8 9 l 、1 3 7 9 l 、2 2 7 8 9 l ，l l a c t i ca c i dy i e l d sw e r e7 4 3 4 9 l 、0 6 1 9 l 、 7 5 8 0 9 l ，f e r m e n t a t i o ni n t e n s i t yw e r e1 0 3 9 ( l h ) 、1 。1 2 9 ( l h ) 、1 4 0 9 ( l h ) ；b o t h o ft h ef e r m e n t a t i o ni n t e n s i t yo fn a o hs o l u t i o na n dc a c o sc o m p o s i t en e u t r a l i z e r 、 a m m o n i aa n dc a c 0 3c o m p o s i t en e u t r a l i z e rw e r e1 18 9 ( l h ) ，h i g h e rt h a nt h e f e r m e n t a t i o ni n t e n s i t yo fn a o hs o l u t i o n 、a m m o n i ab u tl o w e rt h a nf e r m e n t a t i o n i n t e n s i t yc a c 0 3 3 t h es e m i c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o nu s i n gn a o hs o l u t i o n 、a m m o n i aa st h e n e u t r a l i z e rw e r es t u d i e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ：w h e nu s i n gn a o hs o l u t i o n a st h en e u t r a l i z e r ，t h ea v e r a g el l a c t i cf e r m e n t a t i o ni n t e n s i t yw a s1 5 3 9 ( l h ) ， w h e nt h ea m m o n i aa st h en e u t r a l i z e r ，t h ea v e r a g el l a c t i cf e r m e n t a t i o nw a s 1 6 5 9 ( l h ) ，h i g h e rt h a nf e r m e n t a t i o ni n t e n s i t yo f b a t c hf e r m e n t a t i o n 4 t h ei n t r a e e l l u l a rm e t a b o l i cn e t w o r km o d e lo fr h i z o p u so r y z a ea s 3 819w a s b u i l tt h r o u g hl i t e r a t u r er e v i e wa n db i o c h e m i c a li n f o r m a t i o no fr h i z o p u so r y z a ea n d e x p e r i m e n t a ld e t e r m i n a t i o n a p p l i c a t i o no fm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，t h ec h a n g e so f d i s t r i b u t i o ni ni n t r a c e l l u l a rm e t a b o l i ef l u xw e r er e s e a r c h e dw i t h10 m o l l n a o h s o l u t i o n ，2 5 a m m o n i a ，6 0 9 lc a c 0 3a st h en e u t r a l i z e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： t h ef l o wr a t eo fl 1 a c t i ca c i da t1 2 h 、3 6 h 、6 0 hw i t hn a o hs o l u t i o na st h en e u t r a l i z e r w e r eo 9 3 m m o l g h 、2 0 5 m m o l g ha n d5 8 3 m m o l g hr e s p e c t i v e l y ；t h ef l o wr a t eo f l 1 a c t i ca c i da t1 2 h 、3 6 h 、6 0 hw i t ha m m o n i aa st h en e u t r a l i z e rw e r e1 4 8 m m o l g h 、 2 0 2 m m o l g h 、5 9 4 m m o l g hr e s p e c t i v e l y ；t h ef l o wr a t eo fl l a c t i ca c i da t1 2 h 、 30 h 、5 4 hw i t hc a c 0 3a st h en e u t r a l i z e rw e r e10 5 4 m m o l g h 、4 7 2 m m o l g h 、 7 30 m m o l g hr e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：r h i z o p u so r y z a e ；l l a c t i c a c i d ；n e u t r a l i z e r ；s e m i - c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n ；m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s i v 插圖清單 圖1 1 乳酸的結(jié)構(gòu)式1 圖2 1l 乳酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線1 3 圖2 2 葡萄糖濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響1 6 圖2 3 h 4 ) 2 s 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響1 7 圖2 4m g s 0 4 7 h 2 0 濃度對(duì)l 。乳酸產(chǎn)量的影響1 8 圖2 5z n s 0 4 7 h 2 0 濃度對(duì)l 。乳酸產(chǎn)量的影響1 8 圖2 - 6k h 2 p 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響1 9 圖2 7n a i l 2 p 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響1 9 圖2 8c a c l 2 濃度對(duì)產(chǎn)酸量的影響2 1 圖2 9c a c 0 3 濃度對(duì)產(chǎn)酸量的影響2 1 圖2 1 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 2 圖2 1 1m g s 0 4 7 h 2 0 對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 2 圖2 1 2z n s 0 4 7 h 2 0 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 3 圖2 1 3k h 2 p 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 3 圖2 1 4n a h 2 p 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 4 圖2 1 5c a c l 2 濃度對(duì)產(chǎn)酸量的影響2 6 圖2 1 6c a c 0 3 濃度對(duì)產(chǎn)酸量的影響2 6 圖2 1 7 ( n h 4 ) 2 s 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 7 圖2 1 8m g s 0 4 7 h 2 0 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 7 圖2 1 9z n s 0 4 - 7 h 2 0 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 8 圖2 2 0n a h 2 p 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 8 圖2 2 1k h 2 p 0 4 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響2 9 圖3 1 還原糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線3 4 圖3 2n a o h 濃度對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響3 6 圖3 3 氨水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響_ 3 6 圖3 - 4c a c 0 3 添加量對(duì)l 乳酸產(chǎn)量的影響3 7 圖3 5n a o h 、n h 3 h 2 0 、c a c 0 3 作為中和劑時(shí)的菌球形態(tài)3 8 圖3 6 以n a o h 作為中和劑的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線3 8 圖3 7 以氨水作為中和劑的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線3 9 圖3 8 以c a c 0 3 作為中和劑的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線4 0 圖3 - 9n a o h 和c a c 0 3 復(fù)合中和劑的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)4 0 圖3 1 0 氨水和c a c 0 3 復(fù)合中和劑的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)4 1 圖3 1 l 以n a o h 作為中和劑的半連續(xù)發(fā)酵4 2 圖3 1 2 以氨水作為中和劑的半連續(xù)發(fā)酵4 2 圖4 1 米根霉體內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)圖4 5 i x 圖4 2 米根霉胞內(nèi)主要代謝途徑網(wǎng)絡(luò)圖4 9 圖4 3 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線5 0 圖4 4 富馬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線5l 圖4 5 以n a o h 作為中和劑進(jìn)行發(fā)酵的代謝通量分析5 2 圖4 - 6 以氨水作為中和劑進(jìn)行發(fā)酵的代謝通量分析5 3 圖4 7 以c a c 0 3 作為中和劑進(jìn)行發(fā)酵的代謝通量分析5 4 x 表格清單 表1 1 乳酸異構(gòu)體的理化性質(zhì)2 表1 2l 乳酸及衍生物在食品工業(yè)中的應(yīng)用4 表2 1 正交試驗(yàn)因素水平表1 4 表2 2 正交試驗(yàn)因素水平表1 5 表2 3 正交試驗(yàn)因素水平表1 6 表2 4l l s ( 37 ) 正交實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析2 0 表2 5 方差分析表2 0 表2 6l 1 6 ( 4 5 ) 正交實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析2 4 表2 7 方差分析表2 5 表2 8l 9 ( 3 4 ) 正交實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析2 9 表2 - 9 方差分析表3 0 表3 1p h 值對(duì)菌體形態(tài)和產(chǎn)酸量的影響3 5 表3 2 不同中和劑對(duì)菌體形態(tài)的影響3 8 表4 1 米根霉胞內(nèi)代謝反應(yīng)方程4 5 x i 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。 據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)志和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰 寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得 金月巴王些太堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使 用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō) 明并表示謝意。 學(xué)位論文作者簽字：；島窆簽字日期：矽p 年?duì)幵職v日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解金目巴蘭些厶堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán) 保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱或借閱。本人 授權(quán) 僉月巴王些盍堂 可以將學(xué)位論文的全部或部分論文內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢 索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書) 學(xué)位論文者簽名：蘇y 弓互 導(dǎo)師簽名： 簽字日期：加p 年夠月彩日 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向： 工作單位： 通訊地址： 簽字日v ，年夠釤7 日 砂3 、l 電話： 郵編： 致謝 本研究論文是在姜紹通教授悉心指導(dǎo)下完成的。在兩年半的攻讀學(xué)位期間， 姜紹通教授作為我的導(dǎo)師，他以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和開闊的學(xué)術(shù)視野逐步引導(dǎo)我 去探求學(xué)問(wèn)和克服困難，對(duì)我的科研能力的提高起到了十分重要的作用，同時(shí) 在生活上給我的無(wú)私關(guān)懷讓我深切的感受到為人師長(zhǎng)的辛勞和為人學(xué)子的幸 福。導(dǎo)師不僅教導(dǎo)我做學(xué)問(wèn)更教導(dǎo)我如何做人，讓我受益非淺，在謹(jǐn)記導(dǎo)師的教誨的 同時(shí)，我只有用加倍的努力來(lái)表達(dá)對(duì)導(dǎo)師的敬意。 感謝潘麗軍教授、鄭志老師、羅水忠老師、李興江老師、陳曉燕老師、王 華林老師、龐敏老師、吳學(xué)風(fēng)博士、劉模師兄給我的指導(dǎo)和幫助；感謝劉靖師 兄、胡燕紅師姐、研三的兄弟姐妹們以及師弟師妹們給我的幫助。 最后，特別感謝我的父母對(duì)我的養(yǎng)育之恩，感謝我的哥哥嫂嫂一直以來(lái)對(duì) 我的支持與幫助，家人的支持永遠(yuǎn)是我動(dòng)力的源泉。 v 作者：張巧蘭 2 0 1 0 年4 月2 2 日 第一章緒論 1 1 乳酸的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì) 乳酸( l a c t i ca c i d ) ，學(xué)名為a 羥基丙酸( a h y d r x y p r o p i o n i ca c i d ) ，其 分子式為：c 2 h 5 0 c o o h ，相對(duì)分子質(zhì)量為9 0 0 8 ，相對(duì)密度在2 5 時(shí)約為1 2 0 6 ， 是一種天然存在的有機(jī)酸，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中。乳酸分 子中有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有旋光性。l 乳酸為右旋性，d 乳酸為左旋 性，d l 乳酸為消旋性【l 】，結(jié)構(gòu)式表示如下： h o o c h 吣h u h a c 晰乳酸 c o o h ； h 少洲 ； ； c h a 附乳酸 圖1 - 1 乳酸的結(jié)構(gòu)式 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fl a c t i ca c i d 由于人體和動(dòng)物體內(nèi)只含有代謝l 乳酸的l 乳酸脫氫酶，因此只能利用自 體產(chǎn)生或攝入的l 乳酸，且不產(chǎn)生任何有毒、副作用的代謝產(chǎn)物。d 乳酸或d l 乳酸的過(guò)量攝入，會(huì)導(dǎo)致血液中富含d 乳酸，尿中會(huì)出現(xiàn)高酸度現(xiàn)象，引起代 謝紊亂甚至導(dǎo)致中毒，因此世界衛(wèi)生組織( w t o ) 限制人體每天攝入d 乳酸量 控制在1 0 0 m g k g 以下，d 型、d l 型乳酸不應(yīng)加入到三個(gè)月以下嬰兒的食品中， 對(duì)l 乳酸卻不限制。在食品和醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)使用l 乳酸，在其它行業(yè)中對(duì)乳酸 的構(gòu)型卻不加限制瞄j 。 純凈的無(wú)水乳酸是白色結(jié)晶體，熔點(diǎn)為1 6 8 ，沸點(diǎn)為1 2 2 ( 2 k p a ) ，相 對(duì)密度為1 2 4 9 。乳酸通常是乳酸和乳酰乳酸的混合物，為無(wú)色透明或淺黃色糖 漿狀的粘稠液，幾乎無(wú)臭或微帶有脂肪酸臭，味酸，易與水、乙醇、乙醚、丙 二醇、甘油、丙酮混溶，幾乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯【3 】。6 0 以 上濃度的乳酸溶液有很強(qiáng)的吸濕性。因此，商品乳酸通常為6 0 溶液，藥典級(jí) 乳酸含量為8 5 0 9 0 o ，食品級(jí)乳酸含量為8 0 以上，6 7 1 3 3 p a ( 0 5 1 0 m m h g ) 的真空條件下反復(fù)分餾，可以得到純品的乳酸結(jié)晶【4 1 。 表卜1 乳酸異構(gòu)體的理化性質(zhì) t a b l e1 1t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r so fl a c t i ca c i di s o m e r 1 2 乳酸的生產(chǎn)方法 1 2 1 發(fā)酵法 發(fā)酵法制備乳酸是以淀粉、葡萄糖等糖類或牛乳為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而 制得。按微生物發(fā)酵糖類經(jīng)由的過(guò)程和生成產(chǎn)物的不同，可將乳酸發(fā)酵分為同 型乳酸發(fā)酵( h o m o f e r m e n t a t i o n ) 、異型乳酸發(fā)酵( h e t e r o f e r m e n t a t i o n ) 和混 合酸發(fā)酵( m i x e da c i df e r m e n t a t i o n ) 【lj 。 a 同型乳酸發(fā)酵 微生物通過(guò)e m p 代謝途徑進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵，乳酸是代謝的惟一產(chǎn)物。l m o l 葡萄糖可以生成2 m o l - 孚l 酸，理論轉(zhuǎn)換率為1 0 0 。但由于發(fā)酵過(guò)程中微生物有其 他生理活動(dòng)存在，實(shí)際轉(zhuǎn)化率一般在8 0 以上者即視為同型乳酸發(fā)酵，總反應(yīng) 式為： c 6 h 1 2 0 6 + 2 a d p + 2 p i 一2 c h 3 c h c o o h + 2 a t p b 異型乳酸發(fā)酵 微生物經(jīng)由b i f i d u s 途徑和p k 途徑生成等摩爾數(shù)的乳酸、c 0 2 和乙醇。葡萄 糖的轉(zhuǎn)化率只有5 0 ，總反應(yīng)式為： c 6 h 1 2 0 6 + a d p + p i c h 3 c h c o o h + c h 3 c h 2 0 h + c 0 2 + a t p c 混合酸發(fā)酵 同型乳酸發(fā)酵是在特殊情況下，如葡萄糖濃度受到限制、p h 升高或溫度降 低而發(fā)生的一種乳酸發(fā)酵機(jī)制，葡萄糖經(jīng)e m p 途徑生成丙酮酸，但丙酮酸的代 謝途徑發(fā)生了改變，除生成乳酸外，還生成了甲酸等副產(chǎn)物。傳統(tǒng)意義上的乳 酸發(fā)酵類型是針對(duì)乳酸細(xì)菌而言的，是在厭氧或兼性厭氧條件下合成乳酸的。 而米根霉作為好氧菌，其乳酸發(fā)酵具有獨(dú)特的代謝途徑。它是經(jīng)e m p 途徑生成 丙酮酸，然后一部分丙酮酸進(jìn)入t c a 循環(huán)，而另一部分丙酮酸在乳酸脫氫酶、 丙酮酸脫羧酶和丙酮酸羧化酶的催化下分別生成乳酸、乙醇、蘋果酸和富馬酸。 依據(jù)形成產(chǎn)物情況，該發(fā)酵也屬于混合酸發(fā)酵類型【4 - 5 】。 1 2 2 化學(xué)合成法 1 9 6 3 年，美國(guó)m o n s a n t o 公司開始采用化學(xué)合成法生產(chǎn)乳酸【6 1 ?；瘜W(xué)合成法 生產(chǎn)乳酸可通過(guò)多種途徑進(jìn)行，其中具有現(xiàn)實(shí)意義的是乳腈法。該法是乙醛與 氫氰酸經(jīng)堿性催化劑作用生成乳腈，這是一個(gè)液相反應(yīng)，在常壓下進(jìn)行，粗乳 2 腈通過(guò)蒸餾回收純化并用濃鹽酸或硫酸水解為乳酸，還產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸副產(chǎn) 物，粗乳酸用甲醇酯化得乳酸甲酯，精餾后再水解生成乳酸與甲醇，甲醇可再 循環(huán)利用f7 1 。乳酸的其它一些可行的化學(xué)合成法包括糖的堿性催化水解、丙烯 乙二醇氧化、乙二醇的硝酸氧化等。 1 2 3 酶法 a2 氯丙酸酶法轉(zhuǎn)化 日本東京大學(xué)的木畸等【8 】研究了用酶法生產(chǎn)乳酸，分別從惡臭假單孢菌和 假單孢菌1 1 3 細(xì)胞中純化出l 2 鹵代酸脫鹵酶( 簡(jiǎn)稱為l 酶) 和d l 2 鹵代酸脫 鹵酶( 簡(jiǎn)稱為d l 酶) ，使之作用于底物d l 一2 - 氯丙酸，就可得到l 。乳酸或d 乳 酸。 b 丙酮酸酶法轉(zhuǎn)化 h u m m e l 等【l 】從d 乳酸脫氫酶活力最高的混亂乳桿菌d s m 2 0 1 9 6 菌體中得到 d 乳酸脫氫酶，然后以無(wú)旋光性的丙酮酸為底物得到d 乳酸。 1 2 4 乳酸生產(chǎn)方法的比較 化學(xué)合成法的缺點(diǎn)是產(chǎn)品為外消旋乳酸即d l 乳酸，另外，由于合成法所 用的原料是乙醛和劇毒物氫氰酸，盡管美國(guó)食品和藥物管理局( f d a ) 已將合 成乳酸列為安全品，但許多人還是對(duì)化學(xué)合成法生產(chǎn)的乳酸的安全性表示擔(dān)心， 因而合成法生產(chǎn)乳酸大大受到限制，此外其生產(chǎn)成本也較高。酶法生產(chǎn)乳酸雖 可專一性地得到旋光乳酸，但工藝比較復(fù)雜，應(yīng)用到工業(yè)上還有待于進(jìn)一步研 究。 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，可通過(guò)菌種和培養(yǎng)條件的選擇而獲得具有立體專 一性的d 乳酸或l 乳酸或是兩種異構(gòu)體以一定比例混合的消旋體，以滿足生產(chǎn) 聚乳酸的需要。另外發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸除能以葡萄糖、乳糖等單糖為原料外，還 能以淀粉、纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，利用這些可再生資源生產(chǎn)不會(huì)導(dǎo)致大 氣中的二氧化碳的凈增加，也就不會(huì)引起溫室效應(yīng)。因此，微生物發(fā)酵法生產(chǎn) 乳酸因其原料來(lái)源廣泛，生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品光學(xué)純度高、安全性高等優(yōu)點(diǎn)而成 為生產(chǎn)乳酸的重要方法拶j 。 1 3l 乳酸的應(yīng)用 l 乳酸是一種天然存在的有機(jī)酸，廣泛存在人體、動(dòng)物、植物和微生物中， 是世界公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，其應(yīng)用極為廣泛【l 。 1 3 1 食品工業(yè)中的應(yīng)用 由于l 乳酸對(duì)人體無(wú)副作用，易吸收，可直接參與體內(nèi)代謝，酸性柔和且 穩(wěn)定，有助于保護(hù)食品的口味，因此l - 乳酸及其衍生物已逐漸取代其它有機(jī)酸， 作為酸味劑、殺菌劑、乳化劑、保鮮劑等廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)】，見表1 2 。 在罐頭、醬菜、飲料生產(chǎn)中加入l 乳酸以替代對(duì)人體健康有毒害作用的苯甲酸 鈉，在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，用l 乳酸代替磷酸來(lái)調(diào)節(jié)p h 值。此外加入少量的l 乳 酸既可以抑制雜菌的生長(zhǎng)又能促進(jìn)糖化完成，還具有保鮮作用，有利于食品衛(wèi) 生【12 1 。 表1 2l 乳酸及衍生物在食品工業(yè)中的應(yīng)用 t a b l e1 - 2a p p l i c a t i o no fl - l a c l i ca c i da n di t sd e r i v a t i v ei nf o o di n d u s t r y 名稱用途 l 乳酸 l 乳酸鈣 l 乳酸亞鐵 l 乳酸鉀 l 乳酸鈉 硬脂酰乳酸鈣 硬脂酰乳酸鈉 硬脂酸乳酸酯 甘油混合酯 脂肪酸甘油乳酰酯 l 乳酸酯 酸味劑、防腐劑、啤酒p h 調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、保鮮劑 風(fēng)味增強(qiáng)劑、固化劑、膨松劑、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、穩(wěn)定劑 營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、嬰兒配制食品 風(fēng)味增強(qiáng)劑、調(diào)味劑、保溫劑、p h 控制劑 調(diào)味劑、保濕劑、乳化劑、防腐劑、防凍劑 面團(tuán)增強(qiáng)劑、蛋制品起泡劑 乳化劑、穩(wěn)定劑、組織柔軟劑 乳化劑、增塑劑、表面活性劑 乳化劑、增塑劑、表面活性劑 乳化劑、增塑劑、表面活性劑 溶劑、香料 1 3 2 在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用 由于l 乳酸有很強(qiáng)的殺菌作用，其殺菌能力是檸檬酸、酒石酸、琥珀酸的 幾倍，可以直接用作手術(shù)室、病房、實(shí)驗(yàn)室、車間等場(chǎng)所的消毒劑【1 3 1 ；l 乳酸 鈣、l 乳酸鐵、l 乳酸鈉是補(bǔ)充金屬元素的良好藥品；l 乳酸經(jīng)過(guò)聚合可生成 直鏈或環(huán)狀的聚乳酸。聚l 乳酸系無(wú)毒的高分子化合物，具有生物相容性。在 體內(nèi)能被分解成l 乳酸而被人體代謝，不引起變態(tài)反應(yīng)。還可用于制造緩釋膠 囊制劑( 使血液中藥物濃度相對(duì)降低，在治療癌癥方面已取得可喜進(jìn)展) 、生 物降解纖維( 制成手術(shù)縫合線) 、生物植片( 修復(fù)骨折或其它機(jī)體損傷) 等醫(yī) 藥領(lǐng)域【1 4 以川。 1 3 3 在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，低分子量聚l 乳酸可作為緩釋材料( 生產(chǎn)緩釋肥料、農(nóng)藥) ， 或作為可降解農(nóng)用薄膜在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛應(yīng)用【l6 。1 7 j 。另外l 乳酸還可作為 植物生長(zhǎng)活力劑，水產(chǎn)用生菌劑等應(yīng)用于農(nóng)、漁業(yè)上，具有十分誘人的開發(fā)前 景。聚l 乳酸與其它材料共聚制成的生物降解塑料，可以用作生產(chǎn)緩釋農(nóng)藥， 延長(zhǎng)農(nóng)藥的作用時(shí)間，對(duì)農(nóng)作物和土壤無(wú)毒害作用，提高農(nóng)藥的使用效率【1 8 19 1 。 1 3 4 在化學(xué)工業(yè)方面的應(yīng)用 聚l 乳酸( p l a ) 是無(wú)毒高分子化合物，具有生物相容性，可生物降解吸 收，強(qiáng)度高，易加工成型【2 引。它易被自然界中的各種微生物或動(dòng)植物體內(nèi)的酶 分解，最終形成二氧化碳和水，不污染環(huán)境因而被認(rèn)為是最有前途的可生物降 解高分子材料【”五們。聚l 乳酸由于其具有與聚苯乙烯相似的光澤度、加工性能 4 及生物可降解性，可廣泛用于降解塑料及綠色包裝材料的生產(chǎn)【2 1 1 。在美國(guó)和日 本，聚l 乳酸已用于紙涂層、透明塑料容器、發(fā)泡容器、薄膜、餐館容器、兒 童玩具、蔬菜包裝等，今后將在纖維、農(nóng)業(yè)、垃圾( 堆肥化) 等方面進(jìn)行新的 開拓。 l 乳酸在可生物降解塑料方面的應(yīng)用，對(duì)于減少“白色污染”，實(shí)現(xiàn)可持 續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略具有極其重要的意義。據(jù)國(guó)外資料預(yù)計(jì)，不久的將來(lái)將有數(shù)百萬(wàn)噸 級(jí)的塑料被聚l 乳酸所取代【2 2 。 1 4 國(guó)內(nèi)外發(fā)酵生產(chǎn)l 哥l 酸的研究現(xiàn)狀 1 7 8 0 年瑞典化學(xué)家s c h e e l e 最早在酸牛乳中提煉制得乳酸。1 8 7 5 年，巴斯德 發(fā)現(xiàn)使乳變酸的乳酸菌。在食品的發(fā)酵過(guò)程中如乳酪、香腸、泡菜的加工制造 過(guò)程中使用乳酸和大規(guī)模生產(chǎn)乳酸要追溯到1 8 8 1 年的美國(guó)。1 8 9 9 年，b o u l l a n g e r 申請(qǐng)了由乳酸霉即現(xiàn)在的根霉( r h i z o p u s ) 或毛霉( m u c o r ) 生產(chǎn)乳酸的專利。 1 9 11 年，齋藤確定根霉所產(chǎn)乳酸為l 型【2 3 。2 5 j 。l 乳酸發(fā)酵于上世紀(jì)5 0 年代至6 0 年代在生物化學(xué)方面取得了較大的進(jìn)展，通過(guò)遺傳工程改良乳酸生產(chǎn)菌也開始 起步。 自然界中可產(chǎn)生乳酸的微生物很多，但產(chǎn)酸能力強(qiáng)、可以應(yīng)用到工業(yè)的只 有兩大類，一類為乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ) ，另一類為根霉( r h i z o p u s r o y z a e ) 。根霉所產(chǎn)的乳酸光學(xué)純度好，但是產(chǎn)酸量低，需氧，耗能高；乳酸 菌產(chǎn)酸量高，厭氧，好能低，但是產(chǎn)物含有部分d 乳酸。目前用于l 乳酸發(fā)酵 生產(chǎn)研究的菌種，主要是米根霉，乳桿菌和乳酸鏈球菌【1 7 】。米根霉生長(zhǎng)因?qū)I(yíng) 養(yǎng)要求低，可以直接利用淀粉轉(zhuǎn)化為l 乳酸而被廣泛采用。 1 4 1 米根霉菌種選育方面的研究 菌種的優(yōu)良直接關(guān)系到發(fā)酵過(guò)程的控制及其產(chǎn)量，是發(fā)酵過(guò)程中一個(gè)至關(guān) 重要的影響因素。目前以米根霉為親本的優(yōu)良菌株的選育有： ( 1 ) 高產(chǎn)菌株的篩選：江蘇微生物研究所曹本昌等人【2 6 】選育了一種產(chǎn)l 乳酸的米根霉菌株j s m i r 7 3 并對(duì)該菌的性能及影響產(chǎn)酸的條件進(jìn)行了研究，用 5 0 0 l 發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大試驗(yàn)，當(dāng)玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 2 時(shí)產(chǎn)酸7 0 9 l 以上，2 0 時(shí) 產(chǎn)1 0 5 9 l 以上，其中l(wèi) 乳酸純度最高可達(dá)9 9 。楊虹等人【2 7 】利用淀粉一酸性培 養(yǎng)基富集培養(yǎng)，并結(jié)合高錳酸鉀溴化鉀平板檢出的方法從土壤中篩選出產(chǎn)l 乳酸8 1 9 l 的根霉r 2 菌株，以其為出發(fā)菌株經(jīng)紫外線誘變從琥珀酸平板上獲得 了變異株r 2 9 1 ，以葡萄糖為碳源，其l 乳酸產(chǎn)率為1 0 3 9 l ，對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為6 8 9 。 虞東勝等人【2 8 】從7 8 株米根霉中篩選出1 3 株產(chǎn)l 乳酸較高的菌株，其中米根霉 r s 9 2 8 產(chǎn)l 乳酸最高，以葡萄糖為碳源，在6 0 t 發(fā)酵罐中，當(dāng)總糖平均濃度為 1 7 4 9 l 時(shí)，發(fā)酵6 1 h 產(chǎn)l 乳酸1 4 0 9 l ，糖轉(zhuǎn)化率為8 0 4 ，l 乳酸純度為9 7 9 。 白冬梅等人【2 9 , 3 0 】利用酸性饅頭片富集培養(yǎng)，用含脫氧膽酸鈉和溴甲酚綠平板檢 出的方法從土壤中選出了根霉菌r o r y z a e 3 0 1 7 。同時(shí)利用u v 、硫酸二乙