大腸桿菌生長曲線實驗報告-xiang.docx

E.coli growth curve measurement一、目的1、瞭解細菌生長曲線特徵，測定細菌繁殖的代時；2、學(xué)習(xí)液體培養(yǎng)基的配製以及接種方法；3、反復(fù)練習(xí)無菌操作技術(shù)；4、瞭解不同細菌，不同接種方法在同一培養(yǎng)基上生長速度的不同；5、掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法6、複習(xí)光電比濁法測量細菌數(shù)量的方法7、學(xué)習(xí)平板塗布技術(shù)二、原理1、大腸桿菌生長：將一定量的細菌接種在液體培養(yǎng)基內(nèi)，在一定條件下培養(yǎng)，可觀察到細菌的生長繁殖有一定的規(guī)律性，如以細菌的活菌數(shù)的對數(shù)作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間作橫坐標(biāo)，可繪成一條曲線，成為生長曲線（如圖一）。 圖一 微生物生長曲線示意圖單細胞微生物的發(fā)酵具有四個階段，即調(diào)整期（延滯期）、對數(shù)期（生長旺盛期）、平衡期（穩(wěn)定期）、死亡期（衰亡期）。生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的全過程的動態(tài)。不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對於瞭解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數(shù)板法、平板菌落計數(shù)法、稱重法和比濁法等。本實驗採用比濁法測定，由於細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值（OD600）與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意，由於光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。2、平板塗布技術(shù)：塗布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用於計算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用於檢測化學(xué)因素對微生物的抑殺效應(yīng)。 原理:將一定濃度，一定量的待分離菌懸液加到已凝固的培養(yǎng)基平板上，再用塗布棒快速地將其均勻塗布，使長出單菌落或菌苔而達到分離或計數(shù)的目的。 其目的:用於目的微生物的分離；用於藥物的抑菌試驗；觀察菌苔的形狀和特點。 優(yōu)點：可以計數(shù)，可以觀察菌落特徵，還可以進行菌種的分離。 缺點：接種前需梯度稀釋，吸收量較少，較麻煩，平板不乾燥效果不好，容易蔓延。三、材料、藥品1、 實驗材料：細菌 （E.coli）2、 培養(yǎng)基：LBmedium；3、 實驗儀器：光電比色計、L型玻棒、接種環(huán)、超淨(jìng)工作臺、恒溫培養(yǎng)箱； 四、步驟1、取100LE.coli放入含有200mL LB liquid medium的錐形瓶中，並搖晃均勻。2、取mixed的菌液1mL到cuvette內(nèi)，拿去測量吸光值，並記錄測得的數(shù)值。3、取500L的菌液放入LB solid medium內(nèi)，並用玻璃棒塗抹均勻，放入37,150rpm的incubator內(nèi)培養(yǎng)。4、整個實驗共進行24個小時又50分鐘，第三個小時開始用n=600nm測定細菌培養(yǎng)液吸光度，以後每隔一小時測一次，知道實驗結(jié)束。（若吸光值大於0.7，則代表菌液的濃度太濃，需要加以稀釋。）5、除第二盤plate相距第一盤plate1小時和第三盤plate相距第二盤plate3小時之外，之後每相隔5小時就要再新畫一盤新的plate。（第一、二盤plate沒有稀釋，第三盤plate稀釋1000X，第四、五、六盤稀釋106 X）五、實驗結(jié)果實驗數(shù)據(jù)時間Time(minutes)A600Log10A600Log2A600菌落數(shù)（個/0.1mL）17:20019:101100.019-1.7212464-5.717856888020:151750.018-1.7447275-5.795859349421:122320.021-1.6777807-5.573466922:102900.025-1.60206-5.321928123:173570.023-1.6382722-5.44222234680:134130.029-1.537602-5.10780331:054650.044-1.3565473-4.50635272:075270.084-1.0757207-3.57346693:045840.164-0.7851562-2.60823234:056450.332-0.4788619-1.59074494415:047040.521-0.2831623-0.94064476:047640.97-0.0132283-0.04394337:058251.60.204119980.678071918:068862.450.389166081.292781759:159553.110.492760391.63691458無法數(shù)清10:0510053.570.552668221.8359240711:0010606.490.81224472.6982184812:1011303.960.597695191.9855004313:10119040.60205999214:1512554.460.649334862.15704371無法數(shù)清15:0513054.40.643452682.1375035216:0513654.490.652246342.1667154417:0514254.760.677606952.2509615718:1014905.010.699837732.3248106表一 實驗數(shù)據(jù)六、討論根據(jù)表一做出以下圖圖二A600 與時間圖由圖二看出，11:00的實驗數(shù)據(jù)有顯著的異常，分析可能是由於操作的失誤造成的，應(yīng)當(dāng)捨棄來進行校正，修正後圖如下（以下其他圖也將做同樣校正）圖三 A600 與時間圖（修正後）一般來說，應(yīng)該是說細菌的生長曲線，細菌是以二分裂方式增殖生長，也就是對數(shù)增長，是它生長的一個主要特點，故以其對數(shù)為縱坐標(biāo)，更能體現(xiàn)這個特點，所以做出下圖圖四Log10A600 與時間圖圖五Log10A600 與時間圖（修正後）分析圖五，可知道本次實驗，E.coli的生長曲綫大體上符合邏輯斯蒂生長曲綫，即有明顯的lag phase, logarithmic phase以及stationary phase，但是沒有出現(xiàn)明顯的death phase。1、基本上以0-357min為lag phase。在此過程中，細菌的數(shù)量稍有波動，但是還是處於一個比較低的菌密度，沒有快速的數(shù)量增長現(xiàn)象。這是因為單菌落菌較少，而且從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基環(huán)境變化較大，細菌在適應(yīng)新環(huán)境的過程中，並不會進行大規(guī)模的複製增長，所以數(shù)量保持在一個相對較低的水準(zhǔn)。 可以注意到，在lag phase的階段，有一定的波動情況，分析原因可能有三：在細菌適應(yīng)新環(huán)境時，出現(xiàn)了不適，造成了菌體的死亡，從而使數(shù)量下降由於在測定菌數(shù)的時候，菌的外界環(huán)境有所變動，例如溫度、培養(yǎng)液均質(zhì)度等，可能使其對環(huán)境的適應(yīng)產(chǎn)生改變，使數(shù)量改變?nèi)藶榈牟僮魇д`，如取液前未搖晃至培養(yǎng)液足夠均勻。2、把357-886min看做是logarithmic phase。細胞在一定的環(huán)境下經(jīng)過了短暫的適應(yīng)期，進而快速生長的時期，此時期營養(yǎng)充足，細胞會以對數(shù)生長，假如原來只有一個細胞，進入對數(shù)期以後就會變?yōu)閮蓚€，兩個再變?yōu)樗膫€，四個變?yōu)榘藗€.即以2的N次方的速度生長(N為細胞的分裂次數(shù))，在對數(shù)期生長速率遠遠大於死亡速率，所以在對數(shù)期最顯著地特徵就是細胞的數(shù)目大量增加，但當(dāng)細胞經(jīng)過一定時間的生長會消耗掉營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物使得pH值下降，其生長環(huán)境變得惡劣，此時生長速度下降，生長速率和死亡速率平衡，細胞的總個數(shù)基本保持不變，開始進入stationary phase。 從圖五看，本次生長曲綫的logarithmic phase與理論符合度很高，做出下圖圖六Log2A600在logarithmic phase中與時間的關(guān)係由圖六可以看出E.coli在logarithmic phase中以0.0136 Log2A600/min的數(shù)率進行快速增殖，R square為0.9945，說明瞭此曲綫的回歸擬合度非常高，置信度很高。3、886-1490min可以看做是本菌生長曲綫的stationary phase。因為進入此期後，菌的數(shù)量增長緩慢，甚至停止，這是因為由於培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害代謝產(chǎn)物積聚，該期細菌繁殖速度漸減，死亡數(shù)緩慢增加，生長分裂和死亡的菌細胞數(shù)處於平衡狀態(tài)。該期細菌形態(tài)、染色性和生理性狀常有改變。一些細菌的芽胞、外毒素和抗生素等代謝產(chǎn)物大多在最大穩(wěn)定期產(chǎn)生。但是在圖五中看來，curve有緩緩上揚的趨勢，分析原因可能如下：其為兼性耗氧菌，因為每次進行取菌操作的時候，都會有新鮮的空氣進入培養(yǎng)瓶中，使氧氣得以補充，使其生長環(huán)境得以改善，使其數(shù)量繼續(xù)增加取菌操作的時候未充分搖勻，取到了菌比較多的溶液部份。4、本次的生長曲綫沒有出現(xiàn)death phase。Death phase是由於在後stationary phase繼續(xù)培養(yǎng)，細菌死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，總活菌數(shù)明顯下降，稱為衰亡期。在這個階段細菌常出現(xiàn)多形態(tài)，包括畸形或衰退型，細胞死亡伴隨著自溶。 可能是由於其生長環(huán)境還沒有足夠惡化，使它的stationary phase結(jié)束，應(yīng)該要再進行一段時間的培養(yǎng)，才能到達這個時期。5、對於平板塗布的菌落計數(shù)，最後兩盤的plate可能是由於菌落數(shù)過多，稀釋的倍率不夠，導(dǎo)致經(jīng)過培養(yǎng)後無法計數(shù)的情況，也可能是由於塗布時，未將菌液足夠擴散和乾燥，導(dǎo)致其生長粘連在一起，無法計數(shù)。 並且，第一盤plate菌數(shù)居然比後面2、3、4次都菌落數(shù)多，這是不符合時間吸光度測定法數(shù)據(jù)和理論依據(jù)的，可能是操作的同學(xué)沒有將菌液搖晃到足夠的均勻，導(dǎo)致取出的菌液不具有足夠的代表性。所以這次plate的數(shù)據(jù)僅能作為參考使用。七、實驗小結(jié)這是一個大組合作、小組分工的實驗，每一組的結(jié)果都影響了整個大組隊結(jié)果的分析，這就要求我們的合作。由於時間漫長以及其他因素的綜合影響