（食品科學專業(yè)論文）辣椒調味品中黃曲霉毒素Blt1gt檢測及應用.pdf

貴州大學碩十學位論文 辣椒調味品中黃曲霉毒素b 檢測及應用 摘要 貴州優(yōu)質辣椒具有色澤紅潤、油分重、香味濃、辣味適中的特點，是開發(fā)辣 椒系列制品的極好原料。目前，辣椒調味品現(xiàn)已成為貴州食品工業(yè)新興產(chǎn)業(yè)，也 是貴州出口食品的重要產(chǎn)品，已遠銷2 1 個國家和地區(qū)。但辣椒調味品中a f b l 污 染已成為阻礙出口的貿易壁壘，為了擴大辣椒調味品出口、確保產(chǎn)品質量、打破 國外技術壁壘，發(fā)展貴州經(jīng)濟，保證食品安全和滿足出口快速檢測需要，需要建 立一種靈敏度高、特異性強、簡便快速、容易普及應用的方法來檢測食品中黃曲 霉毒素b 1 ( a f bj ) 。 本文采用e l i s a 方法檢測辣椒調味品中的a f b l ，針對辣椒調味品成分的復 雜性，預處理過程中采用不同有機溶劑甲醇水溶液配比對a f b l 進行提取優(yōu)化， 同時分析樣品中p h 、含鹽量和油脂等因素對e l i s a 法檢測a f b l 結果的影響。 研究表明，應用8 0 甲醇水溶液提取a f b l ，調整辣椒調味品p h 值在6 8 之間， 控制辣椒調味品氯化鈉含量在1 0 - 2 0 范圍，用石油醚將樣品處理液中油脂提 取可以較好消除檢測干擾。通過對e l i s a 方法定量檢測a f b l 的可行性進行系統(tǒng) 的研究和驗證，建立了e l i s a 方法評價指標，確立了e l i s a 定量分析的質控參 數(shù)，e l i s a 分析方法的線性范圍為o 1 p _ g k g 1 0 v t g k g ，相關系數(shù)為o 9 9 2 1 。向樣 品中分別添加1 p , g k g 、5 p , g k g 、1 0 p , g k 9 3 個濃度水平的a f b l 標準品，平均回收 率分別為7 8 2 5 ，9 0 9 ，8 4 5 5 ，檢測靈敏度為o 0 1 i | t g k g 。同時，應用g b t 1 8 9 7 9 2 0 0 3 食品中黃曲霉毒素的測定一免疫親和層析凈化高效液相色譜法與 e l i s a 方法進行對照實驗，并向樣品中分別添加1 1 x g k g 、5j _ t g k g 、1 0 1 a g k 9 3 個 濃度水平的a f b l 標準品，平均回收率為7 3 3 7 ，8 8 4 7 ，9 3 5 8 ；兩種方法 質控參數(shù)均達到中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準s n t0 0 0 1 - - 1 9 9 5 出 口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素檢測方法標準編寫的基本規(guī)定。應用兩種 方法對樣品測定值進行研究分析，擬合回歸方程為：y = o 9 8 0 3 x + 0 1 2 9 4 相關系 數(shù)為：0 9 7 8 6 。從回歸方程和相關系數(shù)中可以得出：e l i s a 方法和h p l c 方法相 關性較好。從而證實了e l i s a 方法用于食品分析中的可行性。并對貴州出入境 檢驗檢疫局從貴州省辣椒調味品生產(chǎn)企業(yè)抽取的有代表性辣椒調味品1 2 0 件進 行a f b l 的檢驗，檢測結果表明，油辣椒系列a f b l 含量為1 6 9 3 - 3 0 2 s 肛g k g ，糟 辣椒系列a f b l 含量為o 6 3 2 1 0 7 9 1 a e d k g ，香辣菜系列a f b l 含量為 貴卅l 大學顧士學位論文辣椒調味品中黃曲霉毒素b 檢測及應用 o 5 9 9 0 9 5 6 p g k g ，雞辣椒系列a f b l 含量為1 1 1 9 - 1 8 7 4 p g k g ，風味豆豉系列 a f b l 含量為3 9 7 9 6 3 9 1 p g k g ，肉絲豆豉系列a f b l 含量為3 6 1 4 - 4 6 9 6 9 9 k g ， 辣三丁油辣椒系列a f b l 含量為1 9 1 7 2 7 4 2 9 9 k g ，初步掌握了辣椒調味品中 a f b l 污染情況。 本文對e l i s a 方法檢測辣椒調昧品中a f b l 的不確定度依據(jù)分層建模理論進 行了評定。并對樣品的均勻性以及在稱量、提取、凈化和儀器檢測等過程中引起 的不確定度進行了逐層分析，根據(jù)不同類型分別評定，其中稱量的相對標準不確 定度2 9 1 x 1 0 ，樣品稀釋準備的相對標準不確定度6 2 6 1 0 一，a f b l 標準品校準 帶來的相對標準不確定度1 0 0 2 1 0 0 ，e l i s a 實驗操作過程的不確定度 2 8 5 1 0 。2 ，酶標儀讀數(shù)相對標準不確定度及數(shù)據(jù)處理帶來的相對標準不確定度均 為5 x 1 0 一，通過分步計算和整體合成，辣椒調味品測定合成不確定度為3 1 7 ； 在置信水平9 5 時，擴展不確定度為6 3 4 ：通過評定確定了檢測結果置信范圍， 合理地表征被測量值的分散性。使附有不確定度說明的測量結果更加完整并具有 一定意義。 本文分析辣椒調味品中a f b l 影響因素，建立了快速、批量檢測辣椒調味品 中a f b ，的方法，同時對檢測結果進行不確定度評估，確定檢測結果置信范圍， 并對并對貴州省貴陽市市場上購買的1 2 0 件辣椒調味品樣品進行a f b l 的檢驗，初 步掌握了貴州省貴陽市市場上辣椒調味品中a f b ，污染情況。為擴大辣椒調味品 出口、確保產(chǎn)品質量、打破國外技術壁壘，加快貴州經(jīng)濟發(fā)展做出一定貢獻。 關鍵詞：辣椒；調味品；黃曲霉毒素b 1 ：e l i s a ；h p l c ；不確定度 i i 貴卅1 大學碩十學位論文辣椒調味品中黃曲霉毒素b 檢測及應用 a b s t r a c t t h ec a p s i c u mo fg u i z h o up r o v i n c eh a sl u s t e rm d d y oh i 曲o i lc o n t e n t ，t h i c kf l a g r a n c e a n ds u i t a b l eh o t n e s sc h a r a c t e r i s t i c sa n ds oo n i ti st h ee x t r e m e l yg o o dr a wm a t e r i a lo f t h e c a p s i c u ms e r i e sp r o d u c t a tp r e s e n t ，t h ec a p s i c u mh a sa l r e a d yb e e ne m e r g i n gi n d u s t r yo ff o o d i n d u s t r yi ng u i z h o u ，i t sa l s ow a se x p o r t sf o o dt h ei m p o r t a n tp r o d u c t ，a n dh a sb e e ns o l di n2 1 c o u n t r i e sa n dt h ea r e a t oe n s u r ef o o ds a f e t ya n dt h en e e d so fo u t p u t ，t h em e t h o do f d e t e c t i n ga f l a t o x i n ，w h i c hi sh i g hs e n s i t i v i t y , s t r o n gs p e c i f i c i t y , s i m p l e ，f a s ta n de a s y t op u ti n t oe f f e c t , i sb a d l yn e e d e d t h i sa r t i c l es t u d i e da n de v a l u a t e dt h ea p p l i c a t i o no fe l i s ai nt e s t so fa f b li n c a p s i c u mf l a v o r s o m ef a c t o r st h a tc o u l db r i n ge r r o r st or e s u l t sw e r ea l s oa n a l y z e d i t w a sf o u n dt h a te l i s aw a so ff e a s i b l ew a yt od e t e c to fa f b li nc a p s i c u mf l a v o r p r o d u c t s s o m ec o n t r o lp a r a m e t e r si nq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fe l i s aw e r ee s t a b l i s h e d 功er e s u l t sc e r t i f i e dt h ef e a s i b i l i t yo f e l i s ai nd e t e c t i o no f a f b li nc a p s i c u mf l a v o r e l i s as h o w e dl i n e a rr a n g eo f0 1 g & g - lo o g & g t h er e l a t e dc o e f f i c i e n tj so 9 9 21 a d d i n ga f b lt oc a p s i c u mf l a v o rs a m p l e s ，t h ec o n c e n 仕a f i o ni s 1g g k g ，5 9 9 k ga n d l o p g k gs e p a r a t e l y ，a v e r a g er e c o v e r yr a t ei s7 8 2 5 9 0 9 a n d8 4 5 5 s e n s i t i v i t y i so ，1 p g k g e f f e c to f p h ，s a l t e dd e n s i t ya n df a to nt h et e s t i n gr e s u l t so f e l i s aw e r e a l s os t u d i e d t h ei n f l u e n c eo ft h e s ef a c t o r sh a sc e r t i f i e di nt h er e s u l t s h o w e v e r ，t h e s e e f f e c t sc o u l db ed i m i n i s h e dw h e nt h ee x t r a c t i o nw a s1 e a c h e dw i t hc e r t a i ns o t v e n t s b e f o r et e s t i n g t h er e s u l t sw o u l dp r o v i d et h e o r yi n f o r m a t i o nt ot h ef o u n d a t i o no f e x t r a c t i o nm e t h o d so f a f b li nc a p s i c u mf l a v o rs a m p l e t h e u n c e r t a i n t yo fd e t e r m i n a t i o no fa f l a t o x i nb lb ye l i s am e t h o di nt h i sp a p e r i se v a l u a t e db a s e do nt h et h e o r yo fl a y e rm o d e l i n ge v a l u a t i o n t h em o d e lo fe a c h s u b v a r i a b l ea r ee s t a b l i s h e du n d e rt h ei n d i v i d u a la n a l y s i so ft h e u n c e r t a i n t yc a u s e db y t h e h o m o g e n e i t y o fs a m p l e ，t h e p r o c e s s e ss u c h a s e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o na n d i n s t r u m e n t a ld e t e c t i o ne t c s y n t h e s i su n c e r t a i n t yi s3 1 7 ，e x p a n s i o nu n c e r t a i n t yi s 6 3 4 b yc o m p a r i s o nw i t ht h em e t h o do fe l i s a ，w eu s e dg b t18 9 7 9 2 0 0 3t o d e t e r m i n ea f l a t o x i n sc o n t e n ti nf o o d c l e a n u pb yi m m u n o a f f l n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n d i i i 貴i i 大學碩士學位論文 辣椒調味品中黃曲霉毒素b 椅測及應用 d e t e r m i n a t i o nb yh i 曲一p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt h r o u g ht h ec o n t r o l e x p e r i m e n t ，a n da d d e da f b lt oc a p s i c u mf l a v o rs a m p l e s ，w h i c hc o n c e n t r a t i o ni s 1p g k g ，5 9 9 k ga n dlo g g k gs e p a r a t e l y , t h e nw eg a i n e da v e r a g er e c o v e r yr a t et h a ti s 7 3 3 7 8 8 4 7 a n d9 3 5 8 a n dt h er e l a t e dc o e f f i c i e n t so 9 7 8 6 c o m p a r i n gt h r o u g h t h ee x p e r i m e n t ，t h ee l i s am e t h o da n dt h eh p l cm e t h o dh a v eb e t t e rc o r r e l a t i o n t h e r e f o r ew ec o n f i r m e dt h ee l i s am e t h o du s e di nf o o da n a l y s i si sf e a s i b l e a t i e r d e t e r m i n i n gt h e1 2 0c a p s i c u mf l a v o rs a m p l e sf r o mt h eg u i z h o up r o v i n c eb ye l i s a ， t h e ya l lr e a c hn a t i o n a ls t a n d a r d s i nv i e wo ft h e c o m p l e x i t yo fc o n s t i t u e n to fc a p s i c u m f l a v o ri n g u i z h o u ， i n f l u e n c i n gf a c t o r so fi t sa f b lh a v eb e e na n a l y s e d ，t h em e t h o do ff a s ta n db a t c h d e t e r m i n a t i o no fa f b l ，i nt h i s w a y , q u a l i t ys a f e t yo fc a p s i c u mf l a v o r c a nb e g u a r a n t e e d ，i t se x p o r tc a nb ep r o m p t e d ，a n di tc a nd oac e r t a i nc o n t r i b u t i o nt ot h e p r o s p e r i t yo f g u i z h o u k e yw o r d s ：c a p s i c u m f l a v o ra f l a t o x i nb ie l i s ah p l c u n c e r t a i n t y 辣椒調味品中黃曲霉毒素b ，檢測及應用 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行 研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內容外，本論文不包含任何其他 個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究曾做出重要貢獻的 個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律責 任由本人承擔。 論文作者簽名： 芻趣 日期： 關于學位論文使用授權的聲明 本人完全了解貴州大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留 或向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借 閱；本人授權貴州大學可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫 進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文和匯編本學位論文。 ( 保密論文在解密后應遵守此規(guī)定) 論文作者簽名：弛導師簽名： 日期： 貴州大學碩士學位論文 辣椒調味品中黃曲霉毒素b ，檢測及應用 第一章前言 1 1 黃曲霉毒素的研究背景 早在一九一五年，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，油料作物的種子榨油后的油餅，發(fā)霉以后用作 飼料時，會引起家畜中毒。一九四0 年人們發(fā)現(xiàn)，黃曲霉的培養(yǎng)物能使動物中毒。直到 九六0 年六月到八月問，英國英格蘭南部及東部地區(qū)，有十萬只火雞，由于不知名的 疾病，引起迅速死亡。因病因不明，定為“火雞的x 病” 3 3 1 。后來又發(fā)現(xiàn)在小雞、小鴨、 野雞、豬小牛和魚類中，也發(fā)現(xiàn)類似的疾病。經(jīng)病理檢查發(fā)現(xiàn)，肝實質細胞退行性變， 膽管上皮細胞異常增生。經(jīng)過兩年的研究發(fā)現(xiàn)，從飼料中分離出的黃曲霉所產(chǎn)生的熒光 代謝物質造成了火雞死亡，將其命名為黃曲霉毒素，該結果引起了全世界的轟動。這一 結果開辟了真菌毒素毒理學和檢測技術研究的熱潮。 自從一九六0 年英國發(fā)現(xiàn)火雞的黃曲霉毒素中毒癥以來，世界各國對真菌毒素開展 了大量的研究工作。一七一一年起，人們發(fā)現(xiàn)吃進污染麥角菌引起中毒開始到現(xiàn)在，在 各種真菌毒素中，己發(fā)現(xiàn)毒性強的有黃曲霉毒素( a f l a t o x i n ) 、赭曲霉毒素( o c h r a t o x i n ) 、 黃綠青霉素( c i t r c o v i d d i n ) 、紅色青霉素b ( r u b r a t o x i nb ) 和青霉酸( p e n i c i l l i ca c i d ) 等。按目前的研究，黃曲霉毒素( b l 、g i ) 、黃變米毒素( 1 u t e o s k y r i n ) 、展青霉素( p a t u l i n ) 和島青霉毒素( i s l a n d i t o x i n ) 等六種可以使實驗動物致癌。在這六種能致癌的真菌毒素 中，黃曲霉毒素b l ( a f b l ) 對人類和家畜的健康危害很大【1 。2 】，其后許多學者證明黃曲 霉毒素不但引起急性中毒，長期食用受其污染的食品可引起癌癥，黃曲霉毒素b l 是目 前所有致癌物中最有害的一種m3 5 3 6 3 7 1 。具有很強的毒性、致癌性、致突變性和致畸 毒性m3 8 1 。攝入后可引起人或家畜的急性或慢性真菌中毒癥( 1 1 y c o t o x i c o s l s ) 。 由于黃曲霉毒素對人、家畜和家禽的健康危害極大，甚至引起急性中毒導致死亡【3 9 1 ， 成為了最受人們注意的一種真菌毒素。近年來，美國、英國和日本等國對黃曲霉毒素都 作了大量研究工作【3 1 ，已在糧食、油料作物的種子、水果、干果、蔬菜、調味品、煙草、 黃麻、乳類、乳制品、肉類、魚蝦類、發(fā)酵產(chǎn)品和飼料內，甚至在一些酒類和食品工業(yè) 用的酶制劑中，都發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素；并對黃曲霉毒素毒性和中毒機理做了系統(tǒng)研究。 現(xiàn)在，有關黃曲霉毒素污染食品和飼料的管理條例已在美國、日本、歐盟付諸實施。世 界衛(wèi)生組織、美國、日本、歐盟等多次對食品和飼料中黃曲霉毒素的最大允許量做了嚴 格規(guī)定。 我國于2 0 世紀7 0 年代初組織了2 2 個省市的衛(wèi)生防疫部門對當?shù)厣a(chǎn)的花生、花 貴州大學碩士學位論文 辣椒調味品中黃曲霉毒素b 檢測及應用 生油、玉米、小麥和豆類等糧油食品共約3 0 0 0 0 份樣品用t l c 法測定了其中的a f b l 。 調查發(fā)現(xiàn)，花生、花生油和玉米中a f b l 的污染最嚴重，大米、小麥和豆類a f b i 的污 染比較輕，南方的谷物受a f b l 的污染比北方嚴重。1 9 7 7 年測定了廣西南寧2 0 7 份玉米， 有1 6 5 份為a f b 陽性樣品，陽性率為7 9 7 。1 9 7 8 年玉米的污染率為4 0 ，1 9 8 3 年和 1 9 8 4 年分別為1 4 9 和1 8 8 ，a f b , 的水平依次為3 1 0 0 1 t g k g 、4 4 0 p g k g 、1 6 4 1 t g k g 和6 8 1 t g k g 。1 9 9 2 年的污染調查表明，a f b l 水平為5 0 , - - 1 1 0 r t g k g ，仍有5 5 6 的花 生油檢出a f b l ，含量范圍僅為5 啦1 1 1 p g k g ；有5 6 的玉米品檢出a f b j ，含量范圍 為規(guī)定的限量范圍【4 】。 近年來，世界各國對a f b 。的限量標準逐年降低，有關部門將黃曲霉毒素的研究列 為重點科研項目，在降低食品和飼料中黃曲霉毒素的同時，快速、準確的黃曲霉毒素檢 測方法的建立已取得初步進展。 1 2 黃曲霉毒素的分布、產(chǎn)生及性質 1 2 1 黃曲霉毒素的分布范圍 黃曲霉毒素分布的范圍很廣，凡是污染了能產(chǎn)生黃曲霉毒素的真菌的糧食、油料作 物的種子、水果、干果、蔬菜、調味品、煙草、黃麻、乳類、乳制品、肉類、魚蝦類、 發(fā)酵產(chǎn)品和飼料中，都有可能存在黃曲霉毒素。甚至在沒有發(fā)現(xiàn)真菌、真菌絲體或胞子 的食品和農(nóng)副產(chǎn)品上，也找到了黃曲霉毒素?；ㄉ?、玉米最易污染黃曲霉毒素，小米、 高粱、木豆和白薯次之【柏】。資料表明，全世界每年約有2 5 的谷物受到霉菌毒素的影 響”1 。因此對其必須給予足夠重視。 1 2 2 黃曲霉毒素的種類及理化性質 黃曲霉毒素( a f l a t o x i n s ) 是由黃曲霉( a s p e r g i l l u sf l a v u $ ) 、 寄生曲霉( a p a r a s i t i e u s ) 和集峰曲酶( a n o m i u s ) 的某些產(chǎn)毒菌 株產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，從一九六一年發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素以來，黃曲 霉毒素的種類越來越多。目前已經(jīng)確定出結構的黃曲霉毒素有b l 、b 2 、g l 、g 2 、m l 、 m 2 等1 7 4 “億4 3 】種，并已經(jīng)用化學方法合成出來。從化學結構上看，各種黃曲霉毒素 彼此十分相似，含c 、h 、o 三種元素，其基本結構都有一個二呋南環(huán)和一個氧雜萘鄰酮 ( c o u m a r i n ，香豆素) ；前者為毒素后者為致癌物質。黃曲霉毒素在紫外照射下能發(fā)出強 烈的熒光【們。根據(jù)其在紫外光下發(fā)生熒光的顏色及薄層層折時r f 直的不同分別命名為黃 曲霉毒素b 】、b 2 和g l 、g 2 。在3 6 5 n m 波長下b 卜b 2 呈藍紫色熒光；g l 、g 2 呈黃綠色熒光。 貴州大學碩士學位論文 辣椒調味品中黃曲霉毒素b 檢測及應用 黃曲霉毒素的分子量為3 1 2 - - 3 4 6 。其中黃曲霉毒素b l 的化學結構式如圖。黃曲霉毒素難 溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。 一般在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，但在強酸性溶液中稍有分解，在p h 9 1 0 的強堿溶液 中分解迅速。其純品為無色結晶，耐高溫，黃曲霉毒素b - 的分解溫度為2 6 8 c ，紫外線 對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性。 1 2 3 黃曲霉毒素的毒性與致癌性 黃曲霉毒素對包括家禽和家禽在內的若干動物具有強烈的毒性，其毒性作用主要是 對肝臟的損害。黃曲霉毒素在食品和飼料中含l m g k g 以上就有劇毒，其毒性是氰化鉀的 1 0 倍，為砒霜的6 8 倍。大多數(shù)產(chǎn)毒黃典霉菌產(chǎn)生黃曲霉毒素b 1 的量比其它黃曲霉毒素多， 而且黃曲霉毒素b l 在全部黃曲霉毒素中毒性最強【7 】o 因此，1 9 9 3 年黃曲霉毒素被世界衛(wèi) 生組織( w h o ) 的癌癥研究機構( i n t e r n a t i o n a la g e n c yf o rr e s e a r c ho nc a n c e r ，i a r c ) 劃 定為i 類致癌物 4 4 1 ，一般以b 。作為動物毒性試驗。動物因種類、性別、年齡、營養(yǎng)狀況 不同對黃曲霉毒素b 。的敏感性有很大差異，最敏感的動物為雛鴨。動物急性中毒時主要 表現(xiàn)為食欲下降，體重減輕，死后解剖肉眼可見肝臟出血、壞死；病理變化主要表現(xiàn)為 肝實質細胞變性、壞死、脂肪侵潤，纖維化及膽管上皮細胞增生，一次小劑量的黃曲霉 毒素造成的生理變化是可以恢復的，如果多次重復攝入則可成不可恢復性病變。除肝臟 外，其它臟器如脾、腎、睪等亦可引起退行性病變。 此外，美國b u t l e r 【4 5 1 教授以黃曲霉毒素對大鼠進行了連續(xù)四代的繁殖試驗，第一代 和第二代的飼料中各含有黃曲霉毒素量0 i _ t g k g 、l i - t g k g 、1 0 1 t g k g ，其它兩代的飼料中含 有1 0 x g k g 濃度的黃曲霉毒素，并一直喂至2 1 月齡。結果發(fā)現(xiàn)，喂低量的雌雄鼠的生 存率比對照組( 無毒的) 高。三代的受孕率相似，仔鼠的存活率與斷奶鼠的體重，不論 其飼料中含黃曲霉毒素量為1 i x g k g 或1 0 g k g ，也不論喂養(yǎng)時間的長短，都無顯著性差 異。特別是，沒有一只實驗動物發(fā)生肝癌，只是飼以含黃曲霉毒素b 11 0 0 i _ t g k g 達7 6 周 之久的大鼠肝臟損害率比對照組高。 黃曲霉毒素對實驗動物的生物化學影響，一般認為可影響一些與肝臟有關的酶活性 變化，如使血清中異檸檬酸脫氫酶、堿性磷酸酶、轉氨酶的活性增高，有人還認為可影 響酶和脂肪的代謝。 黃曲霉毒素可使魚類和哺乳類動物誘發(fā)肝癌，其作用的靶器官主要為肝臟 4 6 1 。它 能夠導致肝臟壞死、癌變、肺癌、結腸癌、胃癌、腎腫瘤掣4 7 】，引起急性和亞急性中毒， 貴州大學碩士學位論文 辣椒調味品中黃曲霉毒素b 。檢測及應用 各種動物對黃曲霉毒素致癌的敏感性不同，如以最低致癌劑量比較，魚最敏感，在其飼 料中含有黃曲霉毒素b 1 0 1 t t g k g ，9 個月后即可引起肝癌；大鼠飼料中含黃曲霉毒素 b 1 5 t t g k g ，6 7 周后導致肝癌【4 8 1 。大鼠致癌試驗中，大劑量數(shù)次攝入和4 , n 量反復攝入 都可導致大鼠發(fā)生肝癌，后者出現(xiàn)較前者遲，這說明黃曲霉毒素在致癌性上存在著“劑 量與反應”的關系。關于猴的致癌試驗，有報導一例雄猴，每日每公斤攝入典曲霉毒素 b 0 0 2 m g ，5 年半年后發(fā)生巨大肝細胞癌【“5 0 1 。 黃曲霉毒素除主要可引發(fā)肝癌外，由于毒素侵入試驗動物的途徑不同，也可引起其 它部位如腎、胃、支氣管、腺體和皮下組織的癌腫。 美國b u t l e r 【5 1 1 教授曾將黃曲霉毒素b i 與過去認為致癌性極強的一些化合物進行比 較，對大白鼠經(jīng)口攝入致肝癌量，黃曲霉毒素b 1 為1 0 微克天，而二甲基亞硝胺則需 7 5 0 微克天，奶油黃為9 0 0 0 微克天，由此可見黃曲霉毒素b l 是已知致癌化學物質中的 最強的一種。 1 3 黃曲霉毒素與人類和動物健康的關系 黃曲霉毒素雖然對動物有強烈的毒性和致癌性，而且有些食物確實受到污染，但對 人類的危害，迄今為止，只有間接的驗證，尚缺直接的證據(jù)。一些流行病學的調查和研 究結果表明，世界上許多肝癌高發(fā)區(qū)，食品被黃曲霉毒素污染率較高。 江蘇省啟東市是全國肝癌發(fā)病率最高的地區(qū)，據(jù)一些專家研究顯示這與當?shù)厝藗儗?糧食儲存方法不當，再加上氣候溫暖潮濕，糧食受黃曲霉菌污染所致【8 】。 我國臺灣省曾發(fā)現(xiàn)三家農(nóng)民3 9 人中有2 5 人中毒。發(fā)霉大米為可疑食物。大米深棕 色，黃曲霉毒素b l 含量最高者為2 2 5 9 1 a g k g 及1 8 2 4 9 9 k g 。2 5 人中3 個小孩死亡，但 未做尸檢，肝臟病不明。以該批霉米喂雛鴨，肝臟顯示黃曲霉毒素中毒的病變【5 2 】。 非洲一名1 5 歲兒童食用污染a f b l 的木薯引起急性中毒死亡，經(jīng)檢測木薯中含 a f b l l 7 m g k g 。另一起為一名體重1 0 k g 兒童食用污染a f b l 的米飯2 天后死亡。經(jīng)檢測 米飯中含6 m g ，k 一叼。 a b d u l k a d a r ( 2 0 0 0 ) 報道【5 3 】，1 9 9 7 年6 月- - 1 9 9 8 年1 2 月卡塔爾進口的可食性堅果受黃曲 霉毒素b l 的嚴重污染，其中8 1 份樣品中受黃曲霉毒素b l 污染的有1 9 份，含量范圍為 0 5 3 - 2 8 9 9 9 k g ，1 9 9 8 年1 0 1 份樣品中有4 8 份樣品中黃曲霉毒素b l 含量在1 2 2 7 5 t t g k g 。 有關黃曲霉毒素在不同動物體內的代謝和引起的生物化學變化，已有一些綜述性的 報掣5 5 孤5 7 1 。但還有許多問題有待深入研究。闡明黃曲霉毒素在機體中的代謝情況， 貴州大學碩士學位論文辣椒調味品中黃曲霉毒素b 檢測及應用 對了解其中毒與致癌機理有一定的幫助。有關黃曲霉素素b l 的代謝情況，現(xiàn)己初步明 確以下幾點： 動物攝取黃曲霉毒素b l 后，在體內形成代謝物m i 。m l 是b i 的羥基化衍生物，最 初在羊奶中發(fā)現(xiàn)，故命名。牛、羊等動物食入含有黃曲霉毒素b 的飼料后，其奶中即 有m 排出，研究發(fā)現(xiàn)m l 有致癌性【1 0 1 。其外觀為白色或微黃色的粉末，分子式為 c 1 7 h 1 2 0 7 ，分子量為3 2 8 3 9 m o l 。經(jīng)毒理學研究，a f m i 的l d s o = 0 3 m g k g ( o r a l ， d u c k l i n g ) ，1 9 8 7 年w h o 將其定為一類致癌物，是公認肝致癌物和d n a 破壞劑5 8 5 9 鯽。 動物攝入b 。后，在奶、尿液、血液中都有b l 或其它代謝物檢出。組織器官中以肝 臟最為重要，各種動物肝臟均有b l 或其它代謝物出現(xiàn)，腎、脾、腎上腺中亦可含有b l ， 但在肝臟中的蓄積作用顯著較其它組織高，這可能由于肝臟是體內進行物質代謝過程的 主要器官，許多有毒物質往往在肝臟中進行代謝后，再由腎臟排出，因此尿液中亦有 b - 及其代謝物的出現(xiàn)。 1 4 黃曲霉毒素的預防及去毒 1 4 1 黃曲霉毒素預防 黃曲霉毒素對人和各類生物表現(xiàn)出很強的毒性，而且有明顯的致癌能力。因此，關 于黃曲霉毒素的預防的研究工作，非常引人注目。食品和飼料中的黃曲霉及其毒素應以 防霉為主。如前所述，糧食中霉菌生長繁殖的條件主要是適宜的溫度和水份，尤其水份 更為重要。因此，最切實可行的防霉措施是控制糧食作物在收獲后的水份含量。一般來 說，糧食作物在收獲以后迅速把水份含量( 一般可達2 5 ) 降至1 4 以下，使環(huán)境相 對濕度不超過7 0 ，溫度降至1 0 c 以下，就可防止霉菌的生長與產(chǎn)毒。因此，糧食作 物在收獲以后，應避免長時間堆放在田間，并應及時搬運到場地散開通風。特別是南方 一些地區(qū)，氣候比較炎熱潮濕，收獲后又經(jīng)常遇到陰雨，盡快設法使其干燥，防止霉菌 的繁殖，尤為重要。 經(jīng)驗證明，保持糧粒和花生外殼的完整，可以有效地防止黃曲霉菌的侵染，在收獲、 儲存、運輸各個環(huán)節(jié)中對這一點均應予以注意。 防止糧食在儲存過程中的發(fā)熱霉變，目前還試用一些化學薰蒸劑，如溴甲烷、二氯 乙烷、環(huán)氧乙烷等。前兩種是殺滅倉庫害蟲的薰蒸劑，主要通過它們殺滅倉蟲，防止蟲 體表面沾染的霉菌菌絲孢予而播散；環(huán)氧乙烷用來防霉，效果較好，據(jù)某單位試用，每 立方米用1 0 0 - 2 0 0 克，封閉數(shù)日，可使米粒的霉菌數(shù)減少9 0 以上，并且效用可維持4 貴州大學碩士學位論文辣椒調味品中黃曲霉毒素b t 檢測及應用 個月，環(huán)氧乙烷為無色液體，沸點1 0 7 ，易燃，揮發(fā)快，上述試驗于開封后第五日即 測不出殘留量。但環(huán)氧乙烷對人體有毒，使用時需注意安全。 1 4 2 黃曲霉毒素去毒方法 對于已經(jīng)含有黃曲霉毒素的食品和飼料，由于黃曲霉毒素十分耐熱，加熱到2 0 0 ( 2 才能完全被破壞，因此一般烹調加工法均不能徹底破壞毒素。當糧食作物己被黃曲霉毒 素污染時，如何去毒是一個復雜的問題，而且由于糧食作物數(shù)量大，種類多，也給去毒 工作帶來一定的困難。 目前去毒方法大部分研究國內尚處于試驗階段，當前實際應用的有以下幾種： a 人工或機械撿除霉粒：此法適用于花生仁，效果較好。由于黃曲霉毒素主要集中 在霉壞、破損、皺皮及變色的花生粒中，因此只要從花生仁中挑除霉壞粒即可使黃曲霉 毒素含量大為降低，經(jīng)嚴格挑選后可達到容許量標準以下，有人試驗5 0 公斤花生仁， 經(jīng)挑選后霉?？刂圃? 0 粒以下，則其黃曲霉毒素含量可降至5 r t g k g 以下。其中花生也 可以應用活性白土吸附法驅除花生油中的黃曲霉毒素達到同樣效果。 b 植物油的堿去毒：油料作物的種子污染黃曲霉毒素后，榨出的油中亦含有毒素。 用堿煉法去毒，能達到較滿意的效果，而堿煉法本來就是油的一種精制方法。具體作法 是用1 的燒堿精煉，再用水洗兩次( 1 0 份油用1 份水) ，然后再用白陶土9 0 作用5 - 3 0 分鐘，油中的黃曲霉毒素含量可降至5 1 t g k g 以下，堿煉法去毒的原理是n a o h 可打破 黃曲霉毒素b 。的六碳環(huán)內酯，變成香豆毒素鹽，其反應如下： 矗a 0 h c l 如加鹽酸，香豆素鹽可變?yōu)辄S曲霉毒素b l ，但香豆素鹽溶于水，在水洗時可被洗去。 c 對于喂飼動物霉變較厲害的飼料時，可通過在飼料中添加蛋白質含量較高的魚粉 等飼料也可大大降低黃曲霉毒素對動物的危害。 d 生物脫毒法該法篩選某些微生物，利用其生物轉化作用，使霉菌毒素破壞或轉變 為低毒物質。已經(jīng)報道的微生物有無根根酶、米根酶、黑曲霉、枯草桿菌等對去除黃曲 霉毒素有較好的效果。 e 輻射法紫外線或7 射線可有效地殺死霉菌和破壞黃曲霉毒素的化學結構，以達到 6 貴州大學碩士學位論文 辣椒調味品中黃曲霉毒素b 檢測及應用 去毒的目的。用高壓汞燈紫外線大劑量的照射，去毒率可達9 7 9 9 。 f 添加維生素c 維生素c 可阻斷黃曲霉毒素b l 的環(huán)氧化作用從而阻止其氧化為活 性形式的毒性物質。在日糧中添加一定量的維生素c ，再加上適當水平的氨基酸，是克 服黃曲霉毒素中毒的有效方法。 g 黏結劑法目前使用黏結劑在體外的黏結黃曲霉毒素b l 功效已經(jīng)得到肯定，主要 的黏結劑有水合硅鋁酸鈉鈣( h s c a s ) ，黏土，沸石、膨潤土、活性碳、蒙脫土等黏結 劑。但h s c a s 在體內的黏結效果同體外一樣。黏結劑對黃曲霉毒素的黏結要達到好的 ，一、 效果，對黏結劑的最起碼要求是具有多孔性，且其孔徑在o 0 1 5 - 0 0 9 0 毫米( 1 5 0 埃- 9 0 0 。 i 埃) 范圍內。 h 允許量標準的制訂，食品中有害物質允許量的制訂，除了對人民健康提供保障外， 也還能促進食品的生產(chǎn)，保障人民的生活需要。黃曲霉毒素在食品中的允許量，許多國 家也都向低的趨勢發(fā)展，但這只有在防霉去毒的措施跟上后，允許量也才有減低的基礎， 世界衛(wèi)生組織( w h o ) 建議自1 9 7 5 年4 月1 日起將1 9 7 0 年所規(guī)定的果實及其產(chǎn)品中 的黃曲霉毒素的“可行性標準”( “a c t i o n a b l el e v e l ”) 由2 0 p g k g 降至1 5 p g k g 以下，在 將來隨著檢驗水平的提高，限量標準將進一步下降。目前，我國對一般食品允許量是 5 p g k g ，在加入w t o 后，容許量將下降到o 1 1 p 啦g 。 1 5 黃曲霉毒素的限量標準 由于黃曲霉毒素的危害及分布的廣泛性，世界各國非常重視食品和飼料中存在黃曲 霉毒素的問題。很多國家都普查了黃曲霉毒素的污染情況，并采取了一定的措施，制定 了相關的標準。 世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織及國際兒童福利基金會于一九六六年規(guī)定食 品中黃曲霉毒素的最高允許量為3 0 p 眺。一九七。年起，世界衛(wèi)生組織決定將食品 中黃曲霉毒素的最高允許量由3 0 t t g k g 降低到2 0 i t g k g 。一九七五年又從2 0 1 x g k g 降低為 1 5 弘g ，k 9 1 1 l 。1 9 9 5 年世界衛(wèi)生組織制定的食品中a f b l 最高允許濃度為1 5 “g k g ，嬰兒食 品中不得檢出【6 2 】；美國聯(lián)邦政府有關法律規(guī)定人類消費食品和奶牛飼料中的總黃曲霉毒 素含量( 指b l + b 2 + g 1 + g 2 的總量) 不能超過1 5 n g k g ；歐盟國家的規(guī)定更加嚴格，要求人類 生活消費品中的a f b i 的含量不超過2 姍肚g ，總量不超過4 峙依一6 3 】。我國對a f b l 的污染 和控制也非常重視，曾組織專門人員對肝癌高發(fā)區(qū)的江蘇、廣西等省連續(xù)多年進行流行 病學調查和監(jiān)測，并在1 9 8 2 年頒布了糧油和發(fā)酵食品中的a f b - 允許量標準。各國對食品 貴州大學碩士學位論文 辣椒調味品中黃曲霉毒索b 一檢測及應用 和飼料中黃曲霉限量正逐年降低，并根據(jù)本國情況制定了嚴格的標準。 下面是部分國家和地區(qū)制定的黃曲霉毒素限量標準，見表1 1 。 表1 1 部分國家和地區(qū)對食品中黃曲霉毒素的最高允許含量【1 2 】 1 6 黃曲霉毒素分析方法概述 ，) 由于黃曲霉毒素具有毒性大、致癌力強、含量低( 通常0 2 0 0 p g k g ，即0 2 0 0 a g k g ) 一 和結構相似的特點，目前食品中a f b - 限量已經(jīng)成為限制出口的技術壁壘，為保障食用 者健康及對出口貿易需要，提高a f b l 的檢測能力、發(fā)展快速準確靈敏的檢測技術勢在 必行。自6 0 年代以來，建立的檢測方法已經(jīng)達3 0 余種，這些方法可分為五大類【13 】：一 類是定性檢測方法，主要是一些簡單生物學方法( 約1 0 種，現(xiàn)在已停止使用) ；第二類是 半定量檢測方法如薄層色譜法( t l c ) ；第三類是定量檢測方法，包括建立在色譜基礎 上的理化方法，如液相色譜法( l c ) 、高效液相色譜法( h p l c ) 、和近年來新發(fā)展的質 譜檢測( m a s s ) ；第四類是建立在免疫化學基礎上的可快速測定的方法，如放射免疫測 定( r i a ) 和酶聯(lián)免疫測定方法( e l i s a ) ；第五類是免疫化學和儀器分析結合的方法免 疫親和柱一熒光分光光度法、免疫親和柱h p l c 法【1 4 “甑6 6 1 等。 1 6 1 薄層色譜法( t l c ) t l c 法是檢測a f b l 的最常用的方法，也是我國測定食品及飼料中a f b l 的國家標 準之一，其原理是試樣中黃曲霉毒素b 。經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在波長3 6 5 n m 紫 外光下產(chǎn)生藍紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定含量1 1 5 】。t l c 有 單向展開和雙向展開法，其中雙向展開法能進一步除去樣品中的雜質，提高靈敏度，省 貴州人學碩十學位論文辣椒調味品中黃曲霉毒素b t 檢測及應用 去了柱層析等凈化操作步驟。由于t l c 方法測定黃曲霉毒素b 1 不是很專一，樣品中其 他熒光物質的干擾，使其它雜質的r f 值與a f t b l 一致，造成測量誤差，要確定是否是 黃曲霉毒素，常常需要其它的實驗來驗證。 為提高t l c 分辨率，高效薄層層析法( h p t l c ) 已廣泛應用于一些樣品的黃曲霉 毒素的測定，c o k 一6 7 】認為：利用h p t l c 法分析黃曲霉毒素可根據(jù)分析樣品，改變各種 分析條件，如溶劑、進樣技術、展開槽、檢測方式等，以得到最佳效果。用雙向h p t l c 快速分析農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素，以苯一乙腈萃取，無水乙醚初展，再以c h c l 廣二甲苯一 丙酮展開，3 6 6 n m 檢測，可使b l 、b 2 、g 卜g 2 的檢出限達o 8 、o 4 、o 7 、o 4 p , g k g 。薄 層掃描儀的出現(xiàn)，使t l c 或h p t l c 法實現(xiàn)了定性定量的自動化，而不需要目測最低黃 曲霉毒素含量，展開后可選擇一定波長，以標準品作對照，直接測定a f t b l 的含量，使 分析速度加快。 雖然t l c 法由于設備簡單，成本低，易于普及到基層單位測定，國內外仍然使用， 但由于該方法操作步驟多，樣品前處理煩瑣，并且提取和凈化效果不夠理想，提取液中 雜質較多因而在展開時影響斑點的熒光度，導致靈敏度下降。但t l c 法是a f b l 的經(jīng)典 方法，仍為普通實驗室的