基因工程的基本操作步驟4.ppt

1 2基因工程的基本操作程序 基因工程基本操作的四個步驟 1 目的基因的獲取 2 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 3 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 4 目的基因的檢測與鑒定 一 目的基因的獲取 1 目的基因主要是指 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 也有一些具有調(diào)控作用的因子 2 獲取目的基因的方法 1 從基因文庫中獲取 2 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增 3 人工合成 一 從基因文庫中獲取目的基因 1 基因文庫 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷 導(dǎo)入到受體菌的群體中 各個受體菌分別含有這種生物的不同基因 稱為基因文庫 2 基因文庫的分類 種類 基因組文庫 含有一種生物的全部基因 部分基因文庫 只包含了一種生物的部分基因 如 cDNA文庫 基因文庫的構(gòu)建過程 通過對受體菌群體的培養(yǎng)而儲存一種生物的全部基因 基因組文庫 3 基因文庫的構(gòu)建方法 提取生物某發(fā)育時期的mRNA 單鏈DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 雙鏈CDNA 只含該生物部分基因 與載體連接導(dǎo)入到受體菌群儲存 cDNA文庫 基因組文庫和cDNA文庫比較 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 補(bǔ)充內(nèi)容 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 啟動子 終止子 不編碼蛋白質(zhì) 編碼蛋白質(zhì) 連續(xù)不間斷 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 調(diào)控遺傳信息表達(dá) 上游有啟動子 下游有終止子 啟動子 真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 補(bǔ)充內(nèi)容 編碼區(qū) 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 內(nèi)含子 外顯子 啟動子 終止子 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 外顯子 能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子 不能編碼蛋白質(zhì)的序列 有調(diào)控作用 上游有啟動子 下游有終止子 非編碼序列 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較 思考 編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì) 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎 連續(xù) 不連續(xù) 編碼區(qū) 非編碼 真核生物mRNA的形成 編碼區(qū) 非編碼區(qū) RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 非編碼區(qū) 轉(zhuǎn)錄 加工 剪切 拼接 成熟mRNA 只對應(yīng)外顯子部分 初級轉(zhuǎn)錄物 補(bǔ)充資料 基因組文庫和cDNA文庫比較 依據(jù) 目的基因的有關(guān)信息如 根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性 4 從基因文庫中得到目的基因的方法 概念 PCR全稱為 是一項在生物 復(fù)制 的核酸合成技術(shù) 條件 原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 體外 特定DNA片段 DNA復(fù)制 模板DNA 四種脫氧核苷酸 DNA引物 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 二 利用PCR擴(kuò)增目的基因 方式 以 方式擴(kuò)增 即 n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù) 結(jié)果 指數(shù) 2n 使目的基因的片段在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增 過程 a 變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 復(fù)性 復(fù)性55 60 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成與模板互補(bǔ)的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 前提 有一段已知目的基因的核苷酸序列 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測 推測 目的基因 化學(xué)合成 DNA合成儀 三 人工合成 若基因 核苷酸序列 可用此法 較小 已知 化學(xué)合成法 mRNA cDNA單鏈 cDNA分子 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 三 人工合成 反轉(zhuǎn)錄法 與直接提取的DNA相比cDNA不含有 和 等結(jié)構(gòu) 真核生物mRNA的形成 編碼區(qū) 非編碼區(qū) RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn) 非編碼區(qū) 轉(zhuǎn)錄 加工 剪切 拼接 成熟mRNA 只對應(yīng)外顯子部分 初級轉(zhuǎn)錄物 補(bǔ)充資料 a 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代 b 同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用 1 基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的 二 表達(dá)載體的構(gòu)建 2 基因表達(dá)載體的組成 目的基因 標(biāo)記基因 啟動子 終止子 啟動子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因 從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來 用一定的 切割質(zhì)粒 使其出現(xiàn)一個切口 露出 用 切斷目的基因 使其產(chǎn)生 3 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的 處 再加入適量 形成了一個重組DNA分子 重組質(zhì)粒 限制酶 黏性末端 同一種限制酶 的黏性末端 切口 DNA連接酶 相同 插入式 用一定的 切割質(zhì)粒 使其出現(xiàn)一個切口 露出 用 切斷目的基因 使其產(chǎn)生 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的 處 再加入適量 形成了一個重組DNA分子 重組質(zhì)粒 限制酶 黏性末端 同一種限制酶 的黏性末端 切口 DNA連接酶 相同 用同種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因 使之露出相同的黏性末端 在加入DNA連接酶 三 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 Ca 處理法 1 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 易感染雙子葉植物和裸子植物 對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力 原理 農(nóng)桿菌特點(diǎn) 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞 并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上 過程 1 將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T DNA上 2 將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌 3 用農(nóng)桿菌感染植物體細(xì)胞 2 基因槍法 適用于單子葉植物 3 花粉管通道法 2 將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 方法 顯微注射法 程序 取卵 顯微注射 受精卵 早期胚胎培養(yǎng) 胚胎移植 3 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 用Ca2 處理細(xì)胞 原核生物特點(diǎn) 繁殖快 單細(xì)胞 遺傳物質(zhì)少 方法 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 感受態(tài)細(xì)胞 四 目的基因的檢測與鑒定 四 目的基因的檢測與鑒定 抗原 抗體雜交法 分子雜交法 DNA分子雜交法 目的基因是否翻譯 目的基因是否轉(zhuǎn)錄 目的基因是否導(dǎo)入 方法 檢測對象 結(jié)果 個體水平的鑒定 是否顯示出雜交帶 四 目的基因的檢測與鑒定 個體水平的鑒定 受體是否表現(xiàn)出相應(yīng)性狀 1 鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否具有抗蟲性可采用 實驗 2 如何鑒定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否成功 接蟲 在轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草田中澆灌鹽水 觀察其是否有抗鹽特性 3 用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人血清白蛋白 如何確定轉(zhuǎn)基因羊培養(yǎng)成功 檢測羊乳中是否含有人的血清白蛋白 基因探針 制作探針的要求 含有目的基因 單鏈 標(biāo)記 放射性同位素或熒光 歸納 基因工程的基本操作程序 獲取目的基因從基因文庫利用PCR技術(shù)人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因 啟動子 終止子 標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測 是否插入 轉(zhuǎn)錄 翻譯鑒定 是否有轉(zhuǎn)基因特性 一 乳腺生物反應(yīng)器 1 目的基因是什么 藥用蛋白基因 2 目的基因前需加的什么啟動子 乳腺蛋白基因的啟動子 3 受體細(xì)胞是什么 受精卵 4 分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞是 乳腺分泌細(xì)胞 5 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法 顯微注射法 練習(xí) 繼哺乳動物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后 膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展 最近 科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠 其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長激素并分泌到尿液中 請回答 1 將人的生長激素基因?qū)胄∈笫荏w細(xì)胞 常用方法是 顯微注射 2 進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是 通常要將外源基因轉(zhuǎn)到 中 原因是 受精卵 具有發(fā)育的全能性 體積大 易操作 3 在研制膀胱生物反應(yīng)器時 應(yīng)使外源基因在小鼠的 細(xì)胞中特異表達(dá) 膀胱上皮 練習(xí) 繼哺乳動物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后 膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展 最近 科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠 其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長激素并分泌到尿液中 請回答 4 通常采用 技術(shù)檢測外源基因是否插入了小鼠的基因組 DNA分子雜交 6 與乳腺生物反應(yīng)器相比 膀胱反應(yīng)器有什么優(yōu)點(diǎn) 不受性別的限制 沒有是否處于生殖期的限制 5 檢測人的生長激素是否成功表達(dá)可采用 技術(shù) 抗原 抗體雜交 1 基因治療概念 二 基因治療曙光初照 將健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中 從而達(dá)到治療疾病的目的 增補(bǔ)策略 2 基因治療的類型 3 基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀 處于初期的臨床試驗階段 三 蛋白質(zhì)工程的崛起 蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ) 通過基因修飾或基因合成 對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造