植物原生質(zhì)體融合技術(shù).ppt

第16章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)PlantProtoplastFusion What基本原理 Why技術(shù)應(yīng)用 How技術(shù)方法 微絲 葉綠體 線粒體 質(zhì)膜 液泡 細(xì)胞核 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 微管 細(xì)胞壁 高爾基體 植物細(xì)胞模式圖 細(xì)胞壁由三種主要成分構(gòu)成纖維素25 50 半纖維素53 和果膠5 What基本原理 去除植物細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體 誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成雜種細(xì)胞 篩選 培養(yǎng) 促進雜種細(xì)胞分裂 分化 從細(xì)胞團 愈傷組織到最后成株 Why技術(shù)應(yīng)用 植物原生質(zhì)體融合的意義 克服種 屬以上植物有性雜交不親和性障礙 為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造條件 How技術(shù)方法 第16章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)PlantProtoplastFusion 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的融合 一 植物原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義原生質(zhì)體材料來源原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的純化 1 原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義 概念 除去植物細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞 稱為原生質(zhì)體意義 1 植物原生質(zhì)體 具有再生完整植株的力 2 為細(xì)胞融合研究提供了可能 有可能產(chǎn)生異源雜交新品種 3 由于除去了細(xì)胞壁 降低了細(xì)胞的DNA酶活性 從而有助于外源DNA的進入 為再生成具有新性狀的植物體提供有利條件 4 是開展遺傳理論研究的材料 植物原生質(zhì)體在理論研究和細(xì)胞工程中的地位 信息傳遞 能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞壁合成機理膜的結(jié)構(gòu)與功能核質(zhì)關(guān)系雜交或自交不親和的機理細(xì)胞間的相互作用植物激素的作用機理 融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種分離各種細(xì)胞器引入各種細(xì)胞器導(dǎo)入外源基因誘發(fā)突變體 純化后的葉肉原生質(zhì)體 2 原生質(zhì)體材料來源 植物葉片 取材容易 比較容易用酶解法分離 植物根尖組織 可由各種植物的種子萌發(fā)后取得 植物花粉 產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體 愈傷組織 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞 細(xì)胞壁容易解離 3 原生質(zhì)體的分離 A 原生質(zhì)體的分離方法 機械分離法 先將細(xì)胞放在高滲溶液中預(yù)處理 待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離 原體質(zhì)體收縮成球形式 再用機械法磨碎細(xì)胞 從傷口處可以釋放出完整的原生質(zhì)體 優(yōu)點 該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用 缺點 獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少 酶解分離法常用的細(xì)胞壁降解酶種類 纖維素酶 半纖維素酶 果膠酶 果酸酶等優(yōu)點 可以獲得大量的原生質(zhì)體 而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴俳M織或細(xì)胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體 缺點 酶制劑中均含有核酸酶 蛋白酶 過氧化物酶以及酚類物質(zhì) 影響所獲原生質(zhì)體的活力 B 影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素 1 不同種類植物或不同組織和細(xì)胞 其細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)有差異2 滲透壓穩(wěn)定劑 如甘露醇 山梨醇 蔗糖 葡萄糖 鹽類 KCl MgSO4 7H2O 等3 質(zhì)膜穩(wěn)定劑 如葡聚糖硫酸鉀 氯化鈣 磷酸二氫鉀等增加對質(zhì)膜的穩(wěn)定性4 酶液的pH值 一般在5 4 6 05 溫度因子6 植物材料的生理狀態(tài) 如株齡 發(fā)育狀態(tài) 栽培條件等對取材影響很大 C 分離原生質(zhì)體所用的酶液和穩(wěn)定劑 煙草葉肉細(xì)胞 0 5 MacerozymeR 10果膠酶 2 OnozukaR 10纖維素酶 0 7M甘露醇 煙草懸浮細(xì)胞 2 Driselase纖維素酶 2 Cellusase纖維素酶 0 5 Macerozyme果膠酶 海水 胡蘿卜懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞 2 Onozuka纖維素酶 0 5 Driselase纖維素酶 0 5 Rhoxyme半纖維素酶1 Pectinase果膠酶 0 35M甘露醇 0 35M山梨醇 甘藍(lán)等的根細(xì)胞 4 Maicelase纖維素酶 2 Rhozyme半纖維素酶 0 3 Macerozyme果膠酶 0 7M甘露醇 番茄無菌苗的子葉和葉肉細(xì)胞 1 5 Cellulysin纖維素酶 0 3 Macerozyme果膠酶 102 6g L蔗糖 水稻種子的愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 2 OnozukaRs纖維素酶 1 Driselase纖維素酶 2 MacerozymeR 10果膠酶 1 Pectolyase果膠酶 0 3M葡萄糖 4 原生質(zhì)體的純化 去除破碎的原生質(zhì)體 末去壁的細(xì)胞 細(xì)胞器及其他碎片等雜質(zhì) A 過濾法B 漂浮法C 離心法 例 煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的分離 1 材料的準(zhǔn)備與消毒 2 酶解 3 純化 4 原生質(zhì)體的活力測定 1 材料的準(zhǔn)備與消毒 選取在溫室中生長兩個月左右的煙草植株從生長健康的植株上摘取充分展開的嫩葉片經(jīng)自來水沖洗干凈后放入70 乙醇中進行表面消毒然后再放入2 次氯酸鈉溶液中處理10分鐘接著用無菌水洗滌3 4次 以充分除去消毒劑 2 酶解 用一把尖鑷子 小心撕去葉片的下表皮 將葉片切成2cm長的小片 然后放入含酶溶液中處理 注意 使撕去表皮的一面朝下 溫度25 28 下經(jīng)3 4小時的酶解反應(yīng) 其間輕輕搖動培養(yǎng)皿若干次 3 純化 將酶解懸浮液通過300 400目網(wǎng) 以除去大的未消化的碎片然后將含有原生質(zhì)體的酶液收集在離心管中 低速離心 使原生質(zhì)體沉于管底 傾去上清液在離心管中加入適量洗滌液 再離心 重復(fù)此步驟3次 使酶解液充分除去 最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心一次 分離 洗滌 純化原生質(zhì)體的試劑 試劑分離洗滌純化KH2PO427 2mgKNO3101mgCaCl2 2H2O1480mgMgSO4 7H2O240mgKI0 16mgCuSO4 5H2O0 025mg甘露醇13 纖維素酶4 果膠酶0 4 蔗糖 21 pH5 65 65 6 與分離試劑相同 與分離試劑相同 4 原生質(zhì)體的活力測定 形態(tài) 把形態(tài)上完整 富含細(xì)胞質(zhì) 顏色新鮮的原生質(zhì)體釋放到降低滲透壓濃度的洗滌液或培養(yǎng)基中 即可見到分離后縮小的原生質(zhì)體會恢復(fù)原態(tài) 成為正常膨大的一般是有活力的原生質(zhì)體 染色法 用0 1 酚藏花紅液染色 活的原生質(zhì)體能著紅色用熒光素雙醋酸酯 FDA 染色 在熒光顯微鏡下觀察到帶有熒光的是有活力的原生質(zhì)體 FDA法的原理 FDA本身不具有極性 不能發(fā)出熒光 可以自由出入細(xì)胞膜 在活細(xì)胞中 FDA被酯酶裂解 釋放出有極性的熒光素 熒光素不能自由穿越質(zhì)膜 在活細(xì)胞中積累 熒光素在死細(xì)胞中不能積累 在UV照射下 活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出綠色熒光 FDA 熒光素 請思考 活細(xì)胞 死細(xì)胞 FDA先用丙酮配成0 5 的母液 終濃度為0 01 原生質(zhì)體分離純化流程圖 第16章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)PlantProtoplastFusion 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的融合 二 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 1 原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法2 原生質(zhì)體培養(yǎng)程序3 原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵 固體培養(yǎng)法原生質(zhì)體按照一定細(xì)胞起始密度 均勻分布于薄層固體培養(yǎng)基中此法優(yōu)點有利于對單個原生質(zhì)體的胞壁再生和對細(xì)胞團形成的全過程進行定點觀察淺層液體培養(yǎng)法 在培養(yǎng)皿或三角瓶中注入3 4ml原生質(zhì)體培養(yǎng)液 然后將純凈的原生質(zhì)體 按一定的細(xì)胞密度注入并進行培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法在固體培養(yǎng)基上 加入適宜原生質(zhì)體胞壁再生和細(xì)胞分裂的液體培養(yǎng)基 1 原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法 2 原生質(zhì)體的培養(yǎng)程序 細(xì)胞壁再生 體積膨大 葉綠體重新排列 新的細(xì)胞壁開始合成 細(xì)胞由球形變成橢圓形 細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團 一般在培養(yǎng)2 3天后細(xì)胞質(zhì)增加 細(xì)胞器增殖 DNA 蛋白質(zhì)等合成增加 細(xì)胞分裂 形成小的細(xì)胞團 發(fā)育成愈傷組織或胚狀體 器官形成植株再生 從愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生胚狀體發(fā)育 3 原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵 原生質(zhì)體的活力影響因素 制備原生質(zhì)體的方法 滲透壓穩(wěn)定劑種類 濃度 質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類 濃度 溫度和保溫時間原生質(zhì)體密度起始密度一般為104 105個 mL細(xì)胞壁再生速度植物種類和取材的生理狀態(tài) 培養(yǎng)細(xì)胞所處的時期 酶解時所用質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類原生質(zhì)體培養(yǎng)的營養(yǎng)和環(huán)境培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)的環(huán)境 光照 溫度 濕度 第16章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)PlantProtoplastFusion 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的融合 回顧 動物細(xì)胞融合技術(shù)簡介 親本的來源 融合方法 融合細(xì)胞的篩選 融合細(xì)胞的克隆 融合細(xì)胞的鑒定 三 植物原生質(zhì)體的融合 1 植物細(xì)胞融合的概念和意義2 植物細(xì)胞融合的程序3 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法及融合劑4 細(xì)胞融合的影響因素5 細(xì)胞雜種的選擇和鑒定 1 植物細(xì)胞融合的概念和意義 細(xì)胞融合 cellfusion 概念 又稱細(xì)胞雜交 cellhybridizaion 離體條件下用人工的方法把不同的細(xì)胞通過無性方式融合成一個雜合細(xì)胞的技術(shù) 細(xì)胞融合的意義 克服種 屬以上植物有性雜交不親和性障礙為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造條件 2 植物細(xì)胞融合的程序 原生質(zhì)體分離的分離 純化 融合方法選擇 雜種細(xì)胞的篩選 愈傷組織形成器官分化植株再生 雜種植物的鑒定 3 誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法及融合劑 鹽類融合法 高Ca2 和高pH值融合 聚乙二醇 PEG 融合法 PEG與高Ca2 和高pH值結(jié)合融合法 電融合法 回顧 誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的方法 1 病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合2 化學(xué)融合劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合3 電融合法 A 鹽類融合法 鹽類融合劑種類硝酸鹽類 NaNO3 KNO3 Ca NO3 2氯化物類 NaCl CaCl2 MgCl2 BaCl2葡聚糖硫酸鹽類 葡聚糖硫酸鉀 葡聚糖硫酸鈉鹽類融合的優(yōu)缺點優(yōu)點 鹽類融合劑對原生質(zhì)體的活力破壞力小缺點 融合頻率低 對液泡化發(fā)達的原生質(zhì)體不易誘發(fā)融合 B 高Ca2 和高pH值融合 Ca2 濃度0 05mol LpH9 5 10 5 具體做法 以煙草為例 取分離 純化好的兩種親本原生質(zhì)體以1 1的比例混合 加入0 05mol LCaCl2 2H2O和0 4mol L甘露醇 再用甘氨酸鈉緩沖pH值到10 5 成為融合液 同時在37 下保溫0 5h 用0 4mol L甘露醇洗凈高CaCl2和高pH值 兩種原生質(zhì)體的融合率達到10 C 聚乙二醇 PEG 融合法 Polyethyleneglycol PEG 是一種多聚化合物 分子式H OHCH2 CH2 nOH 平均相對分子量200 20000之間融合機制 可能是由于帶有大量負(fù)電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷間在鈣離子的連接下形成靜電鍵 促使異源的原生質(zhì)體間的粘著結(jié)合用相對分子質(zhì)量為1540的PEG處理40 50min 再用培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG最后洗去PEG 得到10 的異核體 D PEG與高Ca2 和高pH值結(jié)合融合法 先用PEG處理30min PEG是相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋 然后用高Ca2 和高pH值液 稀釋PEG 引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布 從而促進了融合 再用培養(yǎng)液洗去高Ca2 和高pH值 PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過程 E 電融合法 原理 改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變 使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂 進而質(zhì)膜開始連接 直到閉和成完整的膜形成融合體 優(yōu)點 對原生質(zhì)體的損害小 融合率高 重復(fù)性強 裝置精巧 方便簡單 可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程 免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程 誘導(dǎo)過程可控性強 電融合基本過程 將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室 微電極型只有一個小室 平行電極型有4個小室 兩電極間隔3mm 整個裝置放在一個培養(yǎng)皿中微電極型 用5 12微安的脈沖電流間斷刺激1 5毫秒 原生質(zhì)體在幾秒到幾十秒鐘的時間內(nèi)會發(fā)生暫時性的收縮 兩層膜之間形成小孔 連接成橋 形成一個個泡囊 經(jīng)點連接到面連接 最后形成融合體 整個過程約10 30分平行多電極融合裝置法 經(jīng)過1兆赫如150V cm交流電場發(fā)生雙向電脈沖 原生質(zhì)體在電場力的作用下 極化產(chǎn)生偶極子 原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀 在適當(dāng)時間和強度的直流電脈沖 50ms 1 2 2KV cm 作用下 質(zhì)膜發(fā)生被擊穿 進一步形成融合體 細(xì)胞電融合過程 原生質(zhì)體的融合過程包括3個主要階段 1 兩個或多個原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近 2 局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連 彼此融合 3 融合完成 形成球形的異核體或同核體 4 細(xì)胞融合的影響因素 PEG誘導(dǎo)法 PEG規(guī)格 純度 作用時間電誘導(dǎo)法 原生質(zhì)體密度交流電壓交變電場的振幅頻率交變電場的處理時間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數(shù) 5 雜種細(xì)胞的選擇和鑒定 A 融合體的類型B 雜種細(xì)胞選擇的方法C 細(xì)胞雜種的鑒定 A 融合體的類型 自體融合 發(fā)生在親本原生質(zhì)體自身異體融合諧和的細(xì)胞雜種 具有雙親全套染色體組的異源兩倍體部分諧和的細(xì)胞雜種 雙親的染色體經(jīng)逐步排斥 便發(fā)生少量染色體的重組 然后進入同步分裂 最后形成帶有部分重組染色體的植株異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種 親本的染色體全部被排斥 但胞質(zhì)是雙親的嵌合細(xì)胞雜種 不同種的雙親原生質(zhì)體 發(fā)生了膜融合和胞質(zhì)融合 尚未發(fā)生核融合 雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生核分裂 接著形成細(xì)胞壁 最終形成嵌合體植物 B 雜種細(xì)胞選擇的方法 互補選擇法 遺傳或抗性 選擇一個葉綠體缺失突變體 這一突變體在限定培養(yǎng)基上 能分裂 分化形成植株 具有正常葉綠素的植株 在上述限定培養(yǎng)基上 則不能分裂形成大細(xì)胞團 愈傷組織 可見標(biāo)記法 凹穴培養(yǎng)皿分離法 根據(jù)融合后異核體和親本原生質(zhì)體的形態(tài)特征之區(qū)別微吸管分離法 用一種向吸管根據(jù)可見標(biāo)記吸取異核體 進行 看護培養(yǎng) 以獲得雜種植物 生長特性選擇法 利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞 物理特性選擇法 利用親本原生質(zhì)體大小 顏色 漂浮密度及電脈差異率等差異選擇雜種 其他方法 如采用顯微操作技術(shù)也