（動(dòng)物遺傳育種與繁殖專業(yè)論文）小鼠胚胎附植中no對(duì)子宮內(nèi)膜mmp9+mrna表達(dá)的影響.pdf

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 本研究將性成熟昆明系小白鼠隨機(jī)分為未妊組( 不作處理的未妊小鼠) 、妊娠對(duì)照組 ( 注射生理鹽水的妊娠小鼠) 和妊娠抑制組( 注射一氧化氮合酶抑制劑小鼠) ，分別采用 r t - p c r 方法對(duì)各組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)金屬蛋白酶一9 ( m m p 一9 ) 基因m r n a 的表達(dá)水平進(jìn)行了 檢測(cè)，探討了胚胎附植前期、附植期和附植后期子宮m 口一9 基因表達(dá)水平的變化和n 0 對(duì) 子宮砌i p - 9 基因表達(dá)的影響，其結(jié)果如下： 1 小鼠胚胎附植過(guò)程中子宮內(nèi)膜_ 哪- 9 曲n a 的表達(dá)水平 結(jié)果表明：1 6 1 p - - 9 在性成熟未妊小鼠及正常妊娠小鼠的胚胎附植前期，附植期和附植 后期均有不同程度的表達(dá)，未妊組小鼠子宮m 驢- 9m r n a 的相對(duì)表達(dá)量為0 4 7 o 0 1 ；妊 娠對(duì)照組小鼠子宮l 刪p - 9m r n a 的相對(duì)表達(dá)量在胚胎附植前期為0 8 1 o 0 5 ，附植期為 1 5 4 0 1 0 ，附植后期為0 4 0 ：1 ：0 0 2 。與未妊組小鼠相比，正常妊娠小鼠刪p - 9m r n a 的相 對(duì)表達(dá)量在附植前期和附植期有極顯著增加( p o 0 1 ) ，附植期達(dá)到高峰，附植后期恢 復(fù)到未妊組的水平。 2 小鼠胚胎附植過(guò)程中一氧化氮對(duì)子宮內(nèi)膜m 驢_ 9 基因表達(dá)水平的影響 在抑制組中本研究利用一氧化氮合酶( n 0 s ) 抑制劑l - n a 艟，分別處理附植前期、附 植期和附植后期妊娠小鼠，觀測(cè)一氧化氮( ) 生成受抑制時(shí)子宮內(nèi)膜砌i p - 9r l r n a 表達(dá) 水平的變化。結(jié)果表明：注射n o s 抑制劑后，子宮內(nèi)膜刪p _ 9m r n a 水平在附植前期( 檢 測(cè)不到表達(dá)) 和附植期( o 4 7 0 1 5 ) 均受到明顯抑制，極顯著低于妊娠對(duì)照組同期附 植過(guò)程的砌i p - 9m r n a 表達(dá)水平( p 0 0 5 ) 。 3 一氧化氮對(duì)小鼠子宮及其內(nèi)膜形態(tài)變化及脫膜化的影響 光鏡觀察結(jié)果表明，附植過(guò)程中，妊娠對(duì)照組的子宮內(nèi)膜發(fā)育明顯，上皮細(xì)胞增高， 腺體發(fā)達(dá)，間質(zhì)疏松，間質(zhì)細(xì)胞增大，發(fā)生明顯的蛻膜樣變。相比較而言，抑制組子宮內(nèi) 膜柱狀上皮細(xì)胞相對(duì)較低，腺體數(shù)少，子宮內(nèi)膜在附植后期出現(xiàn)較明顯退行性變化，基質(zhì) 變得緊密。 綜上所述，一氧化氮作為一種內(nèi)源性平滑肌松馳劑和血管擴(kuò)張劑，對(duì)子宮內(nèi)膜 i 腳i p - g m r n a 的表達(dá)有著極為顯著的調(diào)節(jié)作用，在附植過(guò)程中一氧化氮抑制后能顯著降低 蛐i p - - 9 基因的表達(dá)，推斷n o 可能部分通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控來(lái)影響m m p - 9 的表達(dá)，并進(jìn) 一步影響子宮內(nèi)膜發(fā)育和胚胎的附植。 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 關(guān)鍵詞：胚胎附植一氧化氮子宮內(nèi)膜基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達(dá) a b s t r a c t s e x u a l m a t u r em i c ew c i er a n d o m l ya s s i g n e dt o3g r o u p s ：n o n - p r e g n a n tg r o u p ( w i t h o u t t r e a t m e n t ) 、p r e g n a n tc o n t r o lg r o u p ( t r e a t e dw i t h0 9 s o d i u mc h l o r i d e 硒e c t i o n ) a n d i n h i b i t o rg r o u p ( t r e a t e dw i t hn i t r i co x i d es y n t h a s e i n h i b i t o r ) t h em r n ae x p r e s s i o no f m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e - 9 ( h m 心- 9 ) o f 姍眥e n d o m e t r i u mi nt h eg r o u p sw a sd e t e r m i n e db y t h ei c v c f s 4 。t r a n s e r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( 盯- r c x ) t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a s t oi n v e s t i g a t ec h a n g e so fm r n a e x p r e s s i o no fm o b s ce n d o m e t r i u mm m p - 9i nt h ee a r l y i m p l a n t a t i o np h a s e ，i m p l a n t a t i o np h a s ea n dl a t ei m p l a n t a t i o np h a s ea n d t od e t e r m i n et h ee f f e c t o f n i t r i co x i d e ( n 媯o i li t 。mr e s u l t sw c g t ：a sf o l l o w s ： 1 t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fe n d o m e t r i u mm a t r i xm e t a l l o p r o t e h m s e - 9m r n ad u r i 唧n l o l l l s e e m b r y oi m p l a n t a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a st h ed i f f e r e n te x p r e s s i o no fe n d o m e t r i n mm m p 9 m r h ai nt h en o n - p r e g n a n tm i c ea n dt h ep r e g n a n tm i c ed u r i n ge m b r y oi m p l a n t a t i o n , w h i c h w c i cf o u n da tal e v e lo f0 4 7 - - - 0 0 1i nt h en o n - p r e g n a n tm i c ea n do 8 1 0 0 5i nt h ee a r l y i m p l a n t a t i o np h a s e 1 5 4 0 1 0i n t h ei m p l a n t a t i o np h a s ea n do 4 0 0 0 2i nt h el a t e r i m p l a n t a t i o np h a s e ，r e s p e c t i v e l y i nc o m p a r i s o nw i t ht h en o n - p r e g n a n tm i c e ，t h ee x p r e s s i o no f m m p - 9m r n aw a ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e di nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o n p h a s ea n d i nt h e i m p l a n t a t i o np h a s e ( p o 0 1 ) ，r e a c h i n gu pt ot h e 缸t i g i n m i nt h ei m p l a n t a t i o np h a s ea n dt h e n g e t t i n gb a c ki nt h el a t ei m p l a n t a t i o np h a s et ot h el e v e lo f t h en o n - p r e g n a n tm i c e 2 e f f e c to f n i t r i co x i d eo ne x p r e s s i o no f m t r l xm e t a l l o p r o t e i n a s e - 9m r n a d u r i n gm o u s e e m b r y oi m p l a n t a t i o n t h e c h a n g e so ft h em r n ae x p r e s s i o no fm o u s ce n d o m e t r i u mm m p - 9 w e r cd e t e r m i n e d i nt h ei n h i b i t o rg r o u p i nw h i c hp r o d u c t i o no fn ow a ss u p p r e s s e db yt r e a t m e n tw i t h 丑衄r i c o x i d es y n t h a s ei n h i b i t o rl - n a m ei nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ，i m p l a n t a t i o np h a s ea n dl a t e i m p l a n t a t i o np h a s e t h e r e s u l t sw e r es h o w e dt h a tt h em r n ae x p r e s s i o no fm o u s e c n d o m c t r i n mm l v l p - 9i nt h ee a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ( n oe x p r e s s i o n ) a n di m p l a n t a t i o np h a s e n 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 ( 0 4 7 4 - 0 1 5 ) i nt h ei n h i b i t o rg r o u pw a sr e s t m 抽e da n dw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti n p r e g n a n tc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) ；l - n a i 匝0 2m g 只處理組植入胚胎數(shù)顯著降低( p o 0 5 ) 。為迸一步探討n o t 胚胎植 入中的作用機(jī)理，用明膠酶譜方法檢測(cè)了子宮中m m p s - 2 和l 刪p s - 9 的活性，結(jié)果顯示：與 對(duì)照側(cè)相比，l - n a m e0 2m g 只處理組子宮中i 刪p - 2 的活性沒(méi)有變化，而m 腫_ 9 活性顯著 下降；l - n a m e 與s n p 合并應(yīng)用后，1 6 1 p - 9 的活性恢復(fù)正常。結(jié)果表明，n o n , j , 鼠胚胎植入 起促進(jìn)作用，這種作用可能是通過(guò)影響 伽，_ 9 的活性實(shí)現(xiàn)的。 袁益明等“”在研究n o 對(duì)哮喘大鼠m 肝s 及金屬蛋白酶組織抑制物表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn) l - a r g 組i 腳p - 2 m r n a 水平較哮喘組增加，而t 1 m p - i 水平兩組比較差異無(wú)顯著性，同時(shí)肺組 織n 擴(kuò)和n o p - 水平與m 肝2m i l m 水平呈顯著正相關(guān)，表明n 0 可能影響哮喘大鼠蛐艫一2 的表達(dá)， 改變m m p 一2 t i m p 一1 平衡。 g il b e r t 等m 1 在體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，用非選擇性n o s 抑制劑l - n m m a 抑制i l 一1 b ( 白細(xì)胞介素- 1 ) ，t n f a ( 腫瘤壞死因子一d ) 等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的n o s 表達(dá)生成 的大量n o ，發(fā)現(xiàn)l n m m a 以劑量依賴性方式增加舯一9 的合成與表達(dá)，而舯一2 表達(dá)并無(wú)明 顯的增高。u p c h u r c h 等報(bào)道了相同的研究結(jié)果。m i l i n d 等m 1 通過(guò)腺病毒載體將e n o s 基因 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，為證實(shí)n o l o 制v s m c ( 血管平滑肌細(xì)胞) 的增殖與 遷移是通過(guò)調(diào)節(jié)h 咿的活性與表達(dá)而介導(dǎo)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)e n o s 基因轉(zhuǎn)染后v s m c 的增殖明顯被抑 制，i 腳p - 2 及i & i p - 9 的活性明顯降低，而m 腫抑制劑t i m p - 2 表達(dá)明顯增加。另外，在細(xì)胞培 養(yǎng)基中加入n o 供體和c g m p 類8 - b r o m o c g m p 培養(yǎng)2 4 h 后，同樣發(fā)現(xiàn)舯一2 與硒儼一9 活性明顯降 低，表明n 0 可能通過(guò)c g m p 調(diào)節(jié)m 艫s 的活性。e b e r h a d t 等應(yīng)用n o 供體s 一亞硝基一乙酰青霉 胺( s n a p ) 發(fā)現(xiàn)在腎小球膜細(xì)胞中n o 對(duì)于i l 一1 p 誘導(dǎo)的i 刪p - 9 m r n 水平有顯著地抑制作用。 同樣表明內(nèi)源性n o 的產(chǎn)生對(duì)m 船啕的表達(dá)呈抑制作用。 m m p s 是一個(gè)結(jié)構(gòu)同源、依賴鋅離子并以e 咧成分作為水解底物的蛋白酶家族。它通過(guò) 1 4 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 對(duì)e c m 的降解而參與機(jī)體的多種生理和病理過(guò)程。對(duì)大鼠子宮分離組織的研究表明，n o s 的抑制劑能降低m m p - 2 的活性，相反n 0 的供體卻能提高m m p 一2 的活性，提示n 0 可能通過(guò)上 調(diào)m m p 一2 而參與大鼠胚胎的植入過(guò)程”。眾多研究表明，環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷( c g m p ) 是n 0 作用于 靶細(xì)胞產(chǎn)生的主要第二信使，可以通過(guò)下游許多分子發(fā)揮n o 的作用m 1 。鑒于此，沈政等 采用小鼠胚泡體外植入模型，利用n o s 抑制劑l 一單甲基一精氨酸、n o 供體s 一亞硝基一乙酰 青霉胺8 - b r c g 肝對(duì)胚泡黏附擴(kuò)展以及m m p - 2 分泌的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，n o 能促進(jìn)體外小鼠 胚泡的黏附、擴(kuò)展及m m p - 2 的分泌，提示n 0 的這些作用可能是通過(guò)c g m p 來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 2 6 問(wèn)題與展望 成功的胚胎植入要求胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育一致，體內(nèi)研究表明，n 0 可能從胚胎發(fā)育 和影響子宮環(huán)境兩方面參與胚泡植入。m 妒s 作為e c m 主要降解酶之一，是一把雙刃劍，既 有保護(hù)性作用，又有引起損傷性作用嘲。這種差異可能存在于胚胎附植的不同階段。盡 管人們對(duì)于h 咿s 的結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)特性、功能、催化機(jī)制、特異性的底物及t i m p s 對(duì)它們 抑制的機(jī)制都有了深刻的了解，但仍有許多問(wèn)題未弄明白。對(duì)于前m 妒一2 _ t i 肝一2 復(fù)物的 結(jié)構(gòu)的了解十分有助人們了解前m 儼一2 在細(xì)胞表面如何與t i 肝一2 與m t i - 砌i p 裝配在一起 n 町。然而，在細(xì)胞遷移之間是如何進(jìn)行時(shí)間與空間上的裝配這樣精確的機(jī)制尚不可知。 另外，盡管膠原酶是m 妒s 家族中首先被發(fā)現(xiàn)的成員，但到底是叫l(wèi) 型膠原酶還是裂解三螺 旋膠原酶人們還不知道。同時(shí)t i 肝一3 對(duì)a d a i i 家族的金屬蛋白酶的抑制機(jī)制也有待于人 們?nèi)フJ(rèn)識(shí)。 基質(zhì)金屬蛋白酶水解細(xì)胞外基質(zhì)是滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的前提條件，了解和掌握基質(zhì)金 屬蛋白酶的作用及調(diào)控機(jī)制，可幫助我們更精確地把握滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲行為。雖然目前 國(guó)內(nèi)外已對(duì)m 口s 系統(tǒng)在生殖中的作用作了大量廣泛的研究，但尚缺乏對(duì)a n 艫s 抑制劑如 肛儺、p n l 等在滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲及胚胎植入時(shí)的作用及作用機(jī)制的研究，深入蛋白酶抑 制劑的研究有助于防治自然流產(chǎn)、妊高征、宮內(nèi)發(fā)育遲緩等疾病，促進(jìn)避孕技術(shù)研究的 發(fā)展，并可對(duì)惡性腫瘤的治療提供新的線索。 在胚胎植入過(guò)程中n o 調(diào)節(jié)h 刪p s 的活性和表達(dá)的機(jī)理并不清楚，可能通過(guò)c g m p 等不同 的途徑調(diào)節(jié)m m p s 的變化及m m p s t i 卯的平衡，從而影響胚胎附植的成功與失敗，因而研究 對(duì)m 肝的調(diào)節(jié)作用及具有非常重要的意義。同時(shí)，了解n o 與刪p 之間的相互關(guān)系將為胚 胎附植的分子調(diào)控機(jī)理的研究提供新的手段和方法。但n 0 對(duì)m 咿的調(diào)節(jié)作用可能較復(fù)雜， 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 并不是簡(jiǎn)單的促進(jìn)或抑制，可能存在一個(gè)n o 濃度的臨界值，臨界值上下的濃度產(chǎn)生的作 用可能不同甚至相反，故仍需大量的研究。 2 研究的目的與意義 本研究將通過(guò)盯呻僳的方法檢測(cè)妊娠早期m 肛_ 9 基因的生理表達(dá)及在n 0 抑制情況 下的表達(dá)，探討胚胎附植過(guò)程中n o 和m 驢一9 的生理作用，揭示m m p - - 9 在胚胎附植前后的 生理變化特點(diǎn)，并通過(guò)不同處理下小鼠子宮內(nèi)膜的變化來(lái)了解n o 、m m p - 9 的作用機(jī)理及n o 與m 咿_ 9 之間的相互關(guān)系。研究圍繞小鼠胚胎植入過(guò)程中n o 在妊娠早期的不同時(shí)期對(duì) _ m 伊s 活性和表達(dá)的調(diào)節(jié)，探討m 肝s 活性和表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，以充分了解n o 在植入中的 作用機(jī)理，以達(dá)到進(jìn)一步了解胚胎植入的網(wǎng)絡(luò)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通路的目的。本研究對(duì)深入探討 早期胚胎發(fā)育機(jī)制，揭示其發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)規(guī)律及對(duì)了解一氧化氮、m m p - 9 的具體的生理 作用和對(duì)胚胎附植過(guò)程的作用分子機(jī)理有極其重要的意義，為提高胚胎附植率、動(dòng)物產(chǎn)仔 數(shù)及一氧化氮相關(guān)疾病的治療提供了重要的供理論依據(jù)和新思路。 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 材料與方法 1 驗(yàn)材料 1 1 試驗(yàn)用卜硝基一l 精氨酸甲酯 l - n a m e 為美國(guó)s i g m a 公司產(chǎn)品，其基本資料如下： 形態(tài)： 白色結(jié)晶 分子量：2 6 9 7 分子式：c 7 h 1 5 n s 0 4 h c l 結(jié)構(gòu)： 晰 剛、i 飛吲意訛懈t hhh ”刑 。 純度：9 8 b y 印l c 溶劑：8 2 0 ( 5 0m g m 1 ) 貯存：- 2 0 。c 避光冷凍保存 1 2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物為昆明系小白鼠，購(gòu)自湖南中醫(yī)學(xué)院小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，7 0 日齡，體重3 5 9 左 右。飼料一并購(gòu)入，自由采食，自然采光進(jìn)行飼喂，有完整的歷史記錄。 1 3 主要試驗(yàn)儀器及型號(hào) 梯度p c r 儀：德國(guó)c p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號(hào)為5 3 3 1 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠生產(chǎn)，型號(hào)為d y y - 6 b 凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)u v ps i o l m a g i n gs y s t e m 生產(chǎn)，型號(hào)為g d s 一8 0 0 0 紫外分析儀：北京六一儀器廠生產(chǎn)，型號(hào)為w d 9 4 0 3 b 紫外分光光度計(jì)；德國(guó)e p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號(hào)為6 0 3 10 5 4 3 0 超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為b d - 3 9 6 l t - 6 5 w 臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)e p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號(hào)為c e n t r i f u g e5 4 1 5 d 低溫離心機(jī)：德國(guó)c p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號(hào)為c e n t r i f u g e5 8 1 0 r 微波爐：青島海爾股份有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為h r 6 7 0 2 d w 立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，型號(hào)為l d z x - 4 0 b i 低溫離心機(jī)：德國(guó)e p p e n d o r f 生產(chǎn)，型號(hào)為c e n t r i f u g e5 8 1 0 r 1 7 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 超凈臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司 恒溫培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)有限公司 立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，型號(hào)為l d z x 4 0 b i 制冰機(jī)：德國(guó)s c o t s m a n 生產(chǎn)，型號(hào)為a f l 0 0 超純水機(jī)：重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為a u p - 1 3 5 g - 2 干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，型號(hào)為1 0 1 - 2 - b s 1 4 主要試劑及來(lái)源 t r i o l ：美國(guó)i n v i t r o g e n 公司 i 汀- p c r 試劑盒：德國(guó)m b i 公司 2 x t a qp c rm a s t e r m i x ：貨號(hào)：k t 2 0 1 ，購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司 瓊脂糖及t r i s ：購(gòu)自r o c h e 公司 g e n er u l e r t m i o o b p d n al a d d e r ：貨號(hào)：m d l 0 9 ，購(gòu)北京天為時(shí)代科技有限公司 緩沖液和常用試劑的配備： ( 1 ) w e 緩沖液：l o mm o l lt r i s c i ( p h8 0 ) 、l mm o l le d t a ( p h 8 o ) ，高壓滅 菌。 ( 2 ) 5 0 x t a e 緩沖液；2 4 2 9t r i s 溶于7 0 0 r a l 雙蒸水中，加入5 7 1 m i 冰乙酸、1 0 0 m l 0 5 m o l le d t a ( p h8 o ) ，定容至1 0 0 0 m l ，室溫存放待用。 ( 3 ) 瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液：0 2m o l le d t a 、3 0 甘油、0 2 5 - - 甲苯青、0 2 5 9 6 溴酚蘭。 。 ( 4 ) l m o l lt r i s c 1 ( p h8 o ) ：將1 2 1 i gt r i s 溶于8 0 0 r a l 雙蒸水中，加濃鹽酸 調(diào)p h 到8 0 定容至1 0 0 0 m l ，滅菌備用。 ( 5 ) 0 5 m o l le d t a ( p h8 0 ) ：8 0 0 r a l 雙蒸水加入1 8 6 1 9 二水乙二胺四乙酸二鈉， 加n a o h 調(diào)p h 值至8 0 ，定容至1 0 0 0 m l ，滅菌備用。 ( 6 ) i o d e p c ：1m ld e p c 溶解于1 l 雙蒸水中，用磁力攪拌器攪拌3 0 r a i n 以上，高 壓滅菌。 2試驗(yàn)方法 2 1 試驗(yàn)分組及處理 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 挑選性成熟、生長(zhǎng)健康、體重3 0 9 左右的雌性小白鼠。每次2 0 只進(jìn)行超排處理。下 午2 4 時(shí)腹腔注射p m s gi o i u 只，4 6 4 8 小時(shí)后腹腔注射h c 6l o i u 只，并與l o 只公 鼠按1 ：1 合籠，過(guò)夜，第二天早上8 ：0 0 檢查陰道栓，以驗(yàn)栓呈陽(yáng)性為妊娠第l d ，根據(jù)胚 胎發(fā)育特點(diǎn)( 一般4 5 d 胚泡開(kāi)始附植子宮內(nèi)膜) ，將妊娠早期分為附植前期( d i d d ) 、附 植期( d 5 d 6 ) 和附植后期( d 7 d i o ) 試驗(yàn)分三期進(jìn)行( 附植前期，附植期，附植后期) ，并隨機(jī)分為3 組，即將處于妊娠早期 各個(gè)階段( 附植前期d 4 、附植期d 6 和附植后期d 9 ) 的孕鼠隨機(jī)分為注射生理鹽水的對(duì)照組 和和注射n o s 抑制劑的n o s 抑制組以及處于相同日齡未作交配小鼠的未妊組，每組5 個(gè)重 復(fù)。對(duì)照組和n o s 抑制組采取腹腔注射的方法處理，分別于各個(gè)階段采取子宮前4 8 h ，對(duì) 照組注射生理鹽水o 1 m l 只，抑制組注射一氧氣化氮合酶抑制劑l - n a 娩( l 一硝基一精氨酸 甲酯) s m y r ，并于妊娠第4 天、6 天和9 天脫臼處死試驗(yàn)鼠，剖腹采取子宮，未妊組小鼠則 不作任何處理，并與其他組同時(shí)采取子宮。各組子宮采取后，剔凈系膜組織，隨即進(jìn)行檢測(cè)。 左側(cè)子宮用于總r n a 提取，右側(cè)子宮用于切片制作。 2 2m h p - 9 半定量r t - p c r 2 2 1 總r n a 提取 取5 0 m g 左側(cè)子宮組織樣于研磨器中，迅速加入l m i t r i z o l 試劑，研碎并劇烈振蕩至 透明的，以充分裂解細(xì)胞。室溫5 分鐘后，將上清移至新e p 管中，加入0 2 m l 氯仿，搖 動(dòng)1 5 s ，室溫放置2 3 分鐘，然后在1 2 0 0 0 印m4 c 離心1 5 分鐘。轉(zhuǎn)移約4 0 0pl 水相至 一新管內(nèi)，再加入0 5 r i d 異丙醇混勻，4 c 放置1 0 1 5 分鐘。在4 c 下1 2 0 0 0 r p m 離心1 0 分鐘。棄上清，加i m l 7 5 乙醇洗滌r n a ，4 c 7 5 0 0 r p m 離心5 分鐘。離心后，倒出乙醇， 置空氣中干燥5 1 0 分鐘，再加入適當(dāng)?shù)膁 e p c 處理水，室溫下溶解1 0 2 0 分鐘。 2 2 2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) i - ( h t t p ：w w w n c b l h i m n i h s o y ) g e n b a n k 公布的m t p 一9 基因及內(nèi)參照b - a c t i n 基因序列，通過(guò)p r i m e rp r e m i e r5 軟件按引物要求完成，并由北京奧科生物工程 有限公司合成。m m p - 9 基因引物序列為5 一t 從c c ct 6 6t c ac c g g a ct t c - 3 ( 上游引物) 和5 吐t ac g tt c cc g gc t ga t ca 6 - 3 ( 下游引物) ；內(nèi)參照且一a c t i n 的引物為5 - a c a c r gt 6 cc c at c ta c 6a 6 6 - 3 ( j z 游引物) 和5 a 6 6g g cc g ga c tc 6 tc a ta c t 一3 ( 下 游引物) 。 2 2 3 反轉(zhuǎn)錄 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 在離心管中加入3 l lgr n a 模板，1 u 1 隨機(jī)引物o l i g o ( d t ) ，8 p 1d e p c 處理水，3 5 秒簡(jiǎn)短離心，7 0 溫育5 分鐘，冰浴2 分鐘，再加入4pl5 r e a c t i o nb u f f e r ，1l ilr n a s e i n h i b i t o r ，2 工ll d n t p 3 5 秒離心，3 7 溫育5 分鐘，加入r e v e r t a i dm _ m u l vt r a n s c r i p t a s e 1pl ，共2 0pl 反應(yīng)體系4 2 溫育l d , 時(shí)后，7 0 溫育1 0 分鐘，冰浴2 分鐘。即可得n c d n a 產(chǎn)物。 2 2 4p c r 擴(kuò)增 在離心管中加入1l llc d n a 產(chǎn)物，1 2 5l llt a k a r at a qm i x t u r e ，9 5pl d d h 2 0 , 2 0 p m o l 上下游引物，反應(yīng)體積共2 51 11 。p c r 反應(yīng)條件：預(yù)熱9 5 ，5 r a i n ；然后 9 4 變性，4 5 s e c ；6 0 退火，3 0 s c c ；7 2 延伸，4 5 s e c ，3 0 個(gè)循環(huán)；然后7 2 末延伸l o m j n 。 2 2 5 瓊脂糖凝膠電泳 向1 5 m l t a e 電泳緩沖液中加入1 5 m g 的瓊脂糖，在微波爐中加熱使其溶解，稍微冷卻后， 加入濃度為0 5 | ig i i1 5 3 e b ( 溴化乙淀) 2 2u1 ，混勻后將凝膠倒入制膠板中，室溫放置 2 0 m i n ，待凝固后，小心移去梳子，取p c r 反應(yīng)液3 5l il ，用微量移液器將樣品緩緩加入加 樣孔中，6 0 v 恒壓電泳3 0 m i n ，電泳完畢后，紫外燈下觀察結(jié)果，并用凝膠圖像系統(tǒng)掃描分 析電泳結(jié)果。 2 2 6 半定量及統(tǒng)計(jì)分析 以b - a c t i n 作內(nèi)參，重復(fù)進(jìn)行3 洳4 m p 一9 和b - a c t i n 的p c r 擴(kuò)增，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電 泳檢測(cè)。運(yùn)用u v i p r o 凝膠圖像分析系統(tǒng)攝像并掃描分析，以目的基因條帶的吸光度( a ) 值 與p - a c t i n 條帶a 值的比值作為目的基因m r n a 的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。凝膠電泳圖的目的基因條 帶經(jīng)q u a n t i yo n e 軟件( b i a - r a d ) 掃描后，根據(jù)所得的各組數(shù)據(jù)計(jì)算出目的基因的相對(duì) 表達(dá)量，兩組均數(shù)間比較采用t 檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較用方差分析，顯著性差異以p o 0 5 和 p ( o 0 1 為標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)以i s 表示，均采用s a s 8 1 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 2 3 子宮組織切片的制備 2 3 1 取材 小鼠處死后，應(yīng)快速取出所需的子宮組織。取材的刀要鋒利，嚴(yán)禁用手或鑷子擠壓， 以免損傷組織。切取的組織塊厚度一般為0 5 - 1 o c m ，大小1 5 - 2 o c m ，以免影響固定效 果。 2 3 2 固定 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 固定是將組織塊用福爾馬林浸泡，使組織內(nèi)的蛋白質(zhì)等成分迅速凝固或沉淀，停止 細(xì)胞瀕死前或死亡后的變化。同時(shí)組織固定后不易變形，有利于以后的組織處理。所以 組織一旦離體必須及時(shí)固定，固定液的量大約為組織的5 倍。常用1 0 的福爾馬林、z e n k e r 氏等固定液。固定時(shí)間約為2 4 h 。 2 3 3 沖洗 固定好的組織塊需經(jīng)流水沖洗2 4 h ，沖洗不徹底容易造成脫片和染色不佳。 2 3 4 脫水和透明 脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來(lái)，以利于有機(jī)溶劑的滲入。脫水是否 徹底，直接關(guān)系到組織能否充分透明。脫水一般采取上行梯度酒精，從8 0 酒精、9 5 酒精至無(wú)水酒精。還要注意組織在無(wú)水酒精內(nèi)時(shí)間過(guò)久，容易發(fā)脆，一般約為4 h 。組織 塊脫水后就進(jìn)入透明步驟，即經(jīng)過(guò)一種既能與脫水劑混合，又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì)。 目前最好的透明劑是二甲苯，但二甲苯容易使組織發(fā)脆，所以在二甲苯中時(shí)間也不宜過(guò) 長(zhǎng)，一s t 4 0 - 6 0 m i n 。 2 3 5 浸蠟 組織透明后，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱為浸蠟。浸蠟溫度過(guò)高( 超過(guò)7 0 ) ，會(huì) 導(dǎo)致組織發(fā)硬，還會(huì)使組織內(nèi)的抗原受到破壞。浸蠟用的石蠟熔點(diǎn)一般在5 6 2 3 - 6 0 2 2 ， 浸蠟溫度控制在6 0 c - 7 0 c 。浸蠟時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響組織切片，不同的組織浸蠟時(shí)間不 同，通常較脆組織如肝、甲狀腺、脾等浸蠟2 - 3 h ，含有結(jié)締組織的器官如胃、膀胱、腸 等浸蠟時(shí)間要延長(zhǎng)6 h 。所用的石蠟如有雜質(zhì)盡可能過(guò)濾，以防附著在組織上，影響切片 與觀察。鼠塊組織時(shí)問(wèn)量化自動(dòng)脫水，透明，浸蠟流程： 乙醇溶液 7 5 3 5h 804h 9 5 i2h 9 5 i i2h 1 0 0 i 1h2 0m i n 1 0 0 i i2h2 0m i n 1 ：1 二甲苯與酒精 1 0m i n 二甲苯i 3 0m i n 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 二甲苯i i 石蠟i 石蠟i i 石蠟 2 3 6 包埋 3 0m i n 1 0m i n 1 5 m i n 3 5h 用包埋劑來(lái)支持組織的過(guò)程稱為包埋。最常用的是石蠟包埋法。包埋的關(guān)鍵是平整 和方位。包埋時(shí)，要求用鑷子輕壓組織塊拱起部份，使之平貼于底部，通常采用組織的 最大面包埋；囊壁、管腔組織應(yīng)豎直包埋。修去兩邊的余蠟( 指切片時(shí)與切片刀垂直的兩 側(cè)) 。 2 3 7 切片 切片的第一步需粗切。粗切的厚度2 0 - 4 0um ，粗切至組織全部暴露后，再進(jìn)行細(xì)切。 細(xì)切至組織塊表面均勻一致，無(wú)白點(diǎn)。切片時(shí)要求用力均勻、柔和，切片厚度一般為3 5 l im ，切下的蠟?zāi)ご笮?、形狀?yīng)與組織塊上的組織大小形狀一致。如氣溫較高，石蠟組織 塊較軟可用冰塊局部冰凍( 操作狀態(tài)下) ，使組織塊變硬便于做連續(xù)性切片；如氣溫較低、 石蠟組織塊較硬時(shí)可用大拇指熱敷或用嘴吹氣加溫，使組織塊變軟再做連續(xù)性切片。 2 3 8 展片與撈片 把切片放人溫水中展開(kāi)即為展片。展片水溫應(yīng)在4 8 c - 5 5 c ，這主要和包埋蠟的熔 點(diǎn)有關(guān)：水溫過(guò)高，會(huì)引起組織細(xì)胞散開(kāi)；水溫過(guò)低，切片皺摺無(wú)法攤平。展開(kāi)片子上 的皺摺，有兩個(gè)方法：在切片時(shí)邊切邊向蠟片吹氣，這樣片子放到熱水里會(huì)自然展平； 切片結(jié)束后，先把切片放在3 0 酒精水溶液中，讓酒精的張力自動(dòng)把皺摺展開(kāi)，然后 再將切片移到熱水中，酒精濃度不宜過(guò)高，否則容易引起切片破碎，出現(xiàn)裂隙。脂肪類 組織遇到酒精會(huì)散開(kāi)，故不能用此法。撈片時(shí)，要選擇那些完整、無(wú)皺摺的切片，粘貼 于載玻片上。 2 3 9 烤片和脫蠟 烤片是烤干切片上多涂的水分和石蠟，并使切片與載玻片牢固粘貼。一般在6 0 c 的 溫箱內(nèi)進(jìn)行，溫度過(guò)高，會(huì)引起切片的組織細(xì)胞收縮；時(shí)間太短( 少于2 0 分鐘) ，容易造 成脫片。脫蠟也相當(dāng)重要，如果脫蠟不干凈，切片不易著色或著色不勻。所以在脫蠟過(guò) 程中，脫蠟劑( 松節(jié)油) 要常更換( 用1 5 - 2 0 次) ?？酒Y(jié)束后立即將切片放在溫箱內(nèi)預(yù)熱( 4 0 c - 4 5 c ) 的松節(jié)油i 、i i 中1 5 m i n ，然后經(jīng)下行梯度酒精洗去松節(jié)油至水。 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 3 1 0 染色 染色理想的切片在顯微鏡下應(yīng)是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)藍(lán)紅相映，色澤鮮艷，核漿對(duì)比明 顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見(jiàn)。常用臟染色，以增加組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)各部分的色彩差 異，利于觀察。蘇木精( h e m a t o x y l i n ，h ) 是一種堿性染料，可將細(xì)胞核和細(xì)胞內(nèi)核糖體 染成藍(lán)紫色，被堿性染料染色的結(jié)構(gòu)具有嗜堿性。伊紅( e o s i n ，e ) 是一種酸性染料，能 將細(xì)胞質(zhì)染成紅色或淡紅色，被酸性染料染色的結(jié)構(gòu)具有嗜酸性。染色前，須用二甲苯 脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，就可染色。呱染色過(guò) 程是： 將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘。 酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘。 流水沖洗i 小時(shí)后入蒸餾水片刻。 入7 0 和9 0 酒精中脫水各1 0 分鐘。 入酒精伊紅染色液染色2 - 3 分鐘。 2 3 i i 脫水和封片 切片脫水采用上行梯度酒精。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水，但也容易 使伊紅退色故脫水時(shí)間要短( 1 2 m i n ) ，也可無(wú)須用酒精脫水而直接晾干。切片經(jīng)二甲苯 透明。用中性樹(shù)膠封片，一定要避免氣泡的產(chǎn)生。 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 結(jié)果與分析 1 總8 n a 提取結(jié)果 提取的總r n a 經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得a 2 “a 瑚在1 8 到2 0 之間，并且在o 8 瓊脂 糖凝膠電泳上可清晰看到2 8 s 和1 8 s 兩條帶( 圖2 ) ，其亮度比為2 ：1 ，并可見(jiàn)5 s 帶， 表明所提的r n a 純度高，未降解，可作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。 圖2 總p , n a 電泳圖 2 退火溫度、循環(huán)次數(shù)和引物濃度的選擇 2 1 退火溫度 根據(jù)合成引物的t m 值：采用2 ( a + t ) + 4 ( g + c ) ，正反義平均數(shù)上下波動(dòng)4 5 進(jìn)行 檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳確定以6 0 c 為最佳退火溫度。 2 2 循環(huán)次數(shù)的選擇 內(nèi)參循環(huán)次數(shù)的確定( 見(jiàn)圖3 ) ，從1 - 1 0 號(hào)帶分別為1 5 ，1 7 3 1 ，3 3 個(gè)循環(huán)，檢測(cè)結(jié)果 以2 7 個(gè)循環(huán)為最佳循環(huán)次數(shù)。1 0 1 p - 9 循環(huán)次數(shù)的確定( 見(jiàn)圖4 ) ，1 號(hào)帶為內(nèi)參，從2 - 1 0 號(hào)帶分別為2 5 ，2 7 3 9 ，4 1 個(gè)循環(huán)，檢測(cè)結(jié)果以3 7 個(gè)循環(huán)為最佳循環(huán)次數(shù)。 1284 5678 91 012345 67891 0 圖3內(nèi)參照不同循環(huán)次數(shù)電泳圖4m l p - 9 不同循環(huán)次數(shù)電泳圖 2 3 引物濃度的選擇 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 引物濃度的確定( 見(jiàn)圖5 ) ，l 、2 、3 、4 號(hào)帶分別為引物濃度5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 p m o i ，檢測(cè) 結(jié)果以4 號(hào)帶2 0 p m o i 為最佳引物濃度。 l234 圖5 砌i p - 9 不同引物濃度電泳圖 3 未妊組、妊娠組和抑制組小鼠子宮刪p _ 9 瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果 3 1 未妊組小鼠子宮m m p - 9 的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 在與對(duì)照組和抑制組的附植前期、附植期、附植后期相同日期采取未交配小鼠子宮 進(jìn)行檢測(cè)，其m m p - 9 在各時(shí)期都有相當(dāng)近似的表達(dá)( 見(jiàn)圖6 ) ，電泳圖第一條帶為m a r k e r 第2 - 6 號(hào)帶為內(nèi)參，7 - 9 號(hào)帶為m m p - 9 。 123 456789 圖6 未妊組小鼠子宮刪p _ 9 電泳圖 3 2 妊娠對(duì)照組m m p - 9 的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 在小鼠交配見(jiàn)陰栓后的第2 天、第4 天和第7 天注射生理鹽水0 1 m l 只，4 8 小時(shí)后 處死小鼠采取子宮進(jìn)行檢測(cè)，各時(shí)期都有m 咿- 9 的表達(dá)且有明顯的差異( 見(jiàn)圖7 ) ，電泳圖 從上到下分別為附植前期( 1 - 5 號(hào)帶為內(nèi)參，6 - 1 0 號(hào)帶為m m p - 9 ) ，附植期( 1 - 5 號(hào)帶為內(nèi) 參，6 一1 0 號(hào)帶為r a p - 9 ) 和附植后期( t - 3 號(hào)帶為內(nèi)參，4 - 6 號(hào)帶為r a p - 9 ) 。 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖7 妊娠對(duì)照組小鼠子宮m m p - 9 電泳圖 3 3 抑制組m m p - 9 的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 在小鼠交配見(jiàn)陰栓后的第2 天、第4 天和第7 天分別注射n o s 抑制劑0 5 m g 只，4 8 小時(shí)后處死小鼠采取子宮進(jìn)行檢測(cè)。在附植前期檢測(cè)不到m m p - 9 的表達(dá)，在附植期和附植 后期均有不同程度的表達(dá)( 見(jiàn)圖8 ) 。電泳圖中1 - 5 號(hào)帶為內(nèi)參，6 一1 0 號(hào)帶為m m p - 9 。 圖8n o s 抑制組m m p 一9 電泳圖 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 4 試驗(yàn)各組子宮m 肝啕基因的相對(duì)表達(dá)量 根據(jù)凝膠電泳圖目的基因條帶的掃描，對(duì)各組在附植前期、附植期、附植后期的m m p 一9 基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表5 。鋤4 p - 9 基因的相對(duì)表達(dá)量的最低值為0 ( 抑 制組附植前期) ，最高值為1 5 4 ( 妊娠對(duì)照組附植期) 。 表5m 咿一9 基因條帶掃描的相對(duì)表達(dá)量 t a b l e5t h er e l a t i v eq u a n t i t yo f 蛐儼9g e n ee x p r e s s i o n 5 正常附植過(guò)程中子宮m 肝一9m r n a 的表達(dá)特征 如圖9 顯示，m m p - 9 的表達(dá)在正常附植前期和附植期呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，附植期達(dá)到最高， 與未妊小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)量相比有極顯著的提高( p o 0 1 ) ；在附植后期m m p - 9 的表達(dá) 又恢復(fù)到未妊小鼠的水平。 圖9 正常附植過(guò)程中小鼠子宮j 6 1 p - 9m r n a 的表達(dá)特征 f i g 9t h em l 姒e x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a lm m p - 9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e 6 附植各時(shí)期n o s 抑制組m 肝一9 m r n a 的表達(dá)特征 如圖1 0 顯示，用n o s 抑制劑處理后，小鼠子宮內(nèi)膜m m p - 9 的表達(dá)在附植前期完全抑 制，附植期和附植后期的表達(dá)量分別達(dá)到0 4 7 和0 5 5 ，的較低水平。 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖l o 抑制組刪p 9 m 蹦 的表達(dá)特征 f i g 1 0t h em 烈ae x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a l 帥- 9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e w i t hn o si n h i b i t i o n 7 對(duì)照組與n o s 抑制組小鼠附植各時(shí)期m 腫一鈾r n a 的表達(dá)量差異 如圖l l 顯示，對(duì)照組小鼠子宮m m p - g m r n a 的相對(duì)表達(dá)在附植前期和附植期分別為 0 8 1 和1 5 4 ，明顯著高于抑制組；附植后期則在兩組之間差異不明顯。 圖1 1 小鼠胚胎附植各組m m p - 9m r n a 表達(dá)的結(jié)果比較 f i g 11t h em l me x p r e s s i o no fe n d o m e t r i a l 砌艫9i nm i c ed u r i n gi m p l a n t a t i o np h a s e 8 子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 8 1 附植前期子宮內(nèi)膜形態(tài)的觀察 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 子宮壁由外到內(nèi)分為外膜、肌肉和內(nèi)膜三層。子宮內(nèi)膜的一般結(jié)構(gòu)是由單層柱狀上 皮( 纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞) 和固有層( 基底層和功能層) ，固有層主要由基質(zhì)細(xì)胞、子宮腺、 螺旋動(dòng)脈組成。在附植前期，形態(tài)學(xué)觀察顯示，妊娠對(duì)照組和抑制組的子宮內(nèi)膜均有一 定程度發(fā)育，但妊娠對(duì)照組子宮內(nèi)膜發(fā)育明顯，腺體數(shù)量明顯增多( 圖1 2 ) 。 圖1 2 附植前期子宮切片圖( 1 0 0 x ；左圈為對(duì)照組，右圈為抑制組) f i g 1 1e n d o m e t r i a ls e c t i o ni ne a r l yi m p l a n t a t i o np h a s e ( 1 0 0 ： l e f t ：c o n t r o lg r o u p ；r i g l l t ：i n h i b i t o rg r o u p ) 8 2 附植期子宮內(nèi)膜的觀察 在附植期，形態(tài)學(xué)觀察顯示。妊娠對(duì)照組的子宮內(nèi)膜進(jìn)一步發(fā)育，柱狀上皮細(xì)胞增 高，腺體發(fā)達(dá)，羽狀突起非常明顯；抑制組子宮內(nèi)膜柱狀上皮細(xì)胞相對(duì)較低，腺體數(shù)少， 腔表面上完整，羽狀突起較少( 見(jiàn)圖1 3 ) 。對(duì)照組螺旋動(dòng)脈豐富且擴(kuò)張，基質(zhì)細(xì)胞形成蛻 膜細(xì)胞，發(fā)生明顯的蛻膜樣變，基質(zhì)變得疏松，同時(shí)子宮內(nèi)膜腺呈現(xiàn)出明顯的活動(dòng)狀態(tài)： 而抑制組子宮內(nèi)膜基質(zhì)則相對(duì)致密( 見(jiàn)圖1 4 ) 。 圖1 3 附植期子宮切片圖( 1 0 0 x ：左圖對(duì)照組，右圖抑制組) 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 f i g 1 3e n