水產(chǎn)品中氯霉素的測定.docx

XXX實驗室檢測中心管理體系文件作業(yè)指導書（第A版 第0次修改）文件編號：編寫：審核：批準：批準日期：受控狀態(tài)： 受控 非受控正副版本： 正本 副本持有者：發(fā)布日期： 實施日期：作業(yè)指導書文件編號：第1頁 共4頁標 題：水產(chǎn)品中氯霉素的測定第A版 第0次修改頒布日期：年月日1. 目的使氯霉素的測定處于受控狀態(tài)，保證氯霉素檢測結果的準確性與一致性；規(guī)范參加本項目檢測工作人員的操作規(guī)程。2. 適用范圍適用于水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的篩選檢驗。3. 引用標準動物源食品中氯霉素殘留檢測 酶聯(lián)免疫吸附法農業(yè)部1025號公告-26-2008氯霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書 廣州瑞森生物科技有限公司無公害食品 水發(fā)水產(chǎn)品 NY 5172-2002分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T 6682-2008食品衛(wèi)生檢驗方法 理化部分 總則 GB/T5009.1-20034. 概述氯霉素屬廣譜抗生素，曾在畜牧業(yè)中廣為應用。但氯霉素有較強的副作用和毒性作用，如果氯霉素在食用動物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，長期微量攝入氯霉素，不僅使人體腸道正常菌群失調，而且還會引起多種疾病，對人類的健康造成危害。世界上許多國家禁止此藥用于生產(chǎn)食品動物，并規(guī)定了在畜產(chǎn)品中氯霉素不得檢出。5. 測定5.1. 原理 氯霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的基本原理來進行的，換句話說，就是利用酶標記物與樣品中的氯霉素與微孔中的抗體進行競爭反應。在整個反應當中，如果樣品中的氯霉素殘留的越多，相對地就會競爭反應越多的酶標記物，使得能結合上抗體的酶標記物相對地減少，用TMB底物顯色，樣品中的氯霉素含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出氯霉素含量。5.2. 儀器5.2.1. 酶標儀(配備450nm濾光片)。5.2.2. 旋轉蒸發(fā)儀。5.2.3. 勻漿器。5.2.4. 振蕩器。5.2.5. 冷凍離心機。5.2.6. 微量移液器:單道20L、50L、100L、1000L；多道250L。5.2.7. 天平:感量0.01g。5.2.8. 氮氣吹干裝置。作業(yè)指導書文件編號：第2頁 共4頁標 題：水產(chǎn)品中氯霉素的測定第A版 第0次修改頒布日期：年月日5.3. 試劑和材料 以下所有試劑，均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水。5.3.1. 乙酸乙酯。5.3.2. 乙腈。5.3.3. 正己烷。5.3.4. 0.5N鹽酸溶液5.3.5. 0.5N氫氧化鈉溶液5.3.6. 氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒:28冰箱中保存。5.4. 樣本處理a) 將3克已均質的樣品放入15mL離心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震蕩5分鐘。b) 用離心機離心1700g10分鐘，取2mL上層液(乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于50下，利用氮氣將有機溶劑吹干。c) 在此玻璃管中加入正己烷1mL，先將殘余物完全溶解后，再加入1mL樣品稀釋液，震蕩30秒鐘。d) 用離心機離心1700g 10分鐘，利用吸管吸去包含中問乳化層部分的上層液(正己烷)，再吸取下層液(水層)備用。稀釋倍數(shù):1若待測物為白蝦可按以下流程將樣品做8倍濃縮以增加檢品敏感度a) 將6克已均質的樣品放入15mL離心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震蕩5分鐘。b) 用離心機離心1700g 10分鐘，取4mL上層液(乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于50下，利用氮氣將有機溶劑吹干。c) 在此玻璃管中加入正己烷2mL，先將殘余物完全溶解后，再加入0.5mL樣品稀釋液，震蕩30秒鐘。d) 用離心機離心1700g 10分鐘，利用吸管吸去包含中問乳化層部分的上層液(正己烷)，再吸取下層液(水層)備用。稀釋倍數(shù):0.1255.5. 酶聯(lián)免疫測定5.5.1. 將標準品對應微孔按序編號后分別分別加入100L氯霉素標準溶液。5.5.2. 在其他的微孔加入100L已完成前處理的樣品溶液。5.5.3. 再于每一微孔另加入50L已完全回溫的酶標記物。5.5.4. 輕敲酶標板四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置1小時。5.5.5. 將微孔中的反應液甩掉，再將已稀釋清洗液加滿每一微孔后甩掉，重復3次。5.5.6. 最后一次甩掉清洗液后，在吸水紙上拍干。5.5.7. 于每一微孔加入顯色液100L后，輕敲酶標板四周，使其充分混合。5.5.8. 于室溫下避光靜置20分鐘。5.5.9. 加入反應終止液，每一微孔加入100L。5.5.10. 酶標儀以單波長450nm或雙波長450nm/650nm讀值。作業(yè)指導書文件編號：第3頁 共4頁標 題：水產(chǎn)品中氯霉素的測定第A版 第0次修改頒布日期：年月日5.6. 結果判定5.6.1. 定性判定 用樣品的平均吸光度值與標準值比較即可得出樣本所含氯霉素濃度范圍(ng/ml)。假設樣品1的吸光度值為0.313，樣品2的吸光度值為1.032，標準液吸光度值分別是:0ppb為1.892；0.025ppb為1.501；0.05ppb為1.175；0.1ppb為0.751；0.3ppb為0.421；0.6ppb為0.198。則樣品1的濃度范圍0.3ppb-0.6ppb;樣品2的濃度范圍0.05ppb-0.lppb。(再乘以相應的稀釋倍數(shù))5.6.2. 定量判定所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標準(0標準)的吸光度值(BO)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值%=BB0100%B標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值。BO0ng/ml標準溶液的平均吸光度值。以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素的實際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。6. 檢測方法靈敏度、準確度、精密度6.1. 靈敏度 本方法在魚、蝦、蟹樣品中氯霉素的檢出限為0.025ppb。6.2. 準確度本方法的回收率為70130。6.3. 精密度 本方法樣本的變異系數(shù)小于10。7. 相關文件氯霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書（廣州瑞森生物科技有限公司）酶標儀操作規(guī)程旋轉蒸發(fā)儀操作規(guī)程勻漿器操作規(guī)程振蕩器操作規(guī)程冷凍離心機操作規(guī)程氮吹儀操作規(guī)程天平稱量操作規(guī)程。作業(yè)指導書文件編號：第4頁 共4頁標 題：水產(chǎn)品中氯霉素的測定第A版 第0次修改頒布日期：年月日8. 注意事項1) 使用前請先將試劑盒回溫至室溫(置于室溫60分鐘以上)，各溶液皆搖勻后方可使用。2) 回溫后，取出所需酶標板條，將剩余未測的ELISA孔條立即放回鋁箔袋中，置于4保存。3) 10倍樣品稀釋液與10倍清洗液請用蒸餾水稀釋10倍方可使用。(如1mL濃縮稀釋液加9mL蒸餾水)稀釋后的1萃取稀釋液和1清洗液可于4保存一周。4) 萃取流程請使用P.P.材質的15mL離心管以免腐蝕。5) 反應終止液含0.5 N HCl，請小心操作。6) 氯霉素標準溶液含氯霉索，請小