水產(chǎn)品中氯霉素的測(cè)定.docx

XXX實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中心管理體系文件作業(yè)指導(dǎo)書(shū)（第A版 第0次修改）文件編號(hào)：編寫(xiě)：審核：批準(zhǔn)：批準(zhǔn)日期：受控狀態(tài)： 受控 非受控正副版本： 正本 副本持有者：發(fā)布日期： 實(shí)施日期：作業(yè)指導(dǎo)書(shū)文件編號(hào)：第1頁(yè) 共4頁(yè)標(biāo) 題：水產(chǎn)品中氯霉素的測(cè)定第A版 第0次修改頒布日期：年月日1. 目的使氯霉素的測(cè)定處于受控狀態(tài)，保證氯霉素檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與一致性；規(guī)范參加本項(xiàng)目檢測(cè)工作人員的操作規(guī)程。2. 適用范圍適用于水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的篩選檢驗(yàn)。3. 引用標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物源食品中氯霉素殘留檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附法農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-26-2008氯霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū) 廣州瑞森生物科技有限公司無(wú)公害食品 水發(fā)水產(chǎn)品 NY 5172-2002分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T 6682-2008食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 理化部分 總則 GB/T5009.1-20034. 概述氯霉素屬?gòu)V譜抗生素，曾在畜牧業(yè)中廣為應(yīng)用。但氯霉素有較強(qiáng)的副作用和毒性作用，如果氯霉素在食用動(dòng)物中殘留，可通過(guò)食物鏈傳給人類(lèi)，長(zhǎng)期微量攝入氯霉素，不僅使人體腸道正常菌群失調(diào)，而且還會(huì)引起多種疾病，對(duì)人類(lèi)的健康造成危害。世界上許多國(guó)家禁止此藥用于生產(chǎn)食品動(dòng)物，并規(guī)定了在畜產(chǎn)品中氯霉素不得檢出。5. 測(cè)定5.1. 原理 氯霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的基本原理來(lái)進(jìn)行的，換句話說(shuō)，就是利用酶標(biāo)記物與樣品中的氯霉素與微孔中的抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。在整個(gè)反應(yīng)當(dāng)中，如果樣品中的氯霉素殘留的越多，相對(duì)地就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)越多的酶標(biāo)記物，使得能結(jié)合上抗體的酶標(biāo)記物相對(duì)地減少，用TMB底物顯色，樣品中的氯霉素含量與樣品的吸光度值呈反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出氯霉素含量。5.2. 儀器5.2.1. 酶標(biāo)儀(配備450nm濾光片)。5.2.2. 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。5.2.3. 勻漿器。5.2.4. 振蕩器。5.2.5. 冷凍離心機(jī)。5.2.6. 微量移液器:單道20L、50L、100L、1000L；多道250L。5.2.7. 天平:感量0.01g。5.2.8. 氮?dú)獯蹈裳b置。作業(yè)指導(dǎo)書(shū)文件編號(hào)：第2頁(yè) 共4頁(yè)標(biāo) 題：水產(chǎn)品中氯霉素的測(cè)定第A版 第0次修改頒布日期：年月日5.3. 試劑和材料 以下所有試劑，均為分析純?cè)噭?；水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。5.3.1. 乙酸乙酯。5.3.2. 乙腈。5.3.3. 正己烷。5.3.4. 0.5N鹽酸溶液5.3.5. 0.5N氫氧化鈉溶液5.3.6. 氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒:28冰箱中保存。5.4. 樣本處理a) 將3克已均質(zhì)的樣品放入15mL離心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震蕩5分鐘。b) 用離心機(jī)離心1700g10分鐘，取2mL上層液(乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于50下，利用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶劑吹干。c) 在此玻璃管中加入正己烷1mL，先將殘余物完全溶解后，再加入1mL樣品稀釋液，震蕩30秒鐘。d) 用離心機(jī)離心1700g 10分鐘，利用吸管吸去包含中問(wèn)乳化層部分的上層液(正己烷)，再吸取下層液(水層)備用。稀釋倍數(shù):1若待測(cè)物為白蝦可按以下流程將樣品做8倍濃縮以增加檢品敏感度a) 將6克已均質(zhì)的樣品放入15mL離心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震蕩5分鐘。b) 用離心機(jī)離心1700g 10分鐘，取4mL上層液(乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于50下，利用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶劑吹干。c) 在此玻璃管中加入正己烷2mL，先將殘余物完全溶解后，再加入0.5mL樣品稀釋液，震蕩30秒鐘。d) 用離心機(jī)離心1700g 10分鐘，利用吸管吸去包含中問(wèn)乳化層部分的上層液(正己烷)，再吸取下層液(水層)備用。稀釋倍數(shù):0.1255.5. 酶聯(lián)免疫測(cè)定5.5.1. 將標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)后分別分別加入100L氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。5.5.2. 在其他的微孔加入100L已完成前處理的樣品溶液。5.5.3. 再于每一微孔另加入50L已完全回溫的酶標(biāo)記物。5.5.4. 輕敲酶標(biāo)板四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置1小時(shí)。5.5.5. 將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將已稀釋清洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)3次。5.5.6. 最后一次甩掉清洗液后，在吸水紙上拍干。5.5.7. 于每一微孔加入顯色液100L后，輕敲酶標(biāo)板四周，使其充分混合。5.5.8. 于室溫下避光靜置20分鐘。5.5.9. 加入反應(yīng)終止液，每一微孔加入100L。5.5.10. 酶標(biāo)儀以單波長(zhǎng)450nm或雙波長(zhǎng)450nm/650nm讀值。作業(yè)指導(dǎo)書(shū)文件編號(hào)：第3頁(yè) 共4頁(yè)標(biāo) 題：水產(chǎn)品中氯霉素的測(cè)定第A版 第0次修改頒布日期：年月日5.6. 結(jié)果判定5.6.1. 定性判定 用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出樣本所含氯霉素濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.313，樣品2的吸光度值為1.032，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為1.892；0.025ppb為1.501；0.05ppb為1.175；0.1ppb為0.751；0.3ppb為0.421；0.6ppb為0.198。則樣品1的濃度范圍0.3ppb-0.6ppb;樣品2的濃度范圍0.05ppb-0.lppb。(再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù))5.6.2. 定量判定所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(BO)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值%=BB0100%B標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值。BO0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素的實(shí)際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。6. 檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度6.1. 靈敏度 本方法在魚(yú)、蝦、蟹樣品中氯霉素的檢出限為0.025ppb。6.2. 準(zhǔn)確度本方法的回收率為70130。6.3. 精密度 本方法樣本的變異系數(shù)小于10。7. 相關(guān)文件氯霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)（廣州瑞森生物科技有限公司）酶標(biāo)儀操作規(guī)程旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀操作規(guī)程勻漿器操作規(guī)程振蕩器操作規(guī)程冷凍離心機(jī)操作規(guī)程氮吹儀操作規(guī)程天平稱量操作規(guī)程。作業(yè)指導(dǎo)書(shū)文件編號(hào)：第4頁(yè) 共4頁(yè)標(biāo) 題：水產(chǎn)品中氯霉素的測(cè)定第A版 第0次修改頒布日期：年月日8. 注意事項(xiàng)1) 使用前請(qǐng)先將試劑盒回溫至室溫(置于室溫60分鐘以上)，各溶液皆搖勻后方可使用。2) 回溫后，取出所需酶標(biāo)板條，將剩余未測(cè)的ELISA孔條立即放回鋁箔袋中，置于4保存。3) 10倍樣品稀釋液與10倍清洗液請(qǐng)用蒸餾水稀釋10倍方可使用。(如1mL濃縮稀釋液加9mL蒸餾水)稀釋后的1萃取稀釋液和1清洗液可于4保存一周。4) 萃取流程請(qǐng)使用P.P.材質(zhì)的15mL離心管以免腐蝕。5) 反應(yīng)終止液含0.5 N HCl，請(qǐng)小心操作。6) 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液含氯霉索，請(qǐng)小