腫瘤研究方法-Approaches-and-Techniques.ppt

ApproachesandTechniquesinResearchonTumorAcourseforPh D candidates 腫瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞研究技術(shù) Theanimalmodelandinvitroresearchoftumor 常用研究方式 InVitro 體外研究 細(xì)胞 組織培養(yǎng)下進(jìn)行InVivo 體內(nèi)研究 人類疾病的動(dòng)物模型ExVivo 細(xì)胞經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)處理后 再回輸?shù)襟w內(nèi)體外處理 轉(zhuǎn)染基因或改變環(huán)境 用一些因子 使其分化等 體外研究 InVitro 原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞 從腫瘤組織中分離得到的細(xì)胞在體外成功地進(jìn)行培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng) primaryculture 腫瘤細(xì)胞系 原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞能連續(xù)傳代 約7 10天傳代一次 半年以上 生長穩(wěn)定 并能保持腫瘤細(xì)胞的特性 稱為腫瘤細(xì)胞系 cellline 腫瘤細(xì)胞株 細(xì)胞系經(jīng)細(xì)胞克隆或其它方法獲得具有某種生物學(xué)特性的純譜系的細(xì)胞稱為腫瘤細(xì)胞株 cellstrain 細(xì)胞具有相同的基因型和表型 單克隆 腫瘤細(xì)胞株的建立 1 直接從人的腫瘤或動(dòng)物的自發(fā)及誘發(fā)腫瘤組織分離培養(yǎng)建系和建株 從自發(fā)或誘發(fā)瘤 2 從人或動(dòng)物的移植腫瘤 如人腫瘤裸鼠移植瘤 組織分離培養(yǎng)建系及建株 從移植瘤 3 用化學(xué)或生物 病毒 方法在體外轉(zhuǎn)化正常的人或動(dòng)物的細(xì)胞株而獲得腫瘤細(xì)胞株 體外轉(zhuǎn)化 腫瘤細(xì)胞株的鑒定 1 有關(guān)的原始資料 包括供瘤病人的姓名 年齡 性別 病歷號(hào) 臨床診斷 TNM 活檢病理診斷 手術(shù)切除日期 最后病理診斷等2 形態(tài)學(xué)觀察 普通倒置相差光鏡 活細(xì)胞的形態(tài) 細(xì)胞間橋 分泌顆粒 重疊生長 Giemsa染色或H E 染色的光鏡形態(tài)與腫瘤細(xì)胞的生長條件有一定關(guān)系 HeLa 高濃度血清 長梭形 低濃度血清 圓形細(xì)胞 排列如鵝卵石路面 透射和掃描電鏡 3D組織結(jié)構(gòu) 3 核型及染色體觀察 整倍體 異倍體 染色體畸變 標(biāo)記染色體 染色體分帶分析 相隔一定時(shí)間重復(fù)觀察數(shù)次4 生長特性 分裂指數(shù) 3H thymidine或5 BrdU的labelingindex 生長曲線 細(xì)胞群體倍增時(shí)間 集落形成或貼壁率 platingefficiency 半固體培養(yǎng)介質(zhì)中的集落形成率5 組織特性的鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)方法 上皮性腫瘤標(biāo)志 CK 上皮膜抗原 EMA 癌胚抗原 CEA 淋巴瘤抗原標(biāo)志 人白細(xì)胞分化抗原簇 CD 有274個(gè)以上 T淋巴細(xì)胞 UCHL 1 CD45RO B淋巴細(xì)胞 L26 CD20 軟組織腫瘤標(biāo)志 波形蛋白 Vm 肌源性 結(jié)蛋白 Dm 肌動(dòng)蛋白 肌凝蛋白 肌紅蛋白神經(jīng)源性 神經(jīng)微絲 NF S 100蛋白 Leu 7 神經(jīng)元特異性烯醇化酶 NSE 髓磷脂堿性蛋白 MBP 組織細(xì)胞源性 1抗胰蛋白酶 1抗糜蛋白酶 CD68血管源性 八因子相關(guān)抗原 CD34 荊豆凝集素 UL 基膜源性 纖連蛋白 FN 和層粘連蛋白 LN 體外培養(yǎng)時(shí)腫瘤細(xì)胞株有可能會(huì)失去原本表達(dá)的某些組織抗原 抗原標(biāo)志要多選用幾種抗體 以減少假陰性結(jié)果 6 其他特性 a 分泌激素和異位激素 絨毛膜癌 HCG垂體瘤 生長激素肺燕麥細(xì)胞癌和一些甲狀腺癌 ACTH人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株 PLA 801 促性腺激素肝癌 HCG b 腫瘤細(xì)胞的受體表達(dá) ERPRAR c 酶及同工酶活性 酶活性保持 HTC 酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 變化誘導(dǎo)劑糖皮質(zhì)激素 多肽激素改變培養(yǎng)條件 谷氨酸替代谷氨酰胺 腦星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酰合成酶活性增7倍左右特異的同工酶譜 絨癌T3M 3表達(dá)胎盤性堿性磷酸酶 d 癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表達(dá) 高轉(zhuǎn)移人卵巢細(xì)胞系HO 8910PM表達(dá) p53p16bcl 2nm 23CD44v6c erbB 2EGFR等基因的蛋白產(chǎn)物不表達(dá) Bax基因的蛋白產(chǎn)物 7 細(xì)胞株交叉污染的檢測(cè) 細(xì)胞遺傳學(xué)方法 染色體分析特異的染色體標(biāo)志探針作FISHG帶核型分析鑒別同種腫瘤細(xì)胞Q帶分析檢測(cè)人Y染色體免疫學(xué)方法 HLA或動(dòng)物的組織相容性抗原的測(cè)定生化方法 同工酶譜或其它生化指標(biāo) 8 微生物污染的檢測(cè) 細(xì)菌 培液混濁 高倍鏡下隱約可見均勻散在細(xì)小菌體真菌 培液混濁 高倍鏡下可見菌絲或孢子病毒 病毒核酸和蛋白產(chǎn)物支原體 以核酸 DNA 熒光染色即H stain Hoechst33258 即二苯并咪唑染色 較為常用 356nm光的激發(fā)下可發(fā)出458nm的強(qiáng)熒光 體外正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的鑒定正常細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化的鑒定指標(biāo) 14項(xiàng)指標(biāo) 第二屆全國細(xì)胞和組織培養(yǎng)專題討論會(huì)通過 核型分析出現(xiàn)非整倍體 能在軟瓊脂培養(yǎng)基中增殖并形成集落 異種動(dòng)物接種能生成腫瘤 端粒保持不變或延長以及端粒酶活性的增高 指標(biāo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞形態(tài)伸展良好 折光較弱 核質(zhì)比小 梭形 伸展較差 折光較強(qiáng) 核質(zhì)比大 與正常細(xì)胞之間差別不如纖維母細(xì)胞胞質(zhì)嗜堿性弱 核仁較小較少 胞質(zhì)嗜堿性強(qiáng) 核仁較大較多 多核巨細(xì)胞大 多形性較常見多核巨細(xì)胞較少較多粘附性細(xì)胞間粘附性較強(qiáng) 緊貼瓶壁生長粘附性差 易脫落差別不明顯生長特性排列有方向性 單層生長 存在密度方向性消失 多層重疊 密度依賴性抑制消失差別不明顯 某些細(xì)胞株呈重疊生長依賴性抑制對(duì)血清的依賴較高較低差別不明顯掃描電鏡觀察微絨毛少微絨毛豐富微絨毛不穩(wěn)定 有時(shí)增多植物凝集素引起的凝集弱較弱較強(qiáng)細(xì)胞表面的糖蛋白和糖脂正常糖基化不完全糖基化不完全纖維連接蛋白正常存在減少或消失纖溶酶原激活酶較低增高不穩(wěn)定 某些株增高胞質(zhì)中微絲微管的排列規(guī)則紊亂不穩(wěn)定胞質(zhì)cAMP濃度較高較低核型二倍體非整倍體或假二倍體非整倍體瓊脂培養(yǎng)不生長生長生長接種異種易感動(dòng)物不長腫瘤長腫瘤長腫瘤 世界各國的細(xì)胞庫 cellbank 及索引美國美國典型培養(yǎng)細(xì)胞庫 AmericanTypeCultureCollection 即ATCC Rockville MD 人與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)目錄 CatalogofHumanandOtherAnimalCellCultures NavalBiosciencesLaboratory CellCultureDepartment NavalSupplyCenter Oakland CA 人基因突變細(xì)胞及老年細(xì)胞培養(yǎng)庫 HumanGeneticMutantCellCultureandAgeingCell CultureRepositories InstituteforMedicalResearch Camden NJ 歐洲真核細(xì)胞培養(yǎng)庫 CulturedeCellulesEucaryotes RepertoiredesUtilisateurs M Adophe D Gourdji A Tixier Vidal R Robineaux InsermPublications 101RuedeTobiac 75654Paris Cedex13醫(yī)學(xué)病毒學(xué)系 DepartmentofMedicalVirology InstitutedePasteur Paris 歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)庫 EuropeanCollectionforAnimalCellCultures 即ECACC PHLS CAMR Porton Salisbury England 歐洲人類基因突變細(xì)胞庫 EuropeanHumanGeneticMutantCellBank DepartmentofClinicalGenetics ErasmusUniversity Rotterdam 日本癌細(xì)胞系庫 CollectionofCancerCelllines NationalInstituteofHygenicSciences Tokyo 普通細(xì)胞庫 GeneralCellBank InstituteofPhysicalandChemicalResearchofRIKEN Saitama FlowLaboratories GIBCO 特殊表型腫瘤細(xì)胞系 株 高轉(zhuǎn)移人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞株MHCC97人黑色素瘤細(xì)胞株MV3 卵巢癌細(xì)胞株HO 8910PM 肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株P(guān)GBE1高度耐藥人紅白血病細(xì)胞株K562 ADM對(duì)阿霉素的抗性增114 7倍分泌產(chǎn)生激素 蛋白 酶或一些因子人肺小細(xì)胞癌細(xì)胞株LU 165 抗利尿激素 人肺腺癌細(xì)胞株LC 2 ad 1 抗胰蛋白酶人紅白血病細(xì)胞株K562高表達(dá)端粒酶 體內(nèi)研究 InVivo 腫瘤動(dòng)物模型 自發(fā)性腫瘤誘發(fā)性腫瘤移植性腫瘤 一 自發(fā)性腫瘤種系 大鼠的自發(fā)腫瘤不如小鼠多見 大動(dòng)物更為少見Sinclair豬到一歲時(shí)有85 可發(fā)生惡性黑色素瘤品系 C3H小鼠 乳腺癌發(fā)病率為97 BALB c 乳腺癌發(fā)病率低AKR小鼠 淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)病率為70 90 近交系SJL J小鼠 淋巴瘤 何杰金病 自發(fā)率高達(dá)91 缺點(diǎn) 發(fā)病遲 發(fā)病時(shí)期不集中 發(fā)病率也不穩(wěn)定 二 誘發(fā)性腫瘤優(yōu)點(diǎn) 發(fā)生率 發(fā)病時(shí)間 發(fā)生部位及組織學(xué)類型均易控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性相對(duì)較好1 化學(xué)誘癌動(dòng)物腫瘤模型1775年英國醫(yī)師Pott掃煙囪陰囊癌1914年 日本學(xué)者山極和市川煤焦油皮膚癌1934年Yashida用鄰氨基偶氮甲苯誘發(fā)大鼠肝癌成功我國從1960年代開始進(jìn)行化學(xué)誘癌動(dòng)物模型的研究1956年亞硝胺和1961年黃曲霉毒素的致癌作用相繼被發(fā)現(xiàn) 1 化學(xué)致癌物 誘發(fā)時(shí)間相對(duì)較短 有劑量 效應(yīng)關(guān)系 基因毒化學(xué)致癌物一般具有高度親電子性 與生物大分子中富于電子的親核殘基相結(jié)合 影響鹼基對(duì)的正常配位或大分子的結(jié)構(gòu)與功能 正常細(xì)胞的癌變 直接致癌物和前致癌物 間接致癌物 常見化學(xué)致癌物 1 多環(huán)碳?xì)浠衔?25種以上 以煤焦油的主要成分3 4 苯并芘和3 甲基膽蒽的致癌性最強(qiáng)2 氨基偶氮化合物 二甲基氨基偶氮苯亦稱二甲基黃 奶油黃 3 甲基 4 4 二甲基氨基偶氮苯 3 Me DAB 3 芳香胺類 苯胺印染工廠吸入乙萘胺在肝變?yōu)榘被浇?jīng)腎排出聯(lián)苯胺 膀胱癌2 乙酰氨基芴 2 AAF 4 亞硝胺類 亞硝酸鹽 二級(jí)胺 亞硝胺類化合物強(qiáng)致癌物致癌譜甚廣不同分子的亞硝胺化合物仍有一定的器官親和性對(duì)稱衍生物如二烷基亞硝胺 肝癌不對(duì)稱的亞硝胺 食管癌 5 霉菌毒素 種類較多首推黃曲霉毒素 aflatoxin 存在于霉變的花生 玉米及谷物中 6 金屬元素 砷 鉻 鎳 肺癌鎘 前列腺癌 2 影響化學(xué)致癌的因素 1 動(dòng)物方面品系 誘發(fā)肝癌時(shí) F 344大鼠對(duì)DEN和2 AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高誘發(fā)皮膚腫瘤 BALB c和SENCAR品系小鼠對(duì)DMNU DENU的敏感性大大高于Swiss品系小鼠性別 2AAF誘發(fā)肝癌 小鼠60 發(fā)生肝癌 小鼠不敏感 F 344大鼠 比 更敏感年齡 一般而言 動(dòng)物年齡越小 對(duì)化學(xué)致癌物越敏感 敏感性 胎鼠 新生鼠 成年鼠 2 化學(xué)致癌物方面劑量閾值 啟動(dòng)因子 initiator 不表現(xiàn)明顯的劑量閾值促癌因子 promotor 則有劑量閾值一般的化學(xué)致癌物往往兼有啟動(dòng)和促癌的作用 因此仍可表現(xiàn)有劑量閾值如3 Me DAB 60ppm 致癌強(qiáng)度 誘發(fā)大鼠肝癌總劑量 DAB為1000mg3 Me DAB為600mg 2 AAF為250mg DMN只需100mg 誘癌潛伏期 誘發(fā)肝癌 AFB1需時(shí)約1年 3 Me DAB與2 AAF約半年左右 DEN一般只需3個(gè)月 誘癌靶器官 誘癌譜 相對(duì)專一 如3 Me DAB一般只引起肝癌 較廣 如亞硝胺類可誘發(fā)多器官腫瘤 化學(xué)致癌物的相互作用 多數(shù)協(xié)同作用而加速致癌 少數(shù)會(huì)產(chǎn)生拮抗作用 有的化學(xué)物質(zhì)單獨(dú)使用時(shí)本身不致癌 但可增強(qiáng)致癌物作用 促癌物 3 誘癌方案 carcinogenicregimen 和方法 半年后 12周后 喂正常飼料 代表1周 喂含0 06 3 Me DAB的飼料 喂含0 02 2 AAF的飼料 部分肝切除 苯并蒽 Benzanthracene 直接涂擦皮膚 注射至皮下 產(chǎn)生皮膚癌 產(chǎn)生纖維肉瘤 非基因毒致癌物 non genotoxiccarcinogen 美國公布的301種化合物中 162種可致鼠類腫瘤其中36 不引起細(xì)胞DNA的改變44 不引起細(xì)胞突變致癌機(jī)制 促進(jìn)細(xì)胞增殖 抑制細(xì)胞凋亡 其它未知 2生物因子誘發(fā)動(dòng)物腫瘤模型 1 病毒誘發(fā)動(dòng)物腫瘤模型1908年Ellermann和Bang 白血病雞的無細(xì)胞濾液誘發(fā)雞白血病獲成功白血病 淋巴瘤 肉瘤 乳腺癌 皮膚癌 腎癌等 與病毒感染有關(guān)1 DNA病毒多瘤病毒 PyV 皰疹病毒 herpesvirussylvilagas 2 RNA病毒急性RNA腫瘤病毒 潛伏期較短 3 4周 大部分肉瘤病毒 禽白血病病毒 個(gè)別小鼠白血病病毒 如Abl MuLV 都屬于本組 該組病毒基因組結(jié)構(gòu)常有缺陷 需輔助病毒協(xié)助才能復(fù)制慢性RNA腫瘤病毒 潛伏期較長 4 12月 大部分動(dòng)物白血病病毒屬于本組 2 其它生物因子誘發(fā)的動(dòng)物腫瘤模型幽門螺桿菌感染SPF級(jí)的BALB c小鼠 22月以后 38 的實(shí)驗(yàn)小鼠胃有淋巴濾泡增生 25 的小鼠胃出現(xiàn)形態(tài)類似人胃粘膜相關(guān)淋巴瘤的病變 B細(xì)胞淋巴瘤 3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型 Stewart等獲得13個(gè)MMTV LTR myc融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠系 其中兩株c myc啟動(dòng)子為MMTV LTR啟動(dòng)子中糖皮質(zhì)激素受體反應(yīng)元件所取代 在早期妊娠時(shí)即發(fā)生自發(fā)性乳腺癌 Chisari等HHBV的S基因 病毒增強(qiáng)子和X基因 轉(zhuǎn)基因小鼠 HBsAg的積聚引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張 出現(xiàn)肝細(xì)胞毛玻璃樣改變 100 小鼠發(fā)生肝臟腫瘤X基因和病毒增強(qiáng)子的質(zhì)粒 X基因轉(zhuǎn)基因小鼠 21月齡時(shí) 兩個(gè)品系轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤發(fā)生率分別為75 82 8 三 移植性腫瘤可移植瘤株 將一種動(dòng)物腫瘤移植到同系同種或異種動(dòng)物 經(jīng)傳代 20代 組織形態(tài)特征逐漸穩(wěn)定 即成為同種或異種動(dòng)物的可移植瘤株 移植瘤來源 動(dòng)物自發(fā)性腫瘤或誘發(fā)性腫瘤我國用615近交系小鼠的自發(fā)瘤建立了 肺癌 肝癌 乳腺癌 白血病等移植瘤株用誘發(fā)瘤建立了 小鼠宮頸癌 U27及U14 小鼠前胃癌 Fc 肝細(xì)胞癌等移植瘤株 近交系動(dòng)物的應(yīng)用 1962年 蘇格蘭醫(yī)師Dssacson和Cattanach發(fā)現(xiàn) 裸小鼠 移植性人腫瘤裸鼠模型廣泛應(yīng)用1 免疫缺陷動(dòng)物 1 T細(xì)胞免疫功能缺陷動(dòng)物裸小鼠 先天性胸腺發(fā)育不良 妊娠14 15天可見少量胸腺痕跡 并非全無胸腺 胸腺依賴性T細(xì)胞明顯減少或缺乏 B細(xì)胞仍然存在 但功能低下 免疫球蛋白以IgM為主 NK細(xì)胞有較強(qiáng)活力 純合子的裸大鼠 基因符號(hào)rnu 特征與裸小鼠相似無胸腺大鼠 2 B細(xì)胞免疫功能缺陷動(dòng)物B細(xì)胞功能衰退 血漿IgM IgG低下 T細(xì)胞功能尚屬正常CBA N系小鼠Arabian和Quarter馬 3 聯(lián)合免疫缺陷及其它免疫缺陷動(dòng)物CBA N NU小鼠T B淋巴細(xì)胞功能均缺陷 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠 SCID 突變基因scid位于第16對(duì)染色體純合子小鼠T B淋巴細(xì)胞極度低下 NK細(xì)胞和抗原傳遞細(xì)胞功能尚正常先天性聯(lián)合免疫缺陷型小鼠 NK細(xì)胞 T B細(xì)胞功能聯(lián)合缺陷裸小鼠 缺點(diǎn) 需在germ free或SPF條件下飼養(yǎng) 較苛刻 平均壽命僅14 30d 2 人腫瘤免疫缺陷動(dòng)物模型移植成功率 取決于移植方法 人癌組織直接移植的成功率平均為30 人癌細(xì)胞株為60 70 腫瘤本身 成功率最高 結(jié)腸癌 胃癌 黑色素瘤 其次 胰腺癌裸小鼠胰腺內(nèi)原位移植 宮頸癌 食管癌等 較低 前列腺癌 乳腺浸潤癌 淋巴網(wǎng)織系統(tǒng)腫瘤和白血病裸小鼠品系 人前列腺癌 BALB c成功率僅2 3 150 NMRI裸小鼠可達(dá)35 6 16 其它 接種部位宿主遺傳背景年齡和建康狀況等 1 人組織裸鼠誘癌模型誘發(fā)鼻咽癌青少年慢性鼻咽增殖體炎鼻咽活檢或刮除組織移植于NC系裸小鼠二亞硝基哌嗪 NDP 為致癌劑鼻咽上皮增生巴豆油A因子 TPA 為促癌劑乳頭狀增生 不典型增生原位癌誘發(fā)肺癌裸鼠體內(nèi)人類氣管 支氣管培養(yǎng)成功也為用人材料誘發(fā)肺癌的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ) 2 人腫瘤裸鼠移植模型 1969年丹麥的Ryggard人結(jié)腸癌移植于裸小鼠 100余種人類惡性腫瘤裸小鼠移植模型 癌腫肝 肺 胃 結(jié)腸 食管 胰腺 乳腺 前列腺 鼻咽 淋巴造血系統(tǒng)腫瘤軟組織腫瘤其它黑色素瘤 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 1978年Festing首次進(jìn)行裸大鼠人癌異種移植 1983年我國建成甲胎蛋白陽性裸大鼠人肝癌模型LTNR與LTMR2兩株 3 人腫瘤轉(zhuǎn)移裸鼠模型我國始于80年代中期肺癌 肝癌轉(zhuǎn)移及胃癌肝轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移等1 人肺癌高轉(zhuǎn)移裸小鼠模型吳秉銓等將6株人肺癌細(xì)胞系移植BALB cA nu nu JCLB裸小鼠其中一株肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系移植建成高轉(zhuǎn)移模型 定名為PG帶瘤存活30天以上裸小鼠中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 29 30 肺轉(zhuǎn)移 26 30 傳17代后 瘤組織再移植裸小鼠 存活30天 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 12 12 肺轉(zhuǎn)移 9 12 轉(zhuǎn)移率達(dá)100 2 人肝癌高轉(zhuǎn)移裸小鼠模型孫肪憲 湯釗猷等用30例人肝癌組織直接移植于4 6周齡的BALB cA nu nu裸小鼠 移植部位在小鼠肝實(shí)質(zhì)內(nèi)或肝包膜下其中一例39歲男性 巨塊型肝細(xì)胞癌伴肝內(nèi)播散和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 其移植瘤育成人肝癌高轉(zhuǎn)移裸鼠模型 定名為LCI D 20鼠間連續(xù)傳代 16代 成功率100 間期為20天肺 淋巴結(jié)及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移 72 72 腹腔種植轉(zhuǎn)移 50 72 轉(zhuǎn)移率達(dá)100 3 其它胃癌肝轉(zhuǎn)移楊善民等用人低分化胃粘液腺癌細(xì)胞系MGC80 3在BALB c裸小鼠建成移植瘤后再用移植瘤單細(xì)胞懸液接種于裸小鼠脾包膜下肝內(nèi)胃癌轉(zhuǎn)移率達(dá)60 用CCl4處理裸小鼠 肝內(nèi)胃癌轉(zhuǎn)移率可達(dá)100 其它臟器則未見轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移李斯德等將人小細(xì)胞癌NCI H128細(xì)胞系接種裸小鼠腹股溝 腋窩和頜下淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達(dá)100 3應(yīng)用腫瘤的生物學(xué)特性浸潤轉(zhuǎn)移臨床治療基因治療導(dǎo)向治療藥敏測(cè)定法 SRC 實(shí)驗(yàn)可評(píng)價(jià)率為93 新抗癌藥物開發(fā)篩選 MolecularOncologySomeMolecularMethodologyinTumorResearch 一 基因變異的診斷基因表達(dá)異常腫瘤基因突變 轉(zhuǎn)位 重排Southernblot PCR點(diǎn)突變DGGE鹼基缺失CDGESSCP基因丟失 SSCPMicrosatellitesanalysis DGGE DenaturingGradientGelElectrophoresisCDGE ConstantDenaturingGelElectrophoresisSSCP SingleStrandConformationPolymorphism PCR SSCP year1989 OritaMGene PCR HomozygoteHetrozygote Heating 50 for10min formamide NondenaturingPAGE 300V 5h silverstaining PCR SSCP靈敏度高 一個(gè)鹼基的改變可在電泳速度上反映出來但DNA片段的大小與靈敏度有關(guān)100 300bp突變檢出率97 300 500bp檢出率67 以200bp左右為佳 PCR SSCP的主要步驟 DNA模板制備 從石蠟組織中提取 脫蠟 少許石蠟組織放入Eppendorf管 1ml二甲苯65 5分鐘 離心 5分鐘 棄上清重復(fù)一次1mlEtOH 振搖后離心5分鐘 棄上清1mlEtOH 70 振搖后離心5分鐘 棄上清真空離心5分鐘 使干燥 消化 180mlpH8 0TE 20mlbuffer 10mlproteinaseK 20mg ml 55 3 5h加50mlChelex 100 25 水溶液 55 1h 100 10min spin 3min提純DNA 上清 200mlphenol 劇烈振搖 離心 3min上清 phenol choroform 振搖 離心 3min水相 25mlNaOAc3M 1mlglycogen 750mlEtOH pure 20 overnight spin15min at4 pelletswashedwithEtOH70 spin pelletsresuspendedin100 200mlTE pH8 2 RunPCR注意 PCR產(chǎn)物最好在200bp左右瓊脂糖電泳條帶清晰PCR產(chǎn)物run非變性PAGE制膠 36 MDE膠 or6 polyacrylamide 稀釋樣品 1mlPCR產(chǎn)物 4ml去離子水 alkalinedenature 1mlNaOH 4ml去離子水 50 水浴10min后 stopsolution2ml 12ml well 20 恒溫 300伏恒壓下電泳5h Alkalinestocksolution 0 5MNaOH 10mMEDTAStopsolution 1mlformamide 99 pure 20ml0 5MEDTA pH8 0 50ml1 bromophenol 25ml1 xylenecyanol 4 膠染色PAGE膠作記號(hào) 左下角切去小 入10 醋酸固定20min 膠用去離子水洗三次 每次2min 膠入硝酸銀溶液反應(yīng)30min 膠用去離子水洗一次 約半分鐘 膠入還原液還原顯色 時(shí)間依需要而定 膠入10 醋酸終止反應(yīng) 約5分鐘 膠在80 下真空干燥2小時(shí) P53基因exon5突變 PCR SSCP NTLNTL PCR SSCP的應(yīng)用 1 經(jīng)PCR SSCP確定DNA片段有突變 該片段經(jīng)測(cè)序可確定突變的形式和定位 可避免因測(cè)序或PCR反應(yīng)出現(xiàn)的堿基配對(duì)差錯(cuò)造成的假陽性2 在無非特異性電泳條帶情況下 可以初步確定有無基因的雜合性丟失 LossofHetrozygote LOH 二 檢測(cè)基因的丟失和擴(kuò)增比較基因組雜交ComparativeGenomicHybridization CGH分子生物學(xué)技術(shù)與細(xì)胞遺傳學(xué)方法相結(jié)合優(yōu)點(diǎn) 1 新鮮材料和福爾馬林固定石蠟包埋材料均可進(jìn)行CGH研究2 被測(cè)樣品只需數(shù)mg甚至不到1mg的DNA R G 低度擴(kuò)增高度擴(kuò)增丟失 不同熒光 紅 綠 標(biāo)記基因組DNA片段 500 2000bp 人Cot 1DNA 對(duì)正常人染色體進(jìn)行原位分子雜交 被測(cè)DNA 參照DNA 退火及預(yù)雜交 石蠟包埋材料提取的DNA質(zhì)量較差 可用變性引物對(duì)所提取的基因組DNA進(jìn)行整體擴(kuò)增DegenerationOligonucleotidePrimedPCR DOP PCR Firststep Primer 5 CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG 3 DOP 酶 消除3 5 外切酶活性的T7噬菌體DNA聚合酶條件 寬松條件 Lowstringency 30 5min 37 2min 96 2minfor5cycles Secondstep Template theproductofthefirststeprunningPrimer DOP酶 Taq聚合酶條件 95 5min后進(jìn)入循環(huán)94 1min 56 1min 72 2minfor35cycles 72 5min用DOP PCR只需石蠟包埋材料DNA50pg 相當(dāng)于5 10個(gè)細(xì)胞 即可進(jìn)行CGH分析 而常規(guī)方法需至少200個(gè)細(xì)胞 兩者CGH的圖形 profile 是相同的切片染色不能用HE 而用甲基綠 CGH的應(yīng)用 為搜尋腫瘤的癌基因或抑癌基因確定范圍腫瘤細(xì)胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)增加 往往提示該位置可能包含已知或未知的癌基因有擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)減少或缺失 提示該位置可能包含已知或未知的抑癌基因丟失CGH發(fā)現(xiàn)MYCN MET與胃癌相關(guān) 區(qū)分良惡性病變 臨床上估計(jì)預(yù)后16例前列腺癌CGH顯示染色體異常占81 5例良性前列腺增生全部陰性67肝細(xì)胞癌CGH顯示 1q 8q 20q 17q 4q 8p 13q 16q 12例癌周肝硬化組織 陰性53例淋巴結(jié)陰性乳腺癌 8q 11q13 17q 20q異常 預(yù)后差 三 檢測(cè)細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異消減雜交抑制消減雜交cDNA代表性差異分析SAGEDNAmicroarraymRNA差異顯示 mRNAdifferentialdisplay RT PCR 測(cè)序電泳 經(jīng)典 可重復(fù)性可展示10000 15000種mRNA的表達(dá) 實(shí)質(zhì)是RT PCR引物設(shè)計(jì)很有特點(diǎn)錨定引物 12個(gè)T可結(jié)合mRNA的polyA上T12MNM A G CN A G C T據(jù)排列組合 一種T12MN可與1 12的mRNA結(jié)合隨機(jī)引物 可在與polyA末端不同距離的多個(gè)位置上結(jié)合差異顯示的產(chǎn)物是長度不一的cDNA片段的混合物 差異顯示的技術(shù)路線提取高質(zhì)量的總RNA DNA酶處理 用錨定引物T12MN進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 用相同的T12MN引物及隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 同時(shí)用同位素對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記 測(cè)序膠電泳分離PCR產(chǎn)物 切下差異表達(dá)的條帶 用相同引物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物制成探針Northernblot驗(yàn)證 相對(duì)較敏感 200個(gè)細(xì)胞的總RNA足夠進(jìn)行差異分析 低豐度mRNA的顯示不理想對(duì)策 1 先通過消減雜交使差異片刻富集 2 二輪PCR擴(kuò)增 巢式PCR 第二輪的引物在3 端多2個(gè)堿基 使與之匹配的模板減少 模板間競爭減少 有利于低豐度mRNA擴(kuò)增 降低假陽性 使用不同濃度的模板進(jìn)行平行反應(yīng) 或重復(fù)實(shí)驗(yàn)以排除由于模板質(zhì)量或數(shù)量引起的假陽性 嚴(yán)格設(shè)定對(duì)照 如用缺省逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA酶降解RNA作為陰性對(duì)照來排除DNA污染 進(jìn)行差異片段的初篩 把所有的差異片段點(diǎn)在尼龍膜上 然后將研究對(duì)象RNA逆轉(zhuǎn)錄 摻入同位素制成探針 與此尼龍膜雜交 即反向點(diǎn)雜交 只有那些 此有彼無 的片段才進(jìn)入下一階段的研究 差異表達(dá)分析的應(yīng)用 腫瘤與瘤旁組織或正常組織的基因表達(dá)差異表達(dá)分析 不同生物學(xué)特性的腫瘤 高 低轉(zhuǎn)移表型 基因表達(dá)差異分析 細(xì)胞經(jīng)某種細(xì)胞因子處理后進(jìn)行基因表達(dá)差異分析 研究該細(xì)胞因子作用的下游分子 四 蛋白組學(xué)及生物芯片蛋白組學(xué) proteomics Y 軸等電電泳或固態(tài)pH2 Dgelelectrophoresis梯度電泳X 軸SDS PAGE銀染或熒光染色 找出差異點(diǎn) 挖膠 質(zhì)譜分析 微量氨基酸測(cè)序 BLAST確定是已知還是未知的基因 克隆該基因 生物芯片 biochip 是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法將大量核酸片段 寡核苷酸 cDNA 基因組DNA RNA 或多肽分子甚至細(xì)胞等生物樣品有序地固定于支持物 玻片 硅片 聚丙烯酰胺凝膠 尼龍膜等載體 的表面 組成密集的二維分子排列 然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交 通過特定的儀器如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī) CCD 對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速 并行 高效地檢測(cè)分析 從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量改變 生物芯片 基因芯片蛋白質(zhì)芯片細(xì)胞芯片組織芯片基因芯片 Affymetrix專利 寡核苷酸芯片 cDNA芯片 基因組芯片DNAmicroarray 陣密度很高的玻片基質(zhì)或膠膜基質(zhì)的DNA微陣列DNAmacroarray 陣密度較低的尼龍膜DNA微陣列 五 腫瘤基因甲基化水平的檢測(cè)MethylationofDNA 甲基化程度與該基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)甲基化可通過直接或間接作用影響基因表達(dá)直接作用 基因構(gòu)型改變 影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA特定部位結(jié)合 間接作用 調(diào)控序列甲基化 可與methylGC bindingprotein結(jié)合 阻止轉(zhuǎn)錄因子與基因形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物 甲基化檢測(cè)方法 HpaII MspI酶切法HpaII CCGG MspI CCmGG 通過電泳分析酶切片段即可知甲基化狀態(tài) 5 氮胞苷摻入法 5 氮胞苷胞嘧啶第五位C原子被N原子替代 胞嘧啶無法甲基化 基因低甲基化 可傳代 經(jīng)5 氮胞苷處理的細(xì)胞 失活的基因可被重新激活 Xiong和Laird用 COBRA 即 結(jié)合應(yīng)用酸式亞硫酸鹽的內(nèi)切酶分析 combinedbisulfiterestrictionanalysis COBRA 來檢測(cè)啟動(dòng)子中含有CpG的基因的甲基化水平 COBRA原理 酸式亞硫酸鈉 C T 或 mC C 與CpG甲基化有關(guān)的內(nèi)切酶位點(diǎn)的序列發(fā)生轉(zhuǎn)變 CGCG mCGmCG CGCG CGCG TGTG CGCG TGTG TGTG Bisulfite BstU1 注意 也有例外有些基因雖有甲基化但仍可轉(zhuǎn)錄 相反有些基因雖處于低甲基化狀態(tài) 但沒有轉(zhuǎn)錄活性 Thankyouforattending Suggestedtopicsbefocusedoninthediscussioncourse WhatwillyouaddtothelistoftheapproachesandtechniquesthatIhavepresented ifyouhave pleasegivesomedetails WhatisyourPh D researchproposal Whatkindsofmethodsandtechniquesyouintendtouseinyourresearch Whataretheproblemsyoumayencounterandhowtosolvethem HowmuchdoyouknowaboutRNAitechnique Willyougiveussomepoints Seeyounextweek RNAitechniqueTwotypesof 21ntRNAstriggerposttranscriptionalgenesilencingincells smallinterferingRNAs siRNA microRNAs miRNAs DicerDouble strandedRNAprecursor siRNAormiRNADicer amemberoftheRNAaseIIIfamilyofdsRNA specifice