蝴蝶蘭的組織培養(yǎng).doc

蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)蝴蝶蘭phalaenopsis 為蘭科蝴蝶蘭屬植物,它是一種熱帶氣生蘭,俗稱“洋蘭”。蝴蝶蘭花型似蝴蝶,形態(tài)美妙、色彩豐富、花期長,在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”之美稱,。蝴蝶蘭種類豐富,分布廣,東起菲律賓、新幾內(nèi)亞,南達澳大利亞北部,西蘇門答臘,北到我國臺灣、云南、四川西部均有原種(野生的蝴蝶蘭) 存在,約有50 多種,其中我國有7 種,全部為附生蘭。蝴蝶蘭商品化大規(guī)模栽培十分成功，是近年來在國際花卉市場上最受歡迎的洋蘭。從離體器官誘導(dǎo)產(chǎn)生類原球莖，通過類原球莖的增殖培養(yǎng)，得到大量幼苗，為實現(xiàn)蝴蝶蘭工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。類原球莖是一類呈珠粒狀的幼嫩器官（種子萌發(fā)時先是胚的膨大,種皮破裂,一定時間后發(fā)育成肉眼可見淺黃色的原胚呈球狀,稱為原球莖，由其它外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的稱類原球莖），在蘭科植物中多以這種器官發(fā)育、增殖和分化。蝴蝶蘭的組培快繁有胚培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)和腋芽培養(yǎng),腋芽培養(yǎng)形成試管苗,再以叢生芽的方式增殖快繁,可以有效地保持母本的優(yōu)良性狀,變異率最低。1 材料與方法（1）材料 取已過盛花期帶休眠芽的花梗作為外植體材料。（2）材料消毒與接種 切下其帶芽莖段,長約2 - 3cm ,用自來水清洗干凈,在飽和漂白粉上清液中浸泡15 min ,浸泡時不斷攪動,浸泡后的莖段用流水沖洗干凈,置于超凈工作臺上,先用75 %的酒精消毒30 s ,無菌水清洗1 次,再用0. 1 %的升汞浸泡10 min ,經(jīng)無菌水沖洗數(shù)次,將帶芽莖段接種到經(jīng)設(shè)計的不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,重復(fù)3 。（3）培養(yǎng)基的配制 花梗腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L 。 增殖培養(yǎng)基為1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %。 生根培養(yǎng)基為1/ 2MS + BA1. 5 mg/L +NAA0. 3 mg/L + 80 g/L 香蕉泥 以上培養(yǎng)基p H 均為5. 52 結(jié)果 在培養(yǎng)條件每天光照12 h ,光強1 600Lx ,溫度25 2 獲得以下效果。 （1）誘導(dǎo)培養(yǎng)效果：蝴蝶蘭花梗接種到不同激素濃度的培養(yǎng)基上,生長1 周后在花梗的基部有褐色物質(zhì)產(chǎn)生,腋芽開始萌動,1 月后腋芽可以長到1. 5 cm 高，出芽率可達50。 （2）增殖培養(yǎng)效果：將長出的芽選取約1. 5cm 的苗，取出后切去葉片和基部褐化部分,轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中,40 d 后，增殖倍數(shù)可達到3倍以上。 （3）生根培養(yǎng)效果：將高約2. 0 cm 的蝴蝶蘭試管苗接種到生根培養(yǎng)基中, 50 d 后，全部生根，平均生根3.5條，長2.5cm。 （4）壯苗培養(yǎng)與馴化移栽：壯苗。生根組培苗壯苗培養(yǎng)基1/2MS+ 蔗糖10g/L+ 瓊脂粉3.5 g/L+ 活性炭1.5 g/L ，pH5.4，溫度( 252) , 光照強度2000Lx, 光照時間14h/d。培養(yǎng)15d 后移栽。馴化：室內(nèi)開瓶煉苗3d室外煉苗3d。 移栽基質(zhì)：最適合的栽培基質(zhì)為水苔，椰糠也是良好的移栽基質(zhì)。3 討論（1）蝴蝶蘭和其他蘭科植物一樣,在組培快繁生產(chǎn)中存在著易褐化死亡的問題,因此如何克服褐變成了組培快繁生產(chǎn)成功與否的關(guān)鍵，活性炭2 g/L ,或PVP 1 g/L效果顯著；適時切除培養(yǎng)物的褐化部分并及時更換新鮮培養(yǎng)基，能有效抑制外植體褐變死亡；培養(yǎng)基中加入10%椰子水，也能促進原球莖的生長，減少原球莖增殖過程中的褐變；蝴蝶蘭的群體效應(yīng)很明顯，單芽容易褐化死亡，且增殖較慢，因此，剛誘導(dǎo)出的原球莖狀體不能過早切割轉(zhuǎn)移，在繼代階段接種時，應(yīng)盡量避免切成單芽，增殖時切塊也不宜過小，否則容易褐化死亡；添加香蕉汁對蝴蝶蘭原球莖形成及幼苗生長具有明顯的促進作用。（2）另有報道：蝴蝶蘭原球莖的誘導(dǎo)主要受外植體、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素的共同影響,其中,外植體最難以控制,這與外植體本身的生長發(fā)育和生理生化狀態(tài)有關(guān)。因此,對外植體的篩選是組培中較關(guān)鍵的技術(shù)。蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過程中,采用同樣培養(yǎng)基處理時,莖尖比葉片、花梗側(cè)芽作為外植體效果較好。)在激素濃度相同條件下, 1 /2MS、MS、White、B5 作為基本培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出原球莖,但MS效果最好,且誘導(dǎo)的原球莖數(shù)量多,密度大。以MS作為基本培養(yǎng)基對蝴蝶蘭原球莖進行增殖培養(yǎng),附加NAA 1. 00 mg/L和6BA 2. 00 mg/L時,增殖效果最好。蝴蝶蘭生根過程中,在1 /2MS培養(yǎng)基上根生長最快,生根率可達94. 42%,根長可達0. 86 cm,長勢最粗壯,數(shù)量最多,說明低濃度的鹽分有利于側(cè)根發(fā)生?；九囵B(yǎng)基中添加蔗糖濃度為3%,瓊脂為6. 00 g/L,活性炭為1. 00 g/L; pH值為5. 60 5. 80;培養(yǎng)溫度為( 25 1) ;光照時間為13h /d;光照強度為1 5002 000 lx。 （3）組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的有效途徑，主要通過兩條途徑：一是利用種子無菌發(fā)芽，二是從離體器官誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，通過原球莖的增殖培養(yǎng)，得到大量幼苗。早在1949 年，Potor利用無菌培養(yǎng)技術(shù)成功地促使蝴蝶蘭花梗上的休眠芽發(fā)育成完整植株，該方法經(jīng)過其他研究人員改進后，曾一度成為蝴蝶蘭的主要無性繁殖方式。1974 年，Intuwong等利用蝴蝶蘭莖尖誘導(dǎo)產(chǎn)生了原球莖狀體，再由原球莖分化成植株，為實現(xiàn)蝴蝶蘭工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)中有幾個關(guān)鍵的時期：原球莖的誘導(dǎo)、原球莖的繼代增殖、壯苗的培育。蝴蝶蘭組培的快繁技術(shù)，包括外植體的選擇、不同基本培養(yǎng)基、激素、添加物對其增殖與分化的影響、外植體褐變的防治以及生根壯苗的方法等。 外植體的選擇：誘導(dǎo)蝴蝶蘭原球莖采用的外植體主要有根段、花梗苗根尖、花梗腋芽、莖尖、葉片、胚、花葶節(jié)間（花葶：地上無莖植物從地表，通常自基生蓮座抽出的無葉花序梗）、花梗節(jié)或花梗節(jié)間切段、種子等。蝴蝶蘭不同外植體的成活率有差異，其中花梗側(cè)芽的成活率最高，其次為花梗，葉片和根尖最差。針對不同外植體，取材方法也不同，通常取花梗節(jié)之間12cm 長的幼嫩部分，切取長23mm 的切段作為外植體。如利用23cm 長的根尖段，將其切成0.50.8cm，接種2 周后根端切口處開始膨大，產(chǎn)生淡綠色瘤狀愈傷組織；采用無菌種子苗莖尖作為外植體時，培養(yǎng)30d 后基部出現(xiàn)愈傷組織，出愈率達85%以上；而利用正在培養(yǎng)的花梗苗生長旺盛的根尖進行培養(yǎng)，20d 左右外植體膨大且表面顏色明顯加深；用花梗腋芽為起始材料誘導(dǎo)花葶，由花葶節(jié)間切片可以高頻率誘導(dǎo)分化不定芽。 基本培養(yǎng)基的選擇：蝴蝶蘭組織培養(yǎng)所采用的基本培養(yǎng)基包括 MS、1/2MS、VW、B5、KC、花寶及其改良型等。但由于蝴蝶蘭品種差異及外植體來源不同對最適培養(yǎng)基的選擇是不同的：以紅花品種為試材，以改良KC 的效果最好，1/2MS 次之，MS 最差；蝴蝶蘭的原球莖增殖培養(yǎng)以較低的無機鹽濃度為好，大量元素對原球莖增殖有很大影響，1/2MS 對原球莖增殖最有利。在花梗節(jié)間切段誘導(dǎo)原球莖的實驗過程中對培養(yǎng)基進行篩選，也發(fā)現(xiàn)1/2MS 或改良MS 較MS 效果好，減少MS 中大量元素和部分微量元素及有機成分，適當(dāng)增加少量的葉酸和生物素有利于原球莖的增殖生長；但MS 培養(yǎng)基最適合蝴蝶蘭種子的萌發(fā)。也有報道B5 培養(yǎng)基更有利于蝴蝶蘭根段原球莖的誘導(dǎo)和增殖。 植物生長調(diào)節(jié)劑對蝴蝶蘭原球莖增殖與分化的影響：蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中常用的細胞分裂素為6-BA，較高濃度（18mg/L）的6-BA 能促進蝴蝶蘭原球莖增殖，較低濃度（0.10.5mg/L）的6-BA 則能促進原球莖分化。有研究表明，低濃度6-BA有利于原球莖的增殖，而高濃度（6mg/L）的6-BA 刺激多酚氧化酶作用，使原球莖容易產(chǎn)生褐化。低濃度的NAA 對原球莖增殖和出苗均有促進作用，高濃度的則不利。研究表明，適宜濃度的6-BA 配合較低濃度的NAA，更有利于原球莖的增殖，2.0mg/L 6-BA 和0.3mg/L NAA 配合使用是蝴蝶蘭原球莖增殖的最佳組合。高濃度的NAA 對蝴蝶蘭原球莖增殖有一定的抑制作用，NAA 濃度從1mg/L 增加到3mg/L，增殖率相應(yīng)從98.3%下降到38.3%；采用3.0mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA 配方，能夠有效的誘導(dǎo)原球莖，同時還發(fā)現(xiàn)提高激素配比（5.0mg/L 6-BA + 0.2mg/LNAA + 活性碳1.0g/L），則有利于原球莖的增殖，提高增殖系數(shù)，且不用轉(zhuǎn)接就可直接生根成苗，避免轉(zhuǎn)接過程帶來的污染損失，簡化了培養(yǎng)過程，因而是一種值得推廣的方法；此外，在培養(yǎng)基中加入1.0mg/L GA3 對原球莖分化成芽有一定的抑制效果，為獲得大量原球莖而避免分化成芽，適當(dāng)添加GA3 是有一定作用的。 添加物對蝴蝶蘭原球莖增殖和分化的影響：一些氨基酸類添加物，也可以作為培養(yǎng)基中的有機氮源，例如甘氨酸能促進離體根的生長。絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥、胚狀體或不定芽的分化。水解酪蛋白和水解乳蛋白對胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進作用。而在培養(yǎng)基中加入一些天然有機物，如椰乳、香蕉泥、番茄汁等，也能提供一些必要的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素等，如加入100200mg/L 香蕉泥，具有較大的pH 緩沖作用，對幼苗發(fā)育有促進作用。水解酪蛋白對蝴蝶蘭原球莖增殖有明顯促進作用，而水解酪蛋白和香蕉勻漿相結(jié)合卻對原球莖增殖有抑制作用，有機添加物之間的相互作用或有機添加物與培養(yǎng)基之間的相互作用可能對原球莖增殖有影響。許多研究也表明，添加適量的香蕉泥、椰乳或含膠質(zhì)的果菜汁等均對原球莖增殖有明顯促進效果。培養(yǎng)基中添加活性炭，低濃度（0.51.0g/L）時對原球莖增殖影響不明顯，高濃度（2.03.0g/L）時對原球莖增殖有促進作用，但原球莖有黃化現(xiàn)象。蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑，對原球莖的增殖生長影響較大，2%的蔗糖濃度有利于原球莖生長，2%3%蔗糖促進芽的形成，5%的蔗糖有利于根的分化和生長。 生根壯苗：壯苗培養(yǎng)是提高移栽成活率的一項重要措施，生根效果也直接影響到生產(chǎn)效益。此階段的關(guān)鍵在于嚴格篩選激素的種類和濃度，一般需降低培養(yǎng)基的激素含量，以便形成健壯苗。常用的生長素有IBA(0.31.5mg/L)、NAA(0.10.8mg/L)。GA3 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L 的組合能明顯提高生根率，且植株健壯，長勢好。無機營養(yǎng)是影響蝴蝶蘭叢生芽生根率的主要原因，蔗糖次之，NAA 和多效唑影響程度較弱。（4）.提高原球莖的增殖率：組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的有效途徑,通過無性快繁,繼代培養(yǎng),然后誘