葉綠體色素的提取分離和理化性質(zhì).doc

系別：航院 班號(hào)：力9 姓名：奚柏立 學(xué)號(hào)：2009011642 （同組姓名：王勵(lì)旸）實(shí)驗(yàn)日期：2009年10月11日葉綠體色素的提取分離和理化性質(zhì)A 提取與分離一、 實(shí)驗(yàn)原理葉綠體中的葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素不溶于水，但可溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇等有機(jī)溶劑提取。提取液可用薄層層析色譜法加以分離和鑒別。薄層層析色譜法是將吸附劑均勻涂在玻璃板上成一薄層。把待分離的樣品溶液點(diǎn)在薄層板的下端并把薄層板下端浸入展開(kāi)劑中后，展開(kāi)劑通過(guò)毛細(xì)管作用由下而上逐漸浸潤(rùn)薄層板，并帶動(dòng)樣品在板上也向上移動(dòng)，樣品在吸附劑和展開(kāi)劑之間不斷地吸附脫附。由于吸附劑對(duì)樣品中不同成分的吸附能力不同，從而使各成分有不同的移動(dòng)速度而彼此分離。二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器1.新鮮的菠菜切片2.體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，碳酸鈣粉末，展開(kāi)劑（石油醚：丙酮：苯=7：5：1，體積比）3.天平，研缽，漏斗，三角瓶，剪刀，點(diǎn)樣毛細(xì)管，層析缸，硅膠預(yù)制板，濾紙三、實(shí)驗(yàn)步驟 1.葉綠體色素的提取再加入1015m95%乙醇研磨至糊狀向研缽中加入少量CaCO3粉末，23ml95%乙醇放入研缽去掉中脈并剪碎擦干洗凈新鮮的菠菜葉片45片（2g左右）葉綠體色素提取液用漏斗過(guò)濾殘?jiān)?0ml95%乙醇沖洗并過(guò)濾2.葉綠體色素的分離（1）.取硅膠預(yù)制板一個(gè)，用點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取上述提取液，平行于硅膠板的短邊，距下邊緣1cm處用毛細(xì)管劃線，風(fēng)干后再劃第二次，重復(fù)操作34次（2）.在干潔的層析缸中加入適量的展開(kāi)劑，高度約0.5cm，將硅膠預(yù)制板帶有色素的一端放入，使其下端浸入展開(kāi)劑中（勿使待測(cè)樣品浸入展開(kāi)劑中）。迅速蓋好層析缸蓋。（3）.觀察。當(dāng)看到各種色素得到較好分離，展開(kāi)劑前沿接近硅膠預(yù)制板上端近邊緣處時(shí)，取出硅膠預(yù)制板，并迅速用鉛筆標(biāo)出展開(kāi)劑前沿和各色素帶的位置。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)薄層色譜分離后，葉綠素a為藍(lán)綠色，葉綠素b為黃綠色、胡蘿卜素為橙黃色和葉黃素為鮮黃色。各色素條帶在薄層中的位置可用相對(duì)比移值Rf來(lái)表示，即Rf=斑點(diǎn)中心到原點(diǎn)的距離/溶劑前沿至原點(diǎn)的距離名稱(chēng)上升高度/cmRf展開(kāi)劑9.00-胡蘿卜素8.500.944葉綠素a7.300.811葉綠素b6.950.772葉黃素6.350.706B 理化性質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)原理葉綠素是一種由葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成甲醇和葉綠醇及葉綠酸鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素分離。葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回基態(tài)時(shí)可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素。去鎂葉綠素遇銅則成為很穩(wěn)定的銅代葉綠素，其在光下不易被破壞。二、 實(shí)驗(yàn)材料與試劑1. 新鮮菠菜葉片、葉綠體色素乙醇提取液2. 刻度試管，小試管若干，試管架，水浴鍋，10ml移液管，錫箔紙3. 體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，苯，醋酸銅粉末，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀鹽酸，醋酸-醋酸銅溶液，氫氧化鉀-甲醇溶液三、 實(shí)驗(yàn)步驟1. 熒光現(xiàn)象的觀察（1） 取一支小試管加入3ml濃的葉綠體色素乙醇提取液（2） 將試管在直射光下照射，比較溶液的透射光與反射光的顏色不同2. 皂化作用（綠色素與黃色素的分離）（1） 取一支小試管加入3ml濃的葉綠體色素乙醇提取液（2） 向試管內(nèi)加入1ml氫氧化鉀-甲醇溶液并充分搖勻（3） 片刻后加入3ml苯并搖勻（4） 再沿試管壁慢慢加入1ml左右蒸餾水并輕輕混勻（5） 然后將試管置于試管架上靜置分層（若不分層，則用滴管吸取蒸餾水沿管壁滴加，邊滴邊搖直到分層時(shí)靜置）（6） 觀察3. H+和Cu2+對(duì)葉綠素分子中Mg2+的取代作用【1】（1） 取兩支試管，第一支試管加葉綠體色素乙醇提取液5ml，作為對(duì)照（2） 第二支試管加葉綠體色素乙醇提取液5ml后，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的HCl數(shù)滴，并搖勻（3） 觀察溶液顏色變化（4） 當(dāng)溶液變褐后，再加入少量醋酸銅粉末（5） 用60水浴加熱，觀察溶液顏色變化情況（6） 與對(duì)照試管相比較【2】（1） 取新鮮植物葉兩片放入試管中，加醋酸-醋酸銅溶液使之沒(méi)過(guò)葉片（2） 用90水浴加熱，隨時(shí)觀察葉片顏色的變化直至顏色不再變化為止四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.熒光現(xiàn)象的觀察溶液的透射光為綠色，反射光為暗紅色。因?yàn)槿~綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回基態(tài)時(shí)可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。（右圖）2. 皂化作用（綠色素與黃色素的分離）溶液分為兩層，下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的綠色的葉綠素a和葉綠素b（以及少量葉黃素），上層是苯溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。3. H+和Cu2+對(duì)葉綠素分子中Mg2+的取代作用【1】經(jīng)水浴加熱后的溶液顏色變?yōu)樯罹G色，比對(duì)照試管中的溶液顏色更深?！?】經(jīng)水浴加熱后的溶液顏色先略微變黃，然后變?yōu)樯罹G色因?yàn)槿~綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素。去鎂葉綠素遇銅則成為很穩(wěn)定的銅代葉綠素，其在光下不易被破壞。五、 實(shí)驗(yàn)討論1.研磨提取葉綠素時(shí)加入CaCO3有什么作用？答：加入CaCO3 能使葉綠素中的一些成分在研磨時(shí)不受破壞。2.葉綠素與光光對(duì)葉綠素的作用有雙重性：光是影響葉綠素形成的主要條件。從原葉綠素酸酯轉(zhuǎn)變?yōu)槿~綠酸酯需要光，而光過(guò)強(qiáng)，葉綠素又會(huì)受光氧化而破壞。葉綠素分子含有一個(gè)卟啉環(huán)的頭部和一個(gè)葉綠醇(植醇，phytol)的尾巴。卟啉環(huán)由四個(gè)吡咯環(huán)以四個(gè)甲烯基(CH)連接而成，它是各種葉綠素的共同基本結(jié)構(gòu)。吡咯環(huán)的中央絡(luò)合著一個(gè)鎂原子，鎂偏向帶正電荷，而與其相聯(lián)的氮原子則帶負(fù)電荷，因而頭部有極性，是親水的。另外還有一個(gè)含羰基的同素環(huán)（含相同元素的環(huán)），其上一個(gè)羧基以酯鍵與甲醇相結(jié)合。環(huán)D上有一個(gè)丙酸側(cè)鏈以酯鍵與葉綠醇相結(jié)合，葉綠醇是由四個(gè)異戊二烯單位所組成的雙萜，是親脂的，能伸入類(lèi)囊體的擬脂層，故葉綠體能定向排列。卟環(huán)上的共軛雙鍵和中央鎂原子容易被光激發(fā)而引起電子的得失，這決定了葉綠素具有特殊的光化學(xué)性質(zhì)。如（熒光現(xiàn)象）3.在含量測(cè)定中，由于操作不熟（點(diǎn)樣時(shí)未能點(diǎn)成直線，且點(diǎn)樣斑點(diǎn)偏大，導(dǎo)致各色素帶最終不呈直線），產(chǎn)生了一定的實(shí)驗(yàn)誤差六、 實(shí)驗(yàn)心得通過(guò)這次試驗(yàn)，我了解到了葉子中的各種主要色素，并學(xué)會(huì)了一種新的方法薄層層析色譜法，并了解到了葉綠素的不穩(wěn)定性，并從中提升了對(duì)生物的興趣，薄層層析色譜法相對(duì)于我們中學(xué)學(xué)的紙層析法，結(jié)果更為準(zhǔn)確，現(xiàn)象更為明顯，也更能說(shuō)明葉子匯總的各種色素。我還了解