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酶解反應(yīng)與膜分離耦合連續(xù)制備酪蛋白磷酸肽 Page 2 主要內(nèi)容 引言 材料與方法 理論分析 結(jié)果與討論 結(jié)論 Page 3 引言 酪蛋白磷酸肽 酪蛋白磷酸肽 CPPs 是以乳酪蛋白為原料經(jīng)酶解 分離 純化而制得的含有成簇磷酸絲氨酸殘基的活性多肽 它具有多種特殊的生理功效 尤其是促進(jìn)Ca Fe等元素高效吸收的功能使其具有 礦物質(zhì)載體 的美譽(yù) 酶解反應(yīng) 膜分離耦合技術(shù) 酶解反應(yīng) 膜分離耦合技術(shù)是集酶促水解 催化劑回收再用 產(chǎn)物分離純化 苦味肽脫除等多步工序于一體 是實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作的有效模式 Page 4 引言 本文是將連續(xù)流動攪拌釜式 超濾膜 CSTR UF 組合酶膜反應(yīng)器應(yīng)用于活性多肽的高效制備過程 考察操作變量對反應(yīng)器性能和酶解反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響規(guī)律 利用高效凝膠排阻色譜系統(tǒng)測定酶解物系相對分子質(zhì)量分布 比較間歇與連續(xù)水解反應(yīng)過程特性 并建立連續(xù)酶解反應(yīng)動力學(xué)模型 為生物反應(yīng)器的進(jìn)一步工業(yè)放大提供理論基礎(chǔ) Page 5 1 材料與方法 1 材料 酪蛋白胰蛋白酶甲醇其他試劑 均為分析純 2 實(shí)驗(yàn)儀器 自動電位滴定儀雙光束紫外分光光度計(jì)HPSEC系統(tǒng) WDL 95色譜工作站 P200II型高壓恒流泵 UV 200II紫外可變波長檢測器 排阻色譜柱中空纖維超濾膜 Page 6 1 材料與方法 3 方法 連續(xù)酶解步驟與檢測在圖1所示裝置中進(jìn)行連續(xù)酶解反應(yīng) 維持體積 溫度 pH 攪拌速率恒定 定時對截留液和滲流液取樣檢測 蛋白質(zhì)含量測定采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白紫外分光光度法 蛋白酶活性測定為F I P紫外分光光度法 酶解產(chǎn)物色譜分析過程將連續(xù)酶解工藝所得截留液與滲流液 用0 45m微孔濾膜過濾后 按如下HPSEC操作條件進(jìn)行色譜分析 流動相為0 1mol L pH 7磷酸緩沖液 流速0 5mL min 進(jìn)樣量20L 檢測波長280nm 檢測時間45min 柱溫25 停留時間分布函數(shù)實(shí)驗(yàn)測定循環(huán)體系先以磷酸緩沖液做補(bǔ)液 待滲透通量穩(wěn)定后 將補(bǔ)液迅速切換為已制得的多肽水解液 經(jīng)6000Da中空纖維膜過濾 并連續(xù)檢測280nm下滲流液的吸光度值變化 Page 7 1 材料與方法 Page 8 2 理論分析 動力學(xué)模型推導(dǎo)如下 對連續(xù)酶解反應(yīng)過程做如下簡化與假設(shè) 近似認(rèn)為超濾膜組件對胰蛋白酶及酪蛋白完全截留 酶解前經(jīng)底物循環(huán)保護(hù)后可忽略膜組件對該酶的活性影響 酶解單元遵循單底物擬均相不可逆酶促反應(yīng)動力學(xué)方程 酶解操作達(dá)穩(wěn)態(tài)時因體積V反應(yīng)器 V中空纖維膜 滲透通量J循環(huán) J滲流 故可認(rèn)為CSTR UF的動力學(xué)行為近似等效于CSTR 暫不考慮物質(zhì)在膜上的傳質(zhì)行為 Page 9 上式中 so為初始底物質(zhì)量濃度 g L eo為初始酶質(zhì)量濃度 g L r為酶解反應(yīng)速率 mol L min Km為米氏常數(shù) g L kcat為酶轉(zhuǎn)換數(shù) X為酶解反應(yīng)轉(zhuǎn)化率 為修正空時 2 理論分析 Page 10 3 結(jié)果與討論 3 1膜選擇性研究 圖2 a 表明 滲流側(cè)的殘存酶活無論有無底物循環(huán)始終很低 95 而滲流側(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度較低 說明酪蛋白很難透過超濾膜而近于完全截留 故有利于反應(yīng)分離耦合連續(xù)水解工藝的實(shí)現(xiàn) 以上2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型推導(dǎo)中所作假設(shè) 1 和 2 一致 Page 11 3 結(jié)果與討論 3 2操作變量對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率X及反應(yīng)器生產(chǎn)能力K的影響規(guī)律X及K值可有效表征反應(yīng)器的性能特點(diǎn) 是衡量連續(xù)水解工藝的重要參數(shù) 結(jié)果如圖3和圖4所示 Page 12 將 so eo V J4個參數(shù)歸并為酶與底物質(zhì)量濃度比 eo so 以及平均停留時間t V J 二組合變量來描述反應(yīng)器性能 圖3中X隨 eo so的增大以乘冪規(guī)律平緩上升 而K則大幅降低 連續(xù)酶解時 增加底物質(zhì)量濃度可在一定范圍內(nèi)最大限度地利用蛋白酶 但底物轉(zhuǎn)化率相對減小 而增加酶質(zhì)量濃度將使同樣數(shù)量的底物降解更徹底 轉(zhuǎn)化率更高 但單位酶產(chǎn)量相對減少 圖4中V J二參數(shù)對X及K值作用相反 影響規(guī)律與t值密切相關(guān) V增大或J減小都將使t增大 這意味著酶與底物有充分的混合接觸時間而使X以指數(shù)規(guī)律提高 而K值定義式?jīng)Q定的反應(yīng)器生產(chǎn)能力則隨t增大而減小 Page 13 3 結(jié)果與討論 3 3酶解物高效凝膠排阻色譜柱分析及膜截留率 計(jì)算 Page 14 3 結(jié)果與討論 對各譜峰面積積分并修正計(jì)算后求得中空纖維膜對相對分子質(zhì)量6000Da的原始底物與大肽有著較好的截留效果 同時酶解過程中不斷形成的小肽也被及時排離 這既實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)與分離過程的集成 還可有效控制產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布 為活性多肽的高效制備提供了一種很好的生產(chǎn)工藝模式 Page 15 3 結(jié)果與討論 3 4BSTR間歇水解與CSTR UF連續(xù)水解比較3 4 1動力學(xué)常數(shù)由間歇及連續(xù)酶解反應(yīng)L B算圖求得動力學(xué)常數(shù)列于表1 可見連續(xù)酶解過程Km值減小 kcat值增大 rmax值增大 說明底物酪蛋白與胰蛋白酶表觀親和力增強(qiáng) 酶促水解反應(yīng)轉(zhuǎn)換數(shù)增大 即單位時間內(nèi) 胰蛋白酶活性中心能轉(zhuǎn)化底物分子為產(chǎn)物的數(shù)目增多 酶解效率提高 3 4 2反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及反應(yīng)器生產(chǎn)能力與間歇反應(yīng)器相比 酶膜反應(yīng)分離耦合裝置可明顯消除產(chǎn)物抑制現(xiàn)象 在一定程度上解決間歇操作中轉(zhuǎn)化率不高的問題 X值增加1 2倍 并使反應(yīng)器生產(chǎn)能力K值提高35倍 見表1 表 1 Page 16 3 結(jié)果與討論 3 4 3酶解反應(yīng)產(chǎn)量酶解產(chǎn)量Y是在考慮酶用量因素下表征水解效率的一項(xiàng)重要指標(biāo) 它相對于K值 穩(wěn)態(tài)時產(chǎn)量 能更好地描述反應(yīng)全過程中產(chǎn)物生成情況 圖6表明 1 隨反應(yīng)體積更迭次數(shù) Jt V 的增加 Y連續(xù)近于線性提高 但當(dāng)體積變更3次 約12h 后 Y連續(xù)增幅變緩 這與酶失活 膜污染等因素造成的操作穩(wěn)定性下降有關(guān) 2 與間歇水解相比 因蛋白酶利用率提高 使得連續(xù)水解產(chǎn)量大幅增加 表現(xiàn)為Y連續(xù) Y間歇隨酶循環(huán)使用次數(shù)的增加而近于正比提高 Page 17 3 結(jié)果與討論 3 5CSTR UF組合酶膜反應(yīng)器中胰蛋白酶連續(xù)水解酪蛋白動力學(xué)建模3 5 1停留時間分布函數(shù)驗(yàn)證圖7為升階示蹤應(yīng)答法檢測得到的停留時間分布函數(shù) 可見 CSTR UF反應(yīng)器F t 函數(shù)的實(shí)驗(yàn)測定值與理想全混流反應(yīng)器CSTR的理論分布函數(shù)F t 1 e t V J 相吻合 可認(rèn)為二者具有相同的操作方程 這與模型推導(dǎo)中所做假設(shè) 4 一致 Page 18 3 結(jié)果與討論 3 5 2動力學(xué)模型擬合驗(yàn)證代入X與修正空時之間的函數(shù)關(guān)系式 1 得到模型擬合曲線 見圖8 理論計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)測定值之間的平均相對誤差為10 63 這可能是因?yàn)樵诤喕r未考慮酶解反應(yīng)的膜上行為所致 此外 忽略反應(yīng)過程中因剪切或生熱所造成的酶蛋白失活而引入的正誤差是造成 增大時 擬合值整體偏高的主要原因 Page 19 4 結(jié)論 酶膜反應(yīng)器中連續(xù)酶解反應(yīng)具有以下特點(diǎn) 6000Da中空纖維膜件對酪蛋白及胰蛋白酶近于完全截留 進(jìn)行底物循環(huán)保護(hù)有利于酶活性的保持 so eo V J4項(xiàng)操作變量對K及X值均成反比關(guān)系 穩(wěn)態(tài)時滲流液及截留液均以小肽為主 且滲流液主要譜峰與CPPs活性組分吻合 可有效控制產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布 CSTR UF反應(yīng)器動力學(xué)行為近似等效于CSTR 所建動力