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食品中蘇丹紅I的免疫學(xué)快速檢測方法研究 fuyunjie1985 前言 蘇丹紅I 1 苯基偶氮 2 萘酚 屬于蘇丹紅染料的一種 作為化學(xué)合成染料 主要應(yīng)用于鞋油 化妝品等工業(yè)產(chǎn)品及其他著色劑等領(lǐng)域 蘇丹紅I在體內(nèi)代謝 可被還原為初級代謝產(chǎn)物苯胺和1 氨基 2 萘酚 這些物質(zhì)會攻擊肝細(xì)胞 引起中毒性肝病 也可造成神經(jīng)系統(tǒng)損害 是一種遺傳毒性致癌物 蘇丹紅I 前言 蘇丹紅I檢測現(xiàn)狀 目前食品中蘇丹紅I的檢測主要輔助儀器 HPLC IAS HPLC 進(jìn)行檢測 而儀器檢測方法普遍存在的缺陷在于 1 檢測儀器昂貴2 檢測成本高3 操作復(fù)雜4 耗時長5 需專業(yè)人員操作6 不適宜現(xiàn)場抽查及推廣應(yīng)用 免疫學(xué)檢測技術(shù)解決食品中蘇丹紅I快速檢測的問題 一 研究內(nèi)容 蘇丹紅I多抗制備及鑒定 研究內(nèi)容 蘇丹紅I免疫學(xué)檢測方法建立 1 蘇丹紅I多克隆抗體的制備 蘇丹紅I多克隆抗體的純化及含量測定 蘇丹紅I多克隆抗體的制備 蘇丹紅I衍生物 明膠免疫抗原的合成 蘇丹紅I多抗制備 免疫原的制備 利用重氮法合成帶有羧基的蘇丹紅I衍生物 利用混合酸酐法合成蘇丹紅I 明膠復(fù)合物 1 1蘇丹紅I免疫原的制備 首次免疫 0 5mL完全弗氏佐劑 0 5mL2mg mL免疫原 于兔背部注射 2周后 0 5mL不完全弗氏佐劑 0 5mL2mg mL免疫原 足掌注射 每隔10天 于兔耳緣靜脈注射免疫抗原1 0mL 加強免疫3次 最后一次免疫后的7 10天試血 2 3蘇丹紅I多抗的制備 選擇體重2kg的雄性新西蘭兔 按照常規(guī)免疫程序 制備多克隆抗體 整個免疫過程為2 3個月 2 4多克隆抗體的純化 2 1蘇丹紅I衍生物的合成結(jié)果 蘇丹紅I衍生物紅外圖譜鑒定 a 蘇丹紅I b 衍生物 b曲線在1700cm 1處存在較強的吸收峰表明反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)上基本連接羰基 2 2蘇丹紅I衍生物的色譜分析結(jié)果 2 3蘇丹紅I免疫原的合成結(jié)果 2 4SDS PAGE測定IgG的純度 M 低分子量Maker 1 蘇丹紅I抗血清 2 AC純化抗體 3 CA AS純化 蘇丹紅I抗血清 有多條帶 含有較多雜蛋白 2 經(jīng)CA AS純化后 有3 4條較明顯的條帶 血清經(jīng)純化后 大部分雜蛋白被除去 3 經(jīng)AC純化后 有兩條明顯條帶 一條為重鏈 分子量約55KD 另一條為輕鏈 分子量約14KD 與IgG抗體的重鏈和輕鏈的分子量較符合 純化后的抗體純度較高 2 5特異性IgG的濃度測定 根據(jù)BCA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線y 0 5198x 0 2464 R2 0 9778 計算得到 辛酸硫酸銨純化的抗體濃度為4 24mg mL 親和層析柱純化的抗體濃度為1 93mg mL BCA法測定蛋白質(zhì)濃度 一 研究內(nèi)容 蘇丹紅I多抗制備及鑒定 研究內(nèi)容 蘇丹紅I免疫學(xué)檢測方法建立 間接競爭ELISA方法 膠體金免疫層析試紙條法 2 1間接競爭ELISA方法的建立 1 蘇丹紅I抗體效價的測定 研究內(nèi)容 3 建立間接競爭ELISA檢測方法 2 蘇丹紅I抗體親和力的測定 4 待測樣品的前處理 2 1 1蘇丹紅I抗體效價的測定 抗蘇丹紅I特異性抗體效價測定效價為1 32000 2 1 2蘇丹紅I抗體親和力的測定 本實驗利用競爭ELISA法 測定抗體的親和力 若抗體具備較強的親和力強 則較少量半抗原即可產(chǎn)生50 的抑制率 故常用IC50 即產(chǎn)生50 抑制率時半抗原的濃度 來表示抗血清的親和性 以10 抑制率時的蘇丹紅I濃度作為最低檢測限 抑制率 100 OD1 OD陰性 OD2 OD陰性 100 其中 OD1為競爭孔的OD值 OD2為不含蘇丹紅I孔的OD值 抗血清親和性IC50 15 0ng mL 最低檢測限IC10 1 0ng mL 2 1 3間接競爭ELISA的建立 酶標(biāo)記的蘇丹紅I抗原與待測樣品中可能存在的蘇丹紅I競爭性的與固相載體上的蘇丹紅I抗體結(jié)合 顯色程度與樣品中蘇丹紅I含量成反比 根據(jù)待測樣品的OD值 推算出樣品中的蘇丹紅I的濃度 2 1 4待測樣品的處理 稱取2 0g的空白辣椒粉樣品 準(zhǔn)確加入10mL乙腈 均質(zhì)2min 超聲15min 濾紙過濾后過無水硫酸鈉柱去水 所得溶液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 旋轉(zhuǎn)蒸干 甲醇 0 02mol LPBS0 2mL溶解殘渣 實驗結(jié)果測得辣椒粉中蘇丹紅I的加標(biāo)回收率為85 88 97 83 2 1 5交叉反應(yīng)率測定 用建立的間接競爭ELISA法測定蘇丹紅其他染料 計算蘇丹紅I抗體的交叉反應(yīng)率 結(jié)果表明該方法與蘇丹紅II 蘇丹紅III和蘇丹紅IV的交叉反應(yīng)率分別為2 7 6 5 和4 1 僅有較低的交叉反應(yīng)性 說明該方法的特異性良好 二 免疫學(xué)檢測方法的建立 檢測方法的建立 蘇丹紅I的膠體金免疫層析方法 2 1金免疫層析技術(shù)概述 膠體金免疫層析技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項新型體外快速診斷技術(shù) 該技術(shù)發(fā)展迅速 已在食品安全 醫(yī)學(xué)檢測 農(nóng)藥畜牧 生物反恐等多應(yīng)用領(lǐng)域中得到了廣泛發(fā)展 本研究應(yīng)用競爭抑制免疫層析的原理 樣品中的蘇丹紅I在流動的過程中與金標(biāo)蘇丹紅I抗原 競爭結(jié)合NC膜檢測線上蘇丹紅I多克隆抗體 通過檢測線T是否顯色判斷結(jié)果 2 2金免疫層析試紙工作原理 強陰性陰性懷疑陽性 2 2膠體金免疫層析試紙法的建立 1 膠體金溶液的制備 研究內(nèi)容 3 免疫層析試紙的制備 2 金標(biāo)抗原的制備 4 試紙條的檢測 2 2 3膠體金溶液的制備 膠體金的制備多采用還原法 本研究利用檸檬酸三鈉還原法制備24 5nm的膠體金 2 3 4金標(biāo)記抗原的制備 1 用0 2mol L的K2CO3調(diào)節(jié)金溶膠至pH9 0 2 將蘇丹紅I抗原與膠體金結(jié)合 攪拌15min 3 加入PEG20000 靜止2h 低速離心25min 4 取上清 高速離心50min 棄上清 5 用稀釋液將沉淀恢復(fù)至原體積 高速離心50min 6 將沉淀 金標(biāo)抗體 恢復(fù)至原體積的1 10 1 硝酸纖維素膜的選擇 條件優(yōu)化 3 金標(biāo)抗原噴涂量的選擇 2 NC膜上抗體濃度的選擇 2 3 4免疫金試紙條的制備 2 3 5膠體金免疫層析試紙的測試 配制標(biāo)準(zhǔn)濃度的待測液 使得蘇丹紅I的濃度分別為0 5 10 15 20 g kg 取90uL滴加在試紙的樣品區(qū) 10min后觀察結(jié)果 結(jié)果判斷 若C T亮度基本一致 表示陰性結(jié)果 若C線亮度明顯亮于T線 表示陽性結(jié)果 若均未出現(xiàn)C T兩線 表示該試紙無效 2 3 6試紙條測試結(jié)果 蘇丹紅I濃度達(dá)10ug kg時 檢測線T的顏色明顯變淡 即試紙條的檢測限為10 g kg 各重復(fù)數(shù)值的變異系數(shù) 9 23 05101520 濃度 g kg 2 3 7實際樣品測定 從市面上隨機購買兩種辣椒粉樣品 分別進(jìn)行試紙條和HPLC實驗測定 驗證試紙方法的準(zhǔn)確性 A為蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品 檢測波長為476nm B1 B2為辣椒粉樣品的試紙條檢測結(jié)果 B1為陰性 B2為陽性 C1 C2為HPLC的檢測結(jié)果 B1 6 663 g kg B2 12 165 g kg 兩種檢測方法的結(jié)果一致 免疫層析試紙條測試結(jié)果具有一定可靠性 2 3 8ELISA ICstrip HPLC三種方法的比較 為了驗證兩種方法的準(zhǔn)確性 將檢測結(jié)果同HPLC法進(jìn)行比較 結(jié)果表明 這3種方法測定的結(jié)果具有高度相關(guān)性 測定結(jié)果為3次測試的平均值 變異系數(shù) 10 7 表1三種檢測方法的比較