兩種曲霉糖化質(zhì)的比較.doc

兩種曲酶糖化性質(zhì)的比較研究生物08本 桑婷婷在國內(nèi)傳統(tǒng)的制酒行業(yè)中，由于黑曲霉含有豐富的酶系如液化酶、糖化酶、纖維素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改為黑曲霉作糖化用菌種。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，說明其中必有原因。鑒于此，本實(shí)驗以黑曲霉和米曲霉為研究對象，研究比較它們的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生產(chǎn)性質(zhì)。黑曲霉是一種常見的真菌, 屬于半知菌類曲霉屬。黑曲霉對營養(yǎng)要求較低, 只要培養(yǎng)基中含有碳源、氮源及磷、鉀、鎂、硫等元素即能生長良好。黑曲霉可以產(chǎn)生許多種酶, 現(xiàn)已成為工業(yè)應(yīng)用常見的菌種之一。根據(jù)bigelis1989年的統(tǒng)計, 25種主要商品酶制劑中就有15種來源于黑曲霉仁, 。它們分別是-淀粉酶、過氧化氫酶、纖維素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纖維素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果膠酶、蛋白酶、單寧酶。美國準(zhǔn)許使用的食品工業(yè)用酶生產(chǎn)菌種只有黑曲霉、酵母、枯草桿菌等約20種, 其中以黑曲霉所產(chǎn)酶類最多。我國酶制劑工業(yè)生產(chǎn)用菌種中, 黑曲霉占了17種中3種, 即黑曲霉變異株和,它們分別用于糖化酶、果膠酶和酸性蛋白酶的生產(chǎn)1。黑曲霉酶類在工業(yè)上具有重要的作用, 例如, 檸檬酸等有機(jī)酸的發(fā)酵生產(chǎn)、食品及飲料加工以及用于輕化工業(yè)、紡織工業(yè)、飼料加工和廢物的處理等等?？傊? 黑曲霉生產(chǎn)的酶制劑具有用量大、應(yīng)用范圍廣、安全性好的特點(diǎn), 已愈來愈受到人們的重視。米曲霉的菌絲由多細(xì)胞組成，是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低分子糖類，如麥芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解，提高營養(yǎng)價值、保健功效和消化率，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)。1 材料與方法11材料菌種：黑曲霉UV-48；米曲霉-412培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（土豆汁培養(yǎng)基；察式培養(yǎng)基）；發(fā)酵培養(yǎng)基（麩皮培養(yǎng)基；液體深層發(fā)酵液）13試劑133%可溶性淀粉；碘液；0.01MNacl-HAC緩沖液；6NHCL；DNS試劑；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；無菌水14實(shí)驗用具水浴鍋；三角瓶；試管；721型分光光度計；高壓蒸汽滅菌鍋；電子天平；恒溫培養(yǎng)箱；搖床；電爐；酒精燈；吸管；量筒15方法151菌種培養(yǎng) 斜面菌種培養(yǎng)：將米曲霉和黑曲霉分別接種于土豆汁培養(yǎng)基和察式培養(yǎng)基上，于3032下培養(yǎng)47天，待產(chǎn)生孢子后置于5中備用。軍種擴(kuò)大培養(yǎng)：從斜面培養(yǎng)基中挑取一環(huán)孢子接種于麩皮培養(yǎng)基上，于3032下培養(yǎng)，待長滿孢子后備用。152液化酶和糖化酶的發(fā)酵生產(chǎn)孢子懸浮液的制備：挑取經(jīng)擴(kuò)培的菌種孢子，接入內(nèi)含10ml無菌水的試管中，制成孢子懸浮液，并在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)稀釋成108個/ml孢子懸液。稀釋時可利用血球計數(shù)板推斷選擇適宜稀釋度的孢子懸液。液化酶和糖化酶的發(fā)酵:取5%孢子懸浮液接種于液體深層發(fā)酵液中，置于3032，200r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上控溫發(fā)酵，并定期測定酶活力，和PH。153酶活測定粗酶液制備；定期取20ml發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾，1000g冷凍離心5min，取上清作為粗酶液。液化酶活性測定；取1.5ml 1.33%可溶性淀粉于60C水浴5Min，加0.5ml酶液（或雙蒸水作為空白對照），60反應(yīng)10min，取O.1ml反應(yīng)液加入10ml碘液，搖勻后680nm處測OD。每個樣品作兩個重復(fù)。糖化酶（葡萄糖淀粉酶）活性測定；0.1ml1.33%可溶性淀粉加0.1ml酶液（或雙蒸水作為空白對照）60水浴反應(yīng)20min，立即加入1mlDNS試劑，沸水浴5MIN后冷卻，加入4.8ml水，在520nm處測定OD值。154發(fā)酵液中還原糖含量的測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取9支25*25試管，分別按下表加入試劑；項目 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ML） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸餾水（ML） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4DNS試劑（ML） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 將各管溶液混勻均勻，在沸水浴中加熱5分鐘，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每官加入21.5ml蒸餾水，搖勻。于520nm波長處測OD值。以葡萄糖MG數(shù)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。項目空白還原糖0123發(fā)酵液溶液（mL）01.01.01.0蒸餾水（mL）21.01.01.0DNS試劑（mL）1.51.51.51.5加入試劑后，其余操作均于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時相同，測定后，取樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查相應(yīng)的糖量，用下式計算出發(fā)酵液中還原糖的含量。還原糖濃度（mg/ml）=（還原糖mg數(shù)*稀釋倍數(shù)）/發(fā)酵液體積155發(fā)酵液PH測定定期取發(fā)發(fā)酵液用酸度計測其PH。2 實(shí)驗結(jié)果21酶活測定表1.1 酶活力（U）的變化發(fā)酵時間（h）液化酶糖化酶米曲霉黑曲霉米曲霉黑曲霉249.229. 180.850.67489.539.740.900.707215.439.800.960.94969.659.603.513.23從表中數(shù)據(jù)可以看出，米曲霉具有遠(yuǎn)比黑曲霉高的液化酶活性，而糖化酶活性測定中發(fā)現(xiàn)，米曲霉具有比黑曲霉略高的活性。2.2 發(fā)酵液中還原糖含量測定及pH變化圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線表1.2 PH，糖的變化發(fā)酵時間（h）米曲霉黑曲霉pH還原糖（mg/mL）pH還原糖（mg/mL）244.7419.364.3119.80485.048.224.8916.87726.652.755.666.29967.341.826.674.69從表中數(shù)據(jù)可看出，黑曲霉還原糖能力明顯大于米曲霉，且米曲霉和黑曲霉的糖化酶都比較耐酸，但黑曲霉糖化酶的最大值高于米曲霉。3 討論從實(shí)驗數(shù)據(jù)來看，米曲霉具有比黑曲霉高的液化酶活性和略高的糖化酶活性，黑曲霉具有多種活性強(qiáng)大的酶系，可用于工業(yè)生產(chǎn)，如淀粉酶用于淀粉的液化、糖化以及酒精工業(yè)或制造葡萄糖和消化劑。產(chǎn)生耐酸性蛋白酶用于蛋白質(zhì)分解或食品、消化劑的制造。果膠酶用于水解聚半乳糖醛酸、果汁澄清和植物纖維精煉。還有柚苷酶、橙皮苷酶、葡萄糖氧化酶、纖維素酶等。黑曲霉還能分解有機(jī)質(zhì)，產(chǎn)生多種有機(jī)酸如抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸等。某些菌系除了在甾體化合物11-a位起羥化作用外，還能將羥基孕甾酮轉(zhuǎn)化為雄烯。此外該菌還常常被用來做微量元素的測定菌和霉腐試驗菌,也可用作發(fā)酵飼料2。米曲霉能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、溶血酶等，有的已做成酶制劑用于工業(yè)生產(chǎn)。有些菌系能產(chǎn)生多種有機(jī)酸，許多菌株還能產(chǎn)生大量的曲酸。米曲霉也是酒廠和醬油廠常用的生產(chǎn)菌。本省永春醬油廠還有從醬油曲中分離出產(chǎn)蛋白酶高的優(yōu)良菌株。米曲霉發(fā)酵所加工的產(chǎn)品及食品對人類或動物具有一定的