TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法tunel完成.ppt

TUNEL TdT mediateddUTPnickendlabeling 法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法 對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色 能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征 可用于石蠟包埋組織切片 冰凍組織切片 培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定 并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞 靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高 因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用 TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù) TUNEL TUNEL TUNEL的原理 TUNEL的操作步驟 結(jié)果及注意事項(xiàng) 主要試劑 1 緩沖液 LabelingBuffer 用于維持一定的反應(yīng)條件 含有以下成分 500mmol L二甲胂酸鉀 pH7 210mmol LCoCl2 氯化鈷 1mmol LDTT 二硫蘇糖醇 2 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶 TdT 催化3 OH末端dUTP反應(yīng)的關(guān)鍵酶3 熒光素 dUTP TdT的底物和本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)記物4 蛋白酶K 消化組織 增加細(xì)胞通透性 凋亡細(xì)胞的特征是 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活 細(xì)胞自身的染色質(zhì)DNA被切割 出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口 并產(chǎn)生與DNA斷點(diǎn)數(shù)目相同的3 OH末端 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶 TerminaldeoxynucleotidylTransferaseTdT 能將脫氧核糖核苷酸連接到DNA的3 末端 TUNEL的原理是 用熒光素 fluorescein 標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸 在TdT的作用下連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3 OH末端 用熒光顯微鏡即可觀察結(jié)果 在此基礎(chǔ)上連接辣根過氧化酶標(biāo)記的熒光素抗體 可進(jìn)一步放大檢測(cè)信號(hào) 并且普通顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂 因而沒有3 OH形成 很少能夠被染色 TUNEL原理 標(biāo)本處理 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)流程 結(jié)果 注意事項(xiàng) 極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒有DNA斷裂或DNA裂解不完全 此時(shí)不適用TUNEL法檢測(cè) 進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果 在個(gè)別類型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測(cè)呈陽性 在高度增殖 代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生