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眼睛的分辨角我們的眼睛要能很好的分辨細(xì)節(jié)，就必須使細(xì)節(jié)對眼睛的視角比眼睛的極限分辨角大。在照明充足的條件下，人眼的極限分辨角一般為1。如果照明條件不好，或者眼睛能舒適的觀察的情況下，則一般物體對人眼睛的分辨角為2一4物體對眼睛視角與物體到眼睛的距離有以下關(guān)系，如圖:2.1圖2.1中物體大小一定時，當(dāng)物體距離眼睛越近，物體對眼睛的視角越大。AB與A尸高度一樣，物體AB距離人眼較遠(yuǎn)，對人眼張角為只，才B物體距離人眼睛比較近，對人眼張角為久，很明顯，典拭，物體距離人眼越近，物體對眼睛的張角越大，但是物體距離人眼也不能無限近，必須位于眼睛的近點之外，才能被看清。正常人眼的近點距離一般是250Inm左右，所以當(dāng)物體位于最近距離而其對眼睛的視角還小于極限分辨角1時，則必須借助放大鏡或者顯微鏡使其分辨角大于極限分辨角，人眼才能看清楚物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。視放大率由于眼睛作為接收單位，所以通過光學(xué)儀器來觀察物體時，儀器的放大作用不能使用高斯理論中的光學(xué)系統(tǒng)本身的放大率刀來表示。此時有意義的是物體經(jīng)過眼睛在是視網(wǎng)膜上所成像的大小。所以目視系統(tǒng)的放大率是:通過光學(xué)系統(tǒng)觀察物體時，所成的像對眼睛所成張角的正切，以tgW來表示，其與眼睛直接觀察物體時，物體對眼睛所張角度的正切tgW之比。稱做視放大率f4。我們這里用r來表示視覺放大率。即: 下面以單個放大鏡為例，說明視放大率的概念。如圖2.2是物體經(jīng)過放大鏡的光路圖:物體AB位于放大鏡物方焦點附近，設(shè)AB=y，其放大虛象AB=y，對眼睛張角的正切為:從圖中，我們可以得到:由高斯公式:將式(2.4)變形后代入式(2.3)我們得到:再把式(2.5)代入式(2.2)得到如果我們用眼睛直接觀察，物體對人眼睛的張角為:根據(jù)前面對視覺放大率的定義，我們可以得到，視覺放大率為上式中，一l+f，+乃是眼瞳到觀察物體的距離，這里我們用D表示該距離，f+乃是眼瞳到放大鏡的距離，我們用S來表示，8)改寫成如下形式:當(dāng)物體在無窮遠(yuǎn)處時，正常人眼是處于放松狀態(tài)，所以，當(dāng)借助放大鏡觀察時，一般會使物體成像在無窮遠(yuǎn)處，使眼睛處于最舒服。這時，矛=ao，上面的式子可以簡化為:有時人眼為了能觀察到更細(xì)微的結(jié)構(gòu)，則調(diào)整放大鏡與物體之間的距離，使物體經(jīng)過放大鏡成像在距離人眼睛25OInln處，即眼睛的明視距離，這時能最大限度的使用放大鏡觀察物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。取D=250，上式可寫成:上面這個式子，我們稱其為放大鏡的視放大率。視放大率僅僅決定于放大鏡的焦距。2.1.3視度調(diào)節(jié)正常人的眼睛在沒有調(diào)節(jié)的自然狀態(tài)下，無限遠(yuǎn)物體所成的象正好位于網(wǎng)膜上。近視眼的人對無窮遠(yuǎn)物體的成像點則位于網(wǎng)膜前方，所以近視眼不能看清無窮遠(yuǎn)物體，而只能看清一定距離的物體。為了能看清遠(yuǎn)處的物體，就要求從目視光學(xué)儀器的目鏡射出的光束是發(fā)放光束:而對于遠(yuǎn)視眼，在自然狀態(tài)下對無窮遠(yuǎn)物體成像點位于視網(wǎng)膜的后方，因此，為便于遠(yuǎn)視眼接受，則要求從目視光學(xué)儀器射出的光束為會聚光束。圖2.3是近視眼和遠(yuǎn)視眼裸視無窮遠(yuǎn)是光線的會聚情況。目視光學(xué)儀器為了適應(yīng)視力不同的人使用，是利用改變目鏡的前后位置使儀器所成的象，位于前方、位于無窮遠(yuǎn)和位于后方的一定距離上來適應(yīng)近視眼、正常眼和遠(yuǎn)視眼的需要的。目視光學(xué)儀器的目鏡前后移動的過程就叫做目視光學(xué)儀器的視度凋節(jié)5由目視光學(xué)儀器目鏡射出的光束對出射光瞳的會聚度，稱為目視光學(xué)儀器的視度，通常用N表示。用非正常眼遠(yuǎn)點距離的倒數(shù)(R一與表示近視或遠(yuǎn)視眼的程度，稱為視度。若遠(yuǎn)點距離的單位為米，則視度的單位為折光度。例如遠(yuǎn)點距離尹=0.5m的近視眼，其近視的程度為一2光折度。(醫(yī)院和眼鏡店通常把1個折光度6作為100度。一2折光度就是200度)，圖2.4是使用眼鏡對近視和遠(yuǎn)視眼進行矯正的原理。對于近視眼必須將儀器的目鏡向里調(diào)，由目視光學(xué)儀器物鏡成的象必然落在目鏡前焦面以內(nèi)，所以由目鏡射出的光束是發(fā)散光束，相當(dāng)于近視眼戴上了一塊負(fù)透鏡的眼鏡，以適合近視眼觀察。對遠(yuǎn)視眼，就必須將目鏡往外調(diào)，以使物鏡所成的象落在目鏡的前焦面以外，這樣由目鏡射出的光束是會聚光束，其作用與遠(yuǎn)視眼戴上正透鏡的眼鏡一樣?？梢?，不同視力的人眼對物鏡成像光線有不同的要求。由于這個原因，使得目鏡系統(tǒng)必須有一定的工作距離以便調(diào)節(jié)適應(yīng)不同視力的人眼。目鏡概論工程碩士學(xué)位論文是出射光瞳，它限制成象光束的孔徑。其通過放大鏡的共扼象為入射光瞳?？稍谖锘蛳笃矫嬖O(shè)有視場光闌。放大鏡本身是漸暈光闡又是入射窗和出射窗。因為有漸暈存在，在線漸暈系數(shù)為零處，即BZ點，限定了可見視場。圖2.5放大鏡系統(tǒng)的光闌2.2放大鏡的孔徑光闌和視場光闌目鏡系統(tǒng)從原理上一說其實就是一個復(fù)雜化的放大鏡，所以了解其特點可以先從最簡單的單片式放大鏡的原理說起。由單透鏡構(gòu)成的低倍放大鏡，其光束限制的問題往往和眼瞳結(jié)合起來考慮。人的眼瞳作為這個光學(xué)系統(tǒng)的一個光孔。系統(tǒng)中有兩個光孔:放大鏡的鏡框，設(shè)直徑是Za;眼睛的瞳孔，設(shè)直徑是2口。這個時候眼瞳是整個系統(tǒng)的出瞳，就是孔徑光闌。另外，因為整個系統(tǒng)中只有兩個光孔，所以另一個光孔，就是放大鏡框，所以它本身必然起著限制視場的作用，充當(dāng)了系統(tǒng)中視場光闌的作用。同時，也是入射窗和出射窗。由于系統(tǒng)的入射窗于物平面不重合，所以，該系統(tǒng)必定會有漸暈的現(xiàn)象。物平面上成像范圍(線視場的大小)，與放大鏡框，眼瞳直徑，以及它們之間的距離所決定。如圖2.5所示。物平面置于放大鏡的前焦面附近，眼睛處于放大鏡的后焦面附近，假設(shè)在眼球光軸和放大鏡光軸處于共線的情況下來考慮的。此時眼瞳是孔徑光闌，也是出射光瞳，它限制成象光束的孔徑。其通過放大鏡的共扼象為入射光瞳?？稍谖锘蛳笃矫嬖O(shè)有視場光闌。放大鏡本身是漸暈光闡又是入射窗和出射窗。因為有漸暈存在，在線漸暈系數(shù)為零處，即BZ點，限定了可見視場。圖2.5放大鏡系統(tǒng)的光闌。其中，角度為2記，的視場內(nèi)沒有漸暈，在這個范圍內(nèi)每點均以充滿眼瞳的全光束成像7，由2w所決定的50%的則是有漸暈的視場。，而由2w2所決定的則是放大鏡所可能成像的最大視場。由上圖我們可以得出，三種情況的視場與鏡頭參數(shù)的關(guān)系如下:公式中可以看出，放大鏡鏡框的直徑與視場成正比，眼睛與放大鏡距離與視場成正比。我們用物平面上的圓的直徑或者線視場2Y8來表示視場的大小。當(dāng)物平面位于放大鏡的物方焦點上時，此時，像平面必定在無限遠(yuǎn)處.如下圖2.7所示:公式中可以看出，放大鏡的視放大率與視場成反比。顯微鏡的光學(xué)原理2.1折射和折射率 光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點之間以直線傳播，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。2.2凸透鏡的五種成象規(guī)律(1) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點以外形成縮小 倒立實象；(2) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象；(3) 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放的倒立實象； (4) 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象； (5) 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點以內(nèi)時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛象。2.3顯微鏡的成像原理普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造主要分為3 部分: 機械部分、照明部分和光學(xué)部分, 顯微鏡的光學(xué)部分是由物鏡和目鏡兩個凸透鏡組成的. 如圖1 所示,當(dāng)待測物體A B 放在物鏡Lo 焦點外側(cè)時, 在物鏡Lo 后所成的實像A1 B1恰在目鏡Le 焦點內(nèi)側(cè)靠近焦點處, 經(jīng)目鏡再次放大成一虛像A2 B2 . 這樣觀察者看到的是經(jīng)兩次放大后的倒立的虛像, 這就是顯微鏡放大成像的基本過程.圖1 普通光學(xué)顯微鏡成像原理圖對于一個成品顯微鏡來說, 我們需要應(yīng)用一些光學(xué)技術(shù)參數(shù)來描述它的工作性能, 其中一個重要的參數(shù)就是顯微鏡的放大率M, 它可以描述顯微鏡的放大本領(lǐng). 利用幾何關(guān)系, 可以計算得到它的放大率M 約為 5式( 1) 中, D 是明視距離; = L - f e- f o , 稱為顯微鏡的光學(xué)距離; L 是顯微鏡的鏡筒長; f e、f o 分別是物鏡和目鏡的焦距; e , o 分別是目鏡和物鏡的放大率.普通光學(xué)顯微鏡雖然實現(xiàn)了放大物體的目的, 但是由于它所成的像是倒立的, 因此, 在實際操作過程中會不方便, 主要是不符合人們的一般習(xí)慣, 比如說在操作過程中定位所觀察的標(biāo)本時,操作的過程會和觀察者看到的方向相反, 對于沒有經(jīng)過長時間訓(xùn)練的操作者或者不常使用顯微鏡的觀察者來說會產(chǎn)生很多不必要的麻煩,為了解決這一問題, 我們設(shè)計了成正立像的光學(xué)顯微鏡.顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。 物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像AB。 AB靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像AB后供眼睛觀察。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。 一、顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)及其放大率 顯微鏡是由物鏡和目鏡組成（圖1.3）。物鏡先將物體AB形成一個倒立的放大的實像AB，此像成在目鏡的焦面內(nèi)側(cè)附近。然后通過目鏡又形成一個放大的虛像AB，按人眼觀看物體的習(xí)慣，此虛像成在眼睛的明視距離處。由光學(xué)理論知道，顯微鏡的放大率是由物鏡的放大率（或稱為放大倍數(shù)、線放大率、垂軸放大率）乘以目鏡的視角放大率。這里請注意與的區(qū)別。：光學(xué)筒長，物鏡后焦點到目鏡前焦點之間的距離。式（1.4）中x為焦像距，物鏡后焦點到像點之間的距離。顯微物鏡將像成在目鏡前焦點附近，x近似等于（見圖1.3）。式（1.6）中的“-”表示所成的像是倒立的。二、顯微鏡的機械筒長和光學(xué)筒長 絕大多數(shù)顯微鏡的物鏡和目鏡各有數(shù)個組成一套，以便通過調(diào)換獲得各種放大率。物鏡的放大率通常有：3、10、40和100倍，目鏡：6、10 和16倍。為了使用方便，多個物鏡組裝在一個可旋轉(zhuǎn)的盤上，而目鏡采用分個插入式。取下物鏡和目鏡所剩的鏡筒殼，其長度稱為機械筒長。為了能使物鏡通用，我國規(guī)定顯微鏡的機械筒長為160mm和無窮大二種。適用機械筒長無窮大的物鏡意味經(jīng)物鏡折射后的光線是平行光。光學(xué)筒長為物鏡后焦點到目鏡前焦點之間的距離，此數(shù)據(jù)在式（1.4）中得到應(yīng)用。物鏡的物平面到像平面之間距離稱為共軛距, 我國規(guī)定為T=195mm。通常，顯微物鏡的放大率、數(shù)值孔徑、機械筒長和所用蓋玻片的厚度等4個數(shù)值標(biāo)注在物鏡的鏡筒外殼上。例如某一物鏡標(biāo)注如下數(shù)據(jù)：40/0.65 、 160/0.17，其含義是：物鏡的放大率40倍、數(shù)值孔徑0.65，適用于機械筒長160mm的顯微鏡中，所用蓋玻片的厚度為0.17mm。三、物鏡基本類型由于光學(xué)系統(tǒng)會產(chǎn)生各種像差，所以物鏡與目鏡大采用多片鏡片組成來校正像差，以保證對成像質(zhì)量的要求。像差分二類7種，它們是單色光類：球差、慧差、像散、場曲（像面彎曲）和畸變；復(fù)色光類：位置色差和倍率色差。根據(jù)顯微物鏡校正像差的情況不同，在通常消除球差和慧差等基本像差情況下，以消除色差和場曲的程度再分為消色差物鏡、復(fù)消色差物鏡和平視場物鏡。消色差物鏡是應(yīng)用最廣泛的一類顯微物鏡，它的特點是對紅色光和藍(lán)色光消除色差。 復(fù)消色差物鏡主要用于科學(xué)研究用顯微鏡及顯微照相中，它的特點是對紅色光、藍(lán)色光及黃色光三種色光消除色差。平視場物鏡是嚴(yán)格要求校正像面彎曲，使成像平面平直。2物鏡的標(biāo)志（1）物鏡類別國產(chǎn)物鏡，用物鏡類別的漢語拼音字頭標(biāo)注，如平面消色差物鏡標(biāo)以“PC。西歐各國產(chǎn)物鏡多標(biāo)有物鏡類別的英文名稱或字頭，如平面消色差物鏡標(biāo)以 “Planarchromatic或Pl”， 消色差物鏡標(biāo)以“Achromatic”， 復(fù)消色差物鏡標(biāo)以 “Apochromatic” 。（2）物鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑標(biāo)在鏡筒中央位置，并以斜線分開，如10X/0.30，45X/0.63，斜線前如10X，45X為放大倍數(shù)，其后為物鏡的數(shù)值孔徑如0.30，0.63。（3）適用的機械鏡筒長度如170，190，/0，表示機械鏡筒長度（即物鏡座面到目鏡筒頂面的距離）為170，190，無限長。0表示無蓋波片。（4）油浸物鏡標(biāo)有特別標(biāo)注，刻以HI,oil，國產(chǎn)物鏡標(biāo)有油或Y。物鏡的標(biāo)志如圖7所示。（a） （b）圖7 物鏡的性能標(biāo)志（a）國產(chǎn)物鏡 （b）Zeiss公司物鏡PC平場 Achromatic消色差10X放大倍數(shù) 40X放大倍數(shù) 0.30數(shù)值孔徑 0.65數(shù)值孔徑機械鏡筒長度 170機械鏡筒長度0無蓋波片PC10X/0.30/0Achromatic40X/0.651703目鏡的類型目鏡的作用是將物鏡放大的象再次放大，在觀察時于明視距離處形成一個放大的虛象，而在顯微攝影時，通過投影目鏡在承影屏上形成一個放大的實象。按象差分類的常用的幾種物鏡如下：（1）消色差及平面消色差物鏡消色差物鏡對象差的校正僅為黃、綠兩個波區(qū)，使用時宜以黃綠光作為照明光源，或在入射光路中插入黃綠色濾色片，以使象差大為減少，圖象更為清晰。而平面消色差物鏡還對象域彎曲進行了校正，使圖象平直，邊緣與中心能同時清晰成象。適用于金相顯微攝影。（2）復(fù)消色差及平面復(fù)消色差物鏡復(fù)消色差物鏡色差的校正包括可見光的全部范圍，但部分放大率色差仍然存在。而平面復(fù)消色差物鏡還進一步作了象域彎曲的校正。（3）半復(fù)消色差物鏡象差校正介于消色差和復(fù)消色差物鏡之間，其它光學(xué)性質(zhì)與復(fù)消色差物鏡接近。但價格低廉，常用來代替復(fù)消色差物鏡。目鏡按象差校正及適用范圍分類如下：（1）負(fù)型目鏡(如福根目鏡)由兩片單一的平凸透鏡在中間夾一光欄組成，接近眼睛的透鏡稱目透鏡起放大作用，另一個稱場透鏡,使圖象亮度均勻，未對象差加以校正，只適用于與低中倍消色差物鏡配合使用。（2）正型目鏡(如雷斯登目鏡)與上述不同的是光欄在場透鏡外面，它有良好的象域彎曲校正，球面象差也較小，但色差比較嚴(yán)重，同倍數(shù)下比負(fù)型目鏡觀察視場小。（3）補償型目鏡是一種特制目鏡，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，用以補償校正殘余色差，宜與復(fù)消色差物鏡配合使用，以獲得清晰的圖象。（4）攝影目鏡專用于金相攝影，不能用于觀察，球面象差及象域彎曲均有良好的校正。（5）測微目鏡用于組織的測量，內(nèi)裝有目鏡測微器，與不同放大倍數(shù)的物鏡配合使用時，測微器的格值不同。4目鏡的標(biāo)志通常一般目鏡上只標(biāo)有放大倍數(shù)，如7X，10X，12.5X等，補償型目鏡上還有一個K字，廣視域目鏡上還標(biāo)有視場大小。見圖8所示。 圖8 目鏡的標(biāo)志（a）普通目鏡 （b）廣視域目鏡5X放大倍數(shù) WF廣視域10X放大倍數(shù)18MM視場大小WF10X18MM 4.3聚光鏡 聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。聚光鏡光欄 所謂光欄，從廣義的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可認(rèn)為光欄。 聚光鏡光欄作用 （1）改變聚光鏡的數(shù)值孔徑以便與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，可調(diào)整圖象的分辨率和反差。 （2）輔助調(diào)整亮度。四、顯微鏡照明系統(tǒng)用顯微鏡觀察物體，大多為自身并不發(fā)光的標(biāo)本，需要外界照明。照明系統(tǒng)主要包括光源、濾光器、聚光器和光闌。根據(jù)光源的不同可分為室內(nèi)光照明、專用電光源照明；根據(jù)聚光器把光源成像的位置不同分為臨界照明和柯拉照明；根據(jù)照明光透過物體進入物鏡形成的反差類型分為明視場照明和暗視場照明等。1、 自然光照明 低擋的普通生物顯微鏡僅使用平面反射鏡或凹面反射鏡反射室內(nèi)照明光或室外陽光直接給標(biāo)本照明。 2、臨界照明和柯拉照明圖1.4 臨界照明光學(xué)系統(tǒng) 圖1.5 柯拉照明光學(xué)系統(tǒng)1 光源 2 聚光鏡 3聚光鏡 1 聚光鏡 3 可變視場光闌 4 可變視場光闌 5 物鏡 4 標(biāo)本臺 5 聚光鏡 6 標(biāo)本臺 7 物鏡 8 物鏡入瞳 這類照明光源通常是設(shè)備自身攜帶的電光源，適用于透明物體的照明。臨界照明(圖1.4)：光源經(jīng)過聚光鏡后，成像于被觀察的物體平面上。這種照明系統(tǒng)的優(yōu)點是光能利用率高，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單。但由于光源的像與物體面重合，光源本身亮度不均勻，所以帶來照明亮度不均勻。 柯拉照明(圖1.5)：光源經(jīng)過聚光鏡后，成像于物鏡的入瞳處，在物面上形成一個均勻的亮體。它的優(yōu)點是照明亮度均勻。 缺點是光能損失較大，又其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。3、用暗視場來觀察微粒的照明 圖1.6 透射光暗視場照明 圖1.7 落射光暗視場照明1 光源 2 聚光鏡 3 濾光 4 暗視場聚光鏡 1 聚光鏡 2 反光鏡 3 物鏡5 標(biāo)本臺 6 物鏡 這類照明系統(tǒng)特點是用大孔徑角照明標(biāo)本，照明光束的主直射光被遮擋，僅讓周圍斜射光通過。由于物鏡孔徑相對照明系統(tǒng)孔徑角要小，周圍斜射光線不能進入物鏡，視野是一片黑暗。但是若標(biāo)本面上存在微粒，斜射光被微粒所衍射和散射，從而進入物鏡成像，在黑暗的背景上形成了明亮的標(biāo)本像。這就是暗視場照明的工作原理（圖1.6、圖1.7）。 利用暗視場技術(shù)增加了圖像的對比度，可以觀察到普通明視場中看不到的物體，如細(xì)菌、細(xì)胞活體等。同時，即使小于物鏡分辨率的微粒，每個微粒的衍射光在暗背景中形成的各自彩色衍射光環(huán)，因此觀察者們能覺察到微粒存在，這就是超微顯微術(shù)的一種型式。 暗視場照明的優(yōu)點：（1）能直接觀察各種粒子。（2）可提高顯微鏡分辨率，從普通顯微鏡分辨率約0.4m 提高到0.2-0.004m的極小微粒。五、顯微鏡的分辨率和有效放大率根據(jù)瑞利判斷原則，顯微鏡的分辨率由衍射中心光斑的半徑確定。它主要取決于物鏡的數(shù)值孔徑NA之值大小，是顯微鏡的一個重要特性。通常用可辨別的樣品上的兩點間的最小距離d來表示，d值越小，表示顯微鏡的鑒別能力越高。見圖（a） （b） （c）圖6 顯微鏡分辨率高低示意圖 (a)樣品上兩點之間距離 (b)低分辨率 (c)高分辨率ddd顯微鏡的鑒別能力可用下式表示：d=2NA其中：入射光的波長，NA表示物鏡的數(shù)值孔徑?？梢姺直媛逝c入射光的波長成正比，越短，分辨率越高。與數(shù)值孔徑成反比，數(shù)值孔徑NA越大，d值越小，表明顯微鏡的鑒別能力越高。我們?nèi)缬? 0.5m 、NA=1.5物鏡數(shù)據(jù)代入式（1.2）中，得到：這個0.2m值就是在上述情景下顯微鏡的最小分辨距離，也就是顯微鏡的分辨率。采用不同的光波和數(shù)值孔徑，就有不同的物鏡分辨率，這是挑選顯微物鏡的重要依據(jù)。顯微鏡的有效放大率是這樣考慮的：通常，人眼觀察物體的最小分辨的標(biāo)準(zhǔn)角度為1，考慮到較容易觀察的要求，分辨角度放大到2 4。在明視距離250mm處，2 4角度對應(yīng)的距離為： 250(20.00029)0.145 （mm） 250(40.00029)0.291 （mm） (0.00029是角度秒換算成弧度的系數(shù)) 這個數(shù)值與顯微鏡最小分辨距離0之比值即是顯微鏡有效放大率。用上式計算出的值0.2m代入：按此計算，顯微鏡的有效放大率在750倍到1500倍之間。3.7焦點深度 在顯微鏡的光軸上有一段距離范圍內(nèi)物體被看得清晰。超出這段距離的物體就模糊不清。這段距離位于顯微鏡焦點的上下很小的范圍之內(nèi)。這段距離的上下限叫焦點深度。3.8視場數(shù) 目鏡中觀察到的物像的一定范圍叫視野。 顯微鏡的總放大率小的時候所能看到的標(biāo)本的范圍大，而總放大率愈大所能看到的標(biāo)本的局部愈小。所以說視野與顯微鏡的總放大率成反比。 在同一總放大率的條件下視野也可有大小差別。這種差別決定于目鏡的某些性能。首先目鏡的視場光欄的直徑是最主要的條件。視場光欄的直徑叫目鏡的視場數(shù)值3.9工作距離 工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。 在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。 數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。提高顯微鏡分辨率的方法：（1）增大物鏡的數(shù)值孔徑在物鏡和蓋玻片之間充以n 較大的油，如香柏油n =1.52,不僅使n 增大，而且孔徑角a 也增大。（2）用短波長的光照射如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。4物鏡的數(shù)值孔徑物鏡的數(shù)值孔徑用NA表示（即Numderical Apertuer），表示物鏡的聚光能力。數(shù)值孔徑大的物鏡，聚光能力強，即能吸收更多的光線，使圖象更加明顯，物鏡的數(shù)值孔徑NA可用公式表示為：NA=nsin 其中：n是物鏡與樣品間介質(zhì)的折射率通過物鏡邊緣的光線與物鏡軸線所成角度，即孔徑半角?？梢?，數(shù)值孔徑的大小，與物鏡與樣品間介質(zhì)n的大小有關(guān)，以及孔徑角的大小有關(guān)。見圖5所示。介質(zhì)(空氣n=1.0實線) (油n=1.52虛線)R2 R1 物鏡 R1 R2=30R2 R1R1 R2當(dāng)物鏡與物體之間的介質(zhì)為空氣時，光線在空氣中的折射率為n=1，若物鏡的孔徑半角為30，則數(shù)值孔徑為：NA=n sin=1sin30=0.5若物鏡與物體之間的介質(zhì)為松柏油時，介質(zhì)的折射率n=1.52,則其數(shù)值孔徑為：NA=n sin=1.52sin30=0.76 物鏡在設(shè)計和使用中,指定以空氣為介質(zhì)的稱干系物鏡或干物鏡，以油為介質(zhì)的稱為油浸系物鏡或油物鏡。干物鏡的n=1，sin值總小于1，故數(shù)值孔徑NA小于1，油物鏡因n=1.5以上，故數(shù)值孔徑NA大于1。物鏡的數(shù)值孔徑的大小，標(biāo)志著物鏡分辨率的高低，即決定了顯微鏡分辨率的高低。顯微鏡的放大倍數(shù)物鏡的放大倍數(shù)M物=A1B1/ABLF1目鏡的放大倍數(shù)=A2B2/A1B1DF2兩式相乘：M物M目=A1B1/ABA2B2/A1B1=A2B2/AB=LF1DF2=L250F1F2=M總式中：L為光學(xué)鏡筒長度（即物鏡后焦點到目鏡前焦點的距離）F1物鏡的焦距。 F2目鏡的焦距D明視距離（人眼的正常明視距離為250mm）即顯微鏡總的放大倍數(shù)等于物鏡放大倍數(shù)和目鏡放大倍數(shù)的乘積。一般金相顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)1600到2000倍。由此可看出：因為L光學(xué)鏡筒長度為定值，可見物鏡的放大倍數(shù)越大，其焦距越短。在顯微鏡設(shè)計時，目鏡的焦點位置與物鏡放大所成的實象位置接近，并使目鏡所成的最終倒立虛象在距眼睛250毫米處成象，這樣使所成的圖象看得很清楚。顯微鏡的主要放大倍數(shù)一般通過物鏡來保證，物鏡的最高放大倍數(shù)可達(dá)100倍，目鏡的最高放大倍數(shù)可達(dá)25倍。放大倍數(shù)分別標(biāo)注在物鏡和目鏡各自的鏡筒上。在用金相顯微鏡觀察組織時，應(yīng)根據(jù)組織的粗細(xì)情況，選擇適當(dāng)?shù)姆糯蟊稊?shù)，以使組織細(xì)節(jié)部分能觀察清楚為準(zhǔn)，不要只追求過高的放大倍數(shù)，因為放大倍數(shù)與透鏡的焦距有關(guān)，放大倍數(shù)越大，焦距越小，會帶來許多缺陷。3透鏡象差：透鏡象差就是透鏡在成象過程中，由于本身幾何光學(xué)條件的限制，圖象會產(chǎn)生變形及模糊不清的現(xiàn)象。透鏡象差有多種，其中對圖象影響最大的是球面象差、色象差和象域彎曲三種。顯微鏡成象系統(tǒng)的主要部件為物鏡和目鏡，它們都是由多片透鏡按設(shè)計要求組合而成，而物鏡的質(zhì)量優(yōu)劣對顯微鏡的成象質(zhì)量有很大影響。雖然在顯微鏡的物鏡、目鏡及光路系統(tǒng)等設(shè)計制造過程中，已將象差減少到很小的范圍，但依然存在。（1）球面象差：1）產(chǎn)生原因：球面象差是由于透鏡的表面呈球曲形，來自一點的單色光線，通過透鏡折射以后，中心和邊緣的光線不能交于一點，靠近中心部分的光線折射角度小，在離透鏡較遠(yuǎn)的位置聚焦，而靠近邊緣處的光線偏折角度大，在離透鏡較近的位置聚焦。所以形成了沿光軸分布的一系列的象，使圖象模糊不清。這種象差稱球面象差，見圖2所示。圖2 球面象差示意圖A2）校正方法：a 采用多片透鏡組成透鏡組，即將凸透鏡與凹透鏡組合形成復(fù)合透鏡，產(chǎn)生性質(zhì)相反的球面象差來減少。b 通過加光欄的辦法，縮小透鏡的成象范圍。因球面象差與光通過透鏡的面積大小有關(guān)。在金相顯微鏡中，球面象差可通過改變孔徑光欄的大小來減小?？讖焦鈾谠酱?，通過透鏡邊緣的光線越多，球面象差越嚴(yán)重。而縮小光欄，限制邊緣光線的射入，可減少球面象差。但光欄太小，顯微鏡的分辨能力降低，也使圖象模糊。因此，應(yīng)將孔徑光欄調(diào)節(jié)到合適的大小。（2）色象差：1）產(chǎn)生原因：色象差的產(chǎn)生是由于白光是由多種不同波長的單色光組成，當(dāng)白光通過透鏡時，波長愈短的光，其折射率愈大，其焦點愈近。而波長越長，折射率越小， 其焦點愈遠(yuǎn)，這樣一來使不同波長的光線，形成的象不能在同一點聚焦，使圖象模糊所引起的象差，即色象差。見圖3所示。2）校正方法：可采用單色光源或加濾色片或使用復(fù)合透鏡組來減少。圖3 色象差示意圖A（3）象域彎曲：1）產(chǎn)生原因：垂直于光軸的平面，通過透鏡所形成的象，不是平面而是凹形的彎曲象面。稱象域彎曲。見圖4所示。2）校正辦法：象域彎曲的產(chǎn)生，是由于各種象差綜合作用的結(jié)果。一般的物鏡或多或少地存在著象域彎曲，只有校正極佳的物鏡才能達(dá)到趨于平坦的象域。ABBA圖4 象域彎曲示意圖第二節(jié) 光學(xué)顯微術(shù)裝置及其顯微鏡生物及醫(yī)用顯微鏡可分為普通型生物顯微鏡、特種型生物顯微鏡和高級型生物顯微鏡。普通型生物顯微鏡僅供一般用途，普通醫(yī)用顯微鏡、倒置顯微鏡均屬此類。特種型生物顯微鏡可作某些專門觀察和研究用，暗視場生物顯微鏡、熒光顯微鏡、相襯顯微鏡等均屬于此類。激光掃描共聚焦顯微鏡是80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用在各行各業(yè)上。以下簡單介紹幾種特種型生物顯微鏡的工作原理。2.1 落射光顯微鏡顯微鏡的照明光從觀察者一側(cè)沿物鏡光軸方向照射到物體表面，并由其反射回到物鏡成像的顯微鏡稱為落射光顯微鏡。落射光有二種可能性： 一、專用落射光物鏡：這種物鏡的鏡體分內(nèi)外兩層套筒。內(nèi)層是專用于紫外光線的石英物鏡，外圍有一圈環(huán)形反光鏡。照明光束由環(huán)形反光鏡向下照射到物體，由物體反射的光進入物鏡成像（圖1.7 ）。二、由分色濾光鏡和物鏡組成（圖1.13 ）：用分色濾光鏡做到入射光路和反射光路共軸，這時物鏡即有聚光鏡功能又是成像的物鏡，在6中將要介紹的熒光顯微鏡就屬于此類。分色濾光鏡是在玻璃上噴鍍了一層金屬膜或多層介質(zhì)膜，使入射光線一半能量透過而另一半被反射。2.2 暗視場顯微鏡 暗視場顯微技術(shù)是暗視場照明，其關(guān)鍵部件是暗視場聚光鏡，在第一章已有敘述。從照明方式可分為落射光照明和透射光照明。圖1.6、1.7中示出的暗視場聚光鏡就是眾多種的幾種。 2.3 偏振光顯微鏡偏振光顯微鏡是利用光的波動性來觀察和測量標(biāo)本的細(xì)節(jié)變化，判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡。這種偏振光顯微鏡在生物學(xué)領(lǐng)域中可以鑒定生物結(jié)晶的性質(zhì)、膜結(jié)構(gòu)的分子排列、生物膜的厚度等。普通顯微鏡采用自然光照明。從波動學(xué)的角度來講，自然光的波是各個方向所取向的振動面能量均相等，無占優(yōu)勢。而從自然光中分離出來具有特定取向的振動面的光稱為偏振光，如果僅只有一個振動面的光叫完全偏振光或線偏振光。偏振光的獲得通常有二種辦法。一種是利用晶格整齊排列的薄膜，晶格排列的方向稱偏振軸，它僅讓光線與偏振軸平行振動面的光波通過，而與其垂直方向的光波都被吸收。另一種是利用晶體各向異性的特點，來獲得偏振光。透明介質(zhì)按其光學(xué)特性可分為各向同性介質(zhì)和各向異性介質(zhì)。所謂各向同性介質(zhì)是指光線通過它時，各振動方向的光波傳遞速度是相同的，而各向異性介質(zhì)是不同振動方向有不同速度。用各向異性晶體制成特定形狀的棱鏡，當(dāng)一束光線通過這種棱鏡時，會被分解成二束振動方向相互垂直的線偏振光，從而獲得偏振光。由于前一種方法結(jié)構(gòu)簡單、價格低，目前得到廣泛應(yīng)用。把用途不同的偏振鏡片分為起偏鏡片和檢偏鏡片。起偏鏡片是將自然光濾成偏振光，而檢偏鏡片是檢測光線的偏振性質(zhì)，通常是把起偏鏡片和檢偏鏡片組合使用。當(dāng)起偏鏡片方向與檢偏鏡片的方向互相平行時，通過起偏鏡片的光也能通過檢偏鏡片，這時所觀察的視野為最亮。當(dāng)兩者的偏振軸方向相互垂直，又稱為正交，那么，通過起偏鏡片的光，則被檢偏鏡吸收，不能通檢偏鏡片，觀察視野為最暗（圖1.8 ）。在正交的起偏鏡片和檢偏鏡片中加一被檢的偏振鏡片，而此偏振鏡片的偏振軸方向與起偏鏡片和檢偏鏡片的偏振軸都不相同，那么破壞了原來的正交性，觀察的視野出現(xiàn)亮光。圖1.8 光的偏振試驗生物標(biāo)本的細(xì)節(jié)具有極為復(fù)雜的光學(xué)特性，有各向同性的，也有各向異性，有的結(jié)構(gòu)受到外界影響從各向同性轉(zhuǎn)向各向異性，出現(xiàn)雙折射現(xiàn)象，這些現(xiàn)象就可以利用偏振光顯微鏡給予觀察。圖1.9所示的偏振光顯微鏡就是利用生物標(biāo)本的細(xì)節(jié)具有各向異性而觀察的。在起偏鏡片和檢偏鏡片的偏振軸方向正交垂直的情況下，中間安插一被檢標(biāo)本，而標(biāo)本具有各向異性特點時，改變了由起偏鏡決定偏振光的方向，破壞了與檢偏鏡正交垂直的特性，光線就從檢偏鏡片透過，通過目鏡可以觀察到生物標(biāo)本細(xì)節(jié)的明暗變化情況。在偏振光顯微鏡中按裝了1/4波（晶）片（圖1.9）。它的作用是使偏振光線經(jīng)晶片后，振動光波的位相增大了1/4波長，也就是偏振角附加旋轉(zhuǎn)了45。從而使偏振方向僅有微小變化的樣本得到放大，增大標(biāo)本細(xì)節(jié)上的差異，便于觀察。波（晶）片是由沿光軸平行方向切割的適當(dāng)厚度的云母、方解石或水晶等晶體制成，用晶片的厚度來控制出射光的相位差。1光源2 起偏鏡片 3 光闌 4 聚光鏡5標(biāo)本6物鏡 7 14波片 8 檢偏鏡片 9 目鏡2.4 相襯顯微鏡在觀察生物及其它一些標(biāo)本時，常會遇到與周圍介質(zhì)具有同樣吸收系數(shù)和顏色，而折射率或厚度稍有不同的物體，我們稱之為位相物體。用普通的顯微鏡觀察難以看清，如加以染色，會殺死許多標(biāo)本活體，影響觀察效果。相襯顯微鏡是利用光的衍射和干涉原理，增大標(biāo)本細(xì)節(jié)上折射率的差異，來顯現(xiàn)出標(biāo)本細(xì)節(jié)的圖像。標(biāo)本細(xì)節(jié)的圖像。如圖1.10所示，有一塊透明的平行平板，在中間有一小部份的折射率為n1， 其余均為n 。今用相干的平行光束1和光束2直射，光束2通過n 1 的部份與光束1通過n的部份，它們的光程相差（n - n 1）d。當(dāng)這二束光線相遇，就會產(chǎn)生干涉，其光能量加大或減小。但是如果僅靠此，由于這二部份光的振幅（能量）相差很大，相位差異很小，在像平面上無法顯示清晰的圖形，應(yīng)用相襯顯微鏡可以解決以上二個缺陷。圖1.11是相襯顯微鏡的原理圖。 在光源和聚光鏡之間加一個環(huán)狀光闌，而環(huán)狀光闌經(jīng)聚光鏡成像在位相板上，正好與位相板上的介質(zhì)組成的圓環(huán)重合。由于位相板的作用，使直射光的位相滯后/2，或使衍射光位相滯后/2，同時使直射光光強大幅度下降，與衍射光相當(dāng)，這樣二束干涉光強與周圍光強就明顯分開，圖形看的很清晰了。衍射光位相滯后/2 稱為正相襯，位相板的環(huán)形部份僅起吸收直射光能量的作用，而其余通光部份則起到改變位相的作用。直射光的位相滯后/2 稱為負(fù)相襯，位相板的環(huán)形部份除了起吸收直射光能量的作用外，同時還改變直射光的位相。相襯顯微鏡關(guān)鍵部件有：一、環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌是在玻璃片上噴涂金屬薄膜借以擋光，只留下環(huán)形透光窄縫的光闌。環(huán)狀光闌被安裝在聚光鏡物方焦平面上，以產(chǎn)生相干光源的窄縫。二、位相板 位相板是用金屬來吸收部份光能，并用介質(zhì)使部份的光產(chǎn)生相位滯后，從而增大與衍射光的相位差。 三、對中望遠(yuǎn)鏡（合軸望遠(yuǎn)鏡） 對中望遠(yuǎn)鏡用以校正環(huán)形光闌中心、相位板中心與物鏡光軸在一條直線上。把對中望遠(yuǎn)鏡插入目鏡筒內(nèi)，可觀察到環(huán)形光闌與相位板的像，利用轉(zhuǎn)盤上的調(diào)節(jié)中心螺釘，可使環(huán)形光闌與相位板套準(zhǔn)，絕對不能相互偏離，也不能大小不一。2.5 干涉相襯顯微鏡干涉相襯顯微鏡是在利用偏振光觀察標(biāo)本各向異性物質(zhì)的現(xiàn)象基礎(chǔ)上，再利用偏振光的干涉現(xiàn)象進一步提高圖像的對比度和清晰度。圖1.12示出干涉相襯顯微鏡光路原理圖。從起偏鏡出射的線偏振光通過渥拉斯頓棱鏡之后，被剪切成振動方向互相垂直的兩束線偏振光。經(jīng)聚光鏡后，兩線偏振光以橫向位移的平行光透過標(biāo)本，然后經(jīng)物鏡在其后焦面聚焦，諾曼斯基棱鏡的干涉場正好處于物鏡的后焦面。經(jīng)過諾曼斯基鏡后，兩偏振光又會合在一起，而偏振方向仍互相垂直，故不能干涉，但經(jīng)過檢偏鏡后，振動方向一致了，于是在中間像面上形成干涉圖像，可用目鏡觀察。（渥拉斯頓棱鏡、諾曼斯基棱鏡是由晶體制作的偏振棱鏡） 圖1.12 干涉相襯顯微鏡 1 起偏鏡 2 渥拉斯頓棱鏡 3 聚光鏡 4 標(biāo)本 5 物鏡 6 諾曼斯基棱鏡 7 檢偏鏡 8 中間像面 2.6 熒光顯微術(shù)和熒光顯微鏡利用特定的光照射經(jīng)熒光色素處理的標(biāo)本受激而產(chǎn)生熒光，以觀察組織、細(xì)胞微小結(jié)構(gòu)的技術(shù)稱為熒光顯微術(shù)。根據(jù)成像光路的特點，熒光顯微鏡可分為透射光熒光顯微鏡和落射光熒光顯微鏡。圖1.13給出落射光熒光顯微鏡的光路原理圖。見圖1.13，由光源1發(fā)出的光線經(jīng)聚光鏡2會聚，通過激發(fā)濾光片3后僅有某一指定波段的光束，通過二向性分光鏡4及物鏡5照射標(biāo)本6。通常標(biāo)本6是經(jīng)過熒光染色處理的，在某指定波長的光束照射下，會被激發(fā)出相對應(yīng)波長的熒光，然后再經(jīng)物鏡5、二向性分光鏡4、與抑止濾光片7成像在目鏡8的前焦面處供觀察。激發(fā)濾光片與抑止濾光片是僅讓某指定波長的光通過，二向性分光鏡是讓短于某指定波長的光反射而長于此波長的光透過。一、熒光顯微鏡的優(yōu)點：1、采用紫外光，可提高顯微鏡分辨率。2、熒光顯微鏡能直接顯示細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)成份，并且顯示很輝煌的彩色效果，極易觀察，極易進行定量分析。3、熒光顯微術(shù)又是一種顯示標(biāo)記物質(zhì)如標(biāo)志熒光抗體的先進的特異性示蹤技術(shù)。 4、熒光用量少，對活細(xì)胞毒性極小，可進行活體分析。 5、顯色效果好。 6、方法筒便、易行，得出結(jié)果非常迅速，適用于醫(yī)學(xué)臨床診斷技術(shù)。二、對各組件的要求：1、光源 熒光顯微鏡的光源需含有豐富的激發(fā)熒光物質(zhì)的光譜，通常采用超高壓汞燈、超高壓氙燈或鹵鎢燈。 2、照明方式 透射熒光顯微鏡宜選用暗視場照明，暗的背景能使圖像的對比度好，并可降低對濾光片組的要求。落射熒光顯微鏡大多采用柯勒照明。 3、物鏡 為了能得到更多的光能，和避免雜散熒光產(chǎn)生，顯微鏡的物鏡大多采用大孔徑復(fù)消色差的石英物鏡。石英物鏡是用石英材料制成的鏡頭，它能在紫外光線照射下不會產(chǎn)生熒光現(xiàn)象。 4、浸液 在激發(fā)光的照射下，鏡頭浸液必須不會產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，常用的浸液有蒸餾水、硅油、甘油及無熒光油等。所選用的浸液折射率也必須與物鏡的要求相符，否則會影響成像質(zhì)量。5、濾光片組 濾光片選擇正確與否，是熒光顯微鏡能否得到正確應(yīng)用的關(guān)鍵。選用濾光片時，必須遵守斯托克斯定律：激發(fā)濾光片的透射波長二向性分光濾光片的透射波長抑止濾光片的透射波長（圖1.14）。通常，儀器生產(chǎn)廠家已經(jīng)把搭配好的濾光片固定在支架上，用時只需按要求選擇濾光片組就可以了。 圖1.14 濾光片組的選擇.7 激光掃描共聚焦顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡是利用激光通過照明針孔形成的點光源，經(jīng)物鏡成像與標(biāo)本平面上，標(biāo)本平面的工作臺作x-y二維空間移動，激光點在標(biāo)本每一點上照射掃描，標(biāo)本上被照射點又經(jīng)原物鏡在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管或冷電感合器件逐點或逐線接收，即時在計算機監(jiān)視器屏幕上形成圖像。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像。這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點。另外，標(biāo)本平面的工作臺可上下步進移動， 細(xì)胞或組織各個橫斷面的圖像都能清楚地顯示，實現(xiàn)了“光學(xué)切片”的目的。利用計算機圖像處理，把每一個橫斷面的圖像進行組合，還可以得到三維立體結(jié)構(gòu)，從而能十分靈活直觀地進行形態(tài)學(xué)觀察，并揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系（ 圖1.15）。激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)點：1、圖像是以電信號的形式記錄和貯存的，所以可以采用各種模擬的和數(shù)學(xué)電子技術(shù)進行圖像處理。2、在顯示過程中，物體經(jīng)精細(xì)調(diào)焦的光束照射而成像。這不僅可以共聚焦成像或相差成像，而且也可能用其它成像模式產(chǎn)生一些相關(guān)效應(yīng)。如采用熒光模式，稱為熒光激光掃描共聚焦顯微鏡，這種顯微鏡的優(yōu)點要比熒光顯微鏡有較高質(zhì)量的三維圖像，而且其分辨率遠(yuǎn)高于掃描熒光顯微鏡。同時由于加裝了激光掃描裝置，可以利用計算機進行圖像處理，使用紫外光或可見光來激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。3、用激光作為光源，具有激光的一些優(yōu)點：(1 ) 單色性強，波光范圍窄，可激發(fā)單一熒光探針；(2 ) 方向性強，其發(fā)射角度僅為毫弧數(shù)量級上，適合于微量分析。圖1.15 激光掃描共聚焦顯微鏡大視場顯微鏡的設(shè)計2. 1成像原