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VYSIS說明書試驗(yàn)程序原理 21 黃 Y 黃 X 綠在原位雜交X綠光探針centromerregion是一種在一個(gè)細(xì)胞標(biāo)本里能看見特定的核酸序列(尤其是DNA)的技術(shù)， (FISH) 包括精確的單股熒光標(biāo)記DNA探針的退火 與目的基因互補(bǔ). 探針熒光的DNA 位點(diǎn)能通過直接的檢測(cè)用熒光顯微鏡看到。羊水標(biāo)本包括間期細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法附著在玻片上。樣本標(biāo)本DNA變性，然后與 CEP x/y and LSI 21 探針雜交。在雜交后，多余的和未結(jié)合的探針被一系列洗滌所除掉。 染色體和核DNA用特殊的染料被復(fù)染，復(fù)染劑 DAP發(fā)藍(lán)光. 用裝上適合的激動(dòng)劑與發(fā)射濾器的熒光顯微鏡觀察 CEP X/Y 和 LSI 21 DNA 探針雜交，能看到強(qiáng)烈的橘黃光和綠色的熒光信號(hào)和藍(lán)色的復(fù)染核。 通過顯微鏡檢查 21 X, and Y染色體點(diǎn)計(jì)，熒光染色區(qū)域明亮地突出于核的DNA普通的藍(lán)色熒光(通過DAPI復(fù)染) . FISH 程序能使核的 21,X,and Y染色體點(diǎn)計(jì)可見。CEP X/Y DNA 探針是一種綠光和橘黃光混合物，直接標(biāo)記熒光的DNA探針，分別在X和Y染色體的DXZ1 和DYZ3 區(qū)。LSI 21 DNA 探針是一種橘黃色光直接標(biāo)記的熒光DNA 探針，包含特異性 DNA 序列對(duì)應(yīng)位于21號(hào)染色體21q22.13 到 21q22.2 區(qū)的D21S259 和D21S342 基因座.所有探針混合物都在雜交緩沖液中經(jīng)過了預(yù)變性以便于應(yīng)用。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)目的是用熒光原位雜交法探測(cè)和量化21,X,and Y染色體 。 試劑和儀器提供的材料本試劑盒包括四種試劑，夠約20次測(cè)試。 成分組成容量 儲(chǔ)藏LSI 21 DNA 探針:E.coli大腸桿菌質(zhì)粒 (探針經(jīng)過預(yù)變性 )橘黃光標(biāo)記DNA 探針與阻斷DNA 和雜交緩沖液預(yù)混合（右旋糖酐硫酸鹽,甲酰胺， SSC）200ul/ 小瓶(10ng/ul)-20 避光CEP X/Y DNA 探針(探針經(jīng)過預(yù)變性 )綠光熒光標(biāo)記X探針和橘黃光標(biāo)記Y 探針，與阻斷DNA 和雜交緩沖液預(yù)混合 （右旋糖酐硫酸鹽,甲酰胺，SSC）200ul/小瓶（15ng/ul20避光DAPI II復(fù)染劑125ng/Ml DAPI在 苯二胺 二氫氯化物, ,甘油 和緩沖液中600ul/1小瓶-20避光NP-40去離子去污劑4ml/ 2小瓶20到2520x SSC氯化鈉和檸檬酸鈉66g/ 1包裝同上探針對(duì)照玻片男性，羊水細(xì)胞（正常） 固定的生物標(biāo)本 得自正常男性羊水細(xì)胞加于玻璃顯微鏡玻片 5 片(10靶區(qū))20 干燥產(chǎn)前篩查陽性探針對(duì)照玻片。 固定的生物標(biāo)本 得自人成纖維細(xì)胞系加于玻璃顯微鏡玻片5slides（10靶區(qū)）同上儲(chǔ)存和處理儲(chǔ)存未開封的試劑盒做為一個(gè)整體在 -20 避光，避濕 . 20 x SSC 應(yīng)單獨(dú)儲(chǔ)存于室溫。儲(chǔ)存探針對(duì)照玻片在一個(gè)密封的容器中在-20，應(yīng)用干燥劑防潮. 每一個(gè)未開封的試劑盒成分的失效日期標(biāo)于獨(dú)立的標(biāo)簽上。這些儲(chǔ)存條件適用于所有開封及未開封的組成部分。 需要但未提供的材料實(shí)驗(yàn)室試劑超純甲酰胺儲(chǔ)存于 +4 至多一個(gè)月（從收到起，具體看制造商的建議的詳細(xì)信息）濃縮鹽酸(12N) HCL1N 氫氧化鈉純凈水(蒸餾或去離子的or Milli-Q). 儲(chǔ)存于室溫中carmoys 固定劑 (3:1 甲醇:醋酸)drierite干燥劑1x 胰蛋白酶 /EDTA (0.05% 胰蛋白酶,0.53Mm EDTA -4Na 于 Hanks 平衡鹽溶液中without Cacl2,Mgcl2.6H2O and M gSO4-7H2O)0.56%氯化鉀實(shí)驗(yàn)室器械熒光顯微鏡（裝備建議的濾光器） 定相對(duì)照光學(xué)顯微鏡預(yù)先清潔的顯微鏡玻片玻片加溫器(45 -50 ) 22mm x22mm玻璃蓋玻片 (1-10ul)微升消毒槍頭聚丙烯微離心管(0.5ml or 1.5ml) 定時(shí)器磁力攪拌器 渦流微離心機(jī) 量筒水浴(672 和731)空氣孵化器恒溫箱(37)菱形頭劃線器濕室 鉗子（鑷子）無菌注射器(5ml)Coplin 缸(6) 建議型號(hào) :wheaton 產(chǎn)品.No.900620 垂直染缸PH 計(jì)和 PH 試紙校準(zhǔn)的溫度計(jì)金屬試管架橡膠粘固劑0.45um 孔過濾器顯微鏡器材和濾光器顯微鏡 : 需要epi- 照明熒光顯微鏡觀察熒光 ,應(yīng)該檢查以確定正確操作一臺(tái)顯微鏡判斷適合的普通DNA 染色，如 DAPI propidium lodide, and 阿的平可能不適合FISH , 應(yīng)該常規(guī)顯微鏡清潔和制造商的技術(shù)顧問做定期的調(diào)整。注意: 通常 ,推測(cè)的試劑失敗在一次原位試驗(yàn)中可能實(shí)際為熒光顯微鏡功能失?；蛭催_(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)或者是應(yīng)用了不正確的濾光器設(shè)置去看一個(gè)成功的雜交試驗(yàn)。 激發(fā)光源: 激發(fā)燈是激發(fā)熒光團(tuán)為熒光的光源. 除非激發(fā)燈正確排列，否則最適宜的圖象不會(huì)產(chǎn)生。對(duì)于CEP and LSI探針100瓦的水銀燈是建議的激發(fā)光源. 燈的建議最長(zhǎng)使用時(shí)間是200小時(shí)。記錄燈泡的使用小時(shí)數(shù)，在超過額定的小時(shí)數(shù)以前更換。 物鏡: 物鏡的選擇在亮度、分辨度、圖象的綜合質(zhì)量上有很大的影響， 當(dāng)使用100瓦的水銀燈去看CEP 測(cè)定結(jié)果時(shí)，使用油浸熒光物鏡和數(shù)字光圈0.75。一個(gè)40x物鏡與10x目鏡結(jié)合，適合瀏覽（細(xì)看）及常規(guī)的FISH分析。當(dāng)需要高度擴(kuò)大倍率時(shí)，63x或100x油浸achromat （色盲患者）型物鏡能取得很好的效果。浸油：用于油浸目鏡的浸油應(yīng)該表明用于低自動(dòng)熒光尤其用于熒光顯微鏡。 濾光器 多波段和單波段熒光顯微鏡濾光器，（最適于該試劑盒）可在公司購(gòu)得。可用于大多數(shù)型號(hào)顯微鏡。CEP X/Y 和 LSI 21, 綠色和三波段 DAPI/Green/Orange 濾光器均可購(gòu)于公司. 橘黃光信號(hào)將發(fā)粉橘色，綠光信號(hào)將發(fā)黃綠色，所有其他DNA經(jīng)DAPI染色將發(fā)藍(lán)色熒光 。所用試劑的準(zhǔn)備20x SSC制備PH 5.3的20x SSC66g 20Xssc200ml 純凈水共250ml徹底混合,在室溫下用PH meter 測(cè)PH ,必要時(shí)用濃鹽酸調(diào)整PH值到5.3,總?cè)萘吭?50ml,用0.45um 濾紙(filter) ,儲(chǔ)存在有該容器中在室溫下最多6個(gè)月.變性溶液70% 甲酰胺 in 2x SSC PH7.0-8.0,49ml 甲酰胺7ml 20X SSC PH5.314ml 純凈水總?cè)萘?70ml充分混勻,放在玻璃coplin 缸中,在室溫下用帶有玻璃PH電極的PH 計(jì)測(cè)PH確保PH 在7.0-8.0之間.在2-8攝氏度儲(chǔ)存在有蓋容器內(nèi),在一周內(nèi)使用.每次用前檢查PH酒精洗滌溶液用100%酒精和純凈水,配制稀釋液(v/v)70%,85%,100%三種濃度.儲(chǔ)存在室溫下蓋緊.稀釋溶液可于一周內(nèi)使用,除非蒸發(fā)或者由于過度使用而稀釋.注意:需要額外的試劑處理標(biāo)本和玻片制備過程,詳情參見特殊程序部分.0.4X SSC/0.3NP-40洗滌溶液950ml 純凈水20ml 20xSSC PH5.33ml NP-40總?cè)萘?1000 ml 徹底混勻，必要時(shí)用1N NaOH 調(diào)PH至7.0-7.5，用帶有玻璃PH電極的PH 計(jì)測(cè)PH。用純水調(diào)中容量到1升，用0.45um孔的過濾器過濾，儲(chǔ)存未用的溶液在有蓋容器內(nèi)在室溫下可用6個(gè)月。每天結(jié)束試驗(yàn)后丟棄用過的溶液0.1NP-40 in 2x SSC100ml 20 SSC PH 5.3849ml 純水1ml NP-40總?cè)萘?000ml徹底混勻，必要時(shí)用1N NaOH 調(diào)PH至7.0-7.5，用帶有玻璃PH電極的PH 計(jì)測(cè)PH。用純水調(diào)中容量到1升，用0.45um孔的過濾器過濾，加70ml到copplin 缸中保持在室溫。存儲(chǔ)未用的溶液在有蓋容器內(nèi)，室溫下可用6個(gè)月，每天結(jié)束試驗(yàn)后丟棄用過的溶液。警告及注意事項(xiàng)1. 用于in vitro 診斷2. 探針對(duì)照玻片取自認(rèn)培養(yǎng)羊水細(xì)胞已經(jīng)被固定多次在75甲醇/25醋酸中。因?yàn)椴豢赡苤滥囊徊奖晃廴?，所有人的?biāo)本和對(duì)照玻片都應(yīng)該小心處理， 標(biāo)本處理原則可由美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心獲得。3. 由于使用vysis公司提供或建議以外的試劑。雜交條件可能被顛倒。4. 如果在玻片的變性，雜交，和信號(hào)點(diǎn)計(jì)過程不遵守所有的程序，可能引起不可接受的或者錯(cuò)誤的結(jié)果。5. DAP2 復(fù)染劑包含DAPI 和 1，4苯二胺自由基DAPI 是一種誘變劑在positive genotoxic 效應(yīng)的基礎(chǔ)上，避免吸入，攝入或接觸皮膚。1，4苯二胺 是一種皮膚和呼吸致敏物，避免吸入，攝入或接觸皮膚。詳情參見MSDS 。6. 暴露于光下，熒光團(tuán)容易photobleached，為限制這種降解，在減弱的光下處理所有包含熒光團(tuán)的溶液，包括處理玻片雜交的所有步驟， 進(jìn)行所有不需要光的操作步驟（保溫階段，洗滌等）在減弱的光下，避免直接的光照在熒光團(tuán)上。詳情參見MSDS7. 探針混合物包含甲酰胺，致畸物。避免接觸皮膚和粘膜，詳情參見MSDS8. 強(qiáng)烈建議用校準(zhǔn)的溫度計(jì)，測(cè)量溶液的溫度，水浴，和恒溫箱因?yàn)檫@對(duì)產(chǎn)品發(fā)揮最好的效能很重要9. 根據(jù)你單位關(guān)于有害物降解的原則降解所有有害材料 。標(biāo)本采集，處理，儲(chǔ)存，和玻片標(biāo)本采集和處理由未經(jīng)培養(yǎng)的羊水制備玻片標(biāo)本 1 離心2-5ml 整個(gè)羊水（AF）樣本，1000轉(zhuǎn)5分鐘。羊水樣本不應(yīng)該表現(xiàn)為血性或者褐色2. 在2-5ml 1x 胰蛋白酶/EDTA 中，混懸細(xì)胞團(tuán)在37攝氏度水浴至少15分鐘。3. 離心懸液1000 轉(zhuǎn) 5分鐘4. 在2-5ml 0.56 氯化鉀中混懸細(xì)胞團(tuán)，37攝氏度水浴20分鐘5.加0.8-2ml 固定液（3：1甲醇：冰醋酸）6.離心懸液1000轉(zhuǎn)5分鐘， 在1ml 新鮮的固定劑混懸細(xì)胞團(tuán)。儲(chǔ)存固定的標(biāo)本在4攝氏度至少30分鐘，或者直到進(jìn)行FISH長(zhǎng)期儲(chǔ)存，在固定液中存放在-20攝氏度7在把細(xì)胞放在玻片上之前，調(diào)整細(xì)胞懸液的容量，根據(jù)細(xì)胞團(tuán)的大小，必要時(shí)，尤其實(shí)儲(chǔ)存了很長(zhǎng)時(shí)間下（大于1個(gè)月），在制備玻片前用 固定液洗滌細(xì)胞團(tuán)。8.制備FISH用的玻片，直接滴細(xì)胞懸液到1或2張冷的玻片上制作兩個(gè)雜交區(qū)，（每個(gè)區(qū)15-20ul細(xì)胞團(tuán)） 試驗(yàn)程序熒光原位雜交程序摘要標(biāo)本DNA變性1. 濕化雜交室（一個(gè)帶一張濕吸墨紙的 密封容器 或者紙巾大約1*3英寸。貼在容器的側(cè)壁），預(yù)熱37度，通過把它放在37度恒溫箱中 ，在玻片制備前2. 加變性溶液到coplin缸中，方在73加減1度水浴中至少30分鐘，在使用前查看溶液溫度3. 每次用前校驗(yàn)變性溶液的PH在7.0-8.0，通過把制備好的玻片浸在變性溶液中在73加減1度5分鐘，使標(biāo)本DNA變性，不要變性超過每次每缸4片玻片。4. 用鉗子，從變性溶液中拿出玻片，立即放進(jìn)70酒精洗滌溶液中，在室溫。搖動(dòng)玻片使除掉甲酰胺，允許玻片立在酒精洗液中1分鐘5. 從70酒精中拿出玻片，用85和100酒精重復(fù)步驟46. drain 多余的酒精從玻片上，用玻片底邊接觸一個(gè)吸墨水紙用實(shí)驗(yàn)室wipe擦干底面7. 在準(zhǔn)備好加探針溶液以前將玻片放在45-50度玻片加熱裝置，不超過2分鐘，注意：如果在探針還沒有準(zhǔn)備好，而玻片已經(jīng)超過2分鐘預(yù)熱，玻片應(yīng)該繼續(xù)在100酒精中。在加熱以前不要讓空氣吹干玻片。探針制備1. 允許探針在室溫加熱，因而降低粘度從而精確的吸取2. 渦流混合，短暫旋轉(zhuǎn)試管（1-3秒），在微離心機(jī)中讓內(nèi)容物到達(dá)試管底部，再次輕輕渦流混合。注意：探針已經(jīng)過預(yù)變性，適合加入到變性的玻片上的目標(biāo)區(qū)， 雜交1. 加入10ulCEP X/Y 探針混合到玻片上的雜交區(qū)，10ul LSI 21 探針混合到玻片的另一個(gè)雜交區(qū)，立即放一個(gè)22mm*22mm的蓋玻片在探針溶液上使溶液均勻散布在蓋玻片下，避免氣泡，否則會(huì)影響雜交。注意：在房蓋玻片前不要吸取探針溶液在多目標(biāo)區(qū)上，2. 用稀釋的橡膠膠水密封蓋玻片：擠橡膠膠水于一個(gè)5ml 注射器，擠少量膠水在蓋玻片外圍，覆蓋蓋玻片和玻片，在蓋玻片周圍形成密封。3. 將玻片放在預(yù)熱的雜交室內(nèi)并蓋緊蓋子，37度恒溫6-24小時(shí)。雜交后洗滌1. 加入0.4X SSC /0.3NP-40到coplin 缸，將缸放在73加減1度的水浴中至少30分鐘預(yù)熱溶液或者直到溶液溫度達(dá)到73加減1度。在每洗一批前，洗滌溶液的溫度必須恢復(fù)到73加減1度，2. 加2X SSC /0.1%NP-40到第二個(gè)coplin 缸中，放在室溫下，每天用完后丟棄兩缸溶液。3. 去掉橡膠膠水密封和蓋玻片，立即將玻片放在盛有0.4x SSC /0.3NP-40在73加減1度，。擺動(dòng)玻片大約3秒，重復(fù)其他的玻片，然后恒溫2分鐘。每次洗滌不要超過4個(gè)玻片，。如果超過4個(gè)玻片，每次使用前校驗(yàn)溶液溫度在73加減1度。注意：在把