進化樹構建.doc

分子進化樹構建及數據分析的簡介mediocrebeing, rodger, lylover lylover. Email: lylover_2005, klaus, oldfish, yzwpf一、引言開始動筆寫這篇短文之前，我問自己，為什么要寫這樣的文章？寫這樣的文章有實際的意義嗎？我希望能夠解決什么樣的問題？帶著這樣的疑惑，我隨手在丁香園（DXY）上以關鍵字“進化 分析 求助”進行了搜索，居然有289篇相關的帖子（2006年9月12日）。而以關鍵字“進化 分析”和“進化”為關鍵字搜索，分別找到2,733和7,724篇相關的帖子?？紤]到有些帖子的內容與分子進化無關，這里我保守的估計，大約有3,0004,000篇帖子的內容，是關于分子進化的。粗略地歸納一下，我大致將提出的問題分為下述的幾類：1涉及基本概念。例如，“分子進化與生物進化是不是一個概念”，“關于微衛(wèi)星進化模型有沒有什么新的進展”以及“關于Kruglyak的模型有沒有改進的出現”，等等。2關于構建進化樹的方法的選擇。例如，“用boostrap NJ得到XX圖，請問該怎樣理解？能否應用于文章？用boostrap test中的ME法得到的是XXX樹，請問與上個樹比，哪個更好”，等等。3關于軟件的選擇。例如，“想做一個進化樹，不知道什么軟件能更好的使用且可以說明問題，并且有沒有說明如何做”，“拿到了16sr RNA數據，打算做一個系統進化樹分析，可是原來沒有做過這方面的工作啊，都要什么軟件”，“請問各位高手用clustalx做出來的進化樹與phylip做的有什么區(qū)別”，“請問有做過進化樹分析的朋友，能不能提供一下，做樹的時候參數的設置，以及代表的意思。還有各個分支等數值的意思，說明的問題等”，等等。4蛋白家族的分類問題。例如，“搜集所有的關于一個特定domain的序列，共141條，做的進化樹不知具體怎么分析”，等等。5新基因功能的推斷。例如，“根據一個新基因A氨基酸序列構建的系統發(fā)生樹，這個進化樹能否說明這個新基因A和B同源，屬于同一基因家族”，等等。6計算基因分化的年代。例如，“想在基因組水平比較兩個或三個比較接近物種之間的進化年代的遠近，具體推算出他們之間的分歧時間”，“如何估計病毒進化中變異所需時間”，等等。7進化樹的編輯。例如生成的進化樹圖片，如何進行后續(xù)的編輯，比如希望在圖片上標注某些特定的內容，等等。由于相關的帖子太多，作者在這里對無法閱讀全部的相關內容而致以歉意。同時，作者歸納的這七個問題也并不完全代表所有的提問。對于問題1所涉及到的基本的概念，作者推薦讀者可參考由Masatoshi Nei與Sudhir Kumar所撰寫的分子進化與系統發(fā)育（Molecular Evolution and Phylogenetics）一書，以及相關的分子進化方面的最新文獻。對于問題7，作者之一lylover一般使用Powerpoint進行編輯，而Photoshop、Illustrator及Windows自帶的畫圖工具等都可以使用。這里，作者在這里對問題2-6進行簡要地解釋和討論，并希望能夠初步地解答初學者的一些疑問。二、方法的選擇首先是方法的選擇?；诰嚯x的方法有UPGMA、ME（Minimum Evolution，最小進化法）和NJ（Neighbor-Joining，鄰接法）等。其他的幾種方法包括MP（Maximum parsimony，最大簡約法）、ML（Maximum likelihood，最大似然法）以及貝葉斯（Bayesian）推斷等方法。其中UPGMA法已經較少使用。一般來講，如果模型合適，ML的效果較好。對近緣序列，有人喜歡MP，因為用的假設最少。MP一般不用在遠緣序列上，這時一般用NJ或ML。對相似度很低的序列，NJ往往出現Long-branch attraction（LBA，長枝吸引現象），有時嚴重干擾進化樹的構建。貝葉斯的方法則太慢。對于各種方法構建分子進化樹的準確性，一篇綜述（Hall BG. Mol Biol Evol 2005, 22(3):792-802）認為貝葉斯的方法最好，其次是ML，然后是MP。其實如果序列的相似性較高，各種方法都會得到不錯的結果，模型間的差別也不大。對于NJ和ML，是需要選擇模型的。對于各種模型之間的理論上的區(qū)別，這里不作深入的探討，可以參看Nei的書。對于蛋白質序列以及DNA序列，兩者模型的選擇是不同的。以作者的經驗來說，對于蛋白質的序列，一般選擇Poisson Correction（泊松修正）這一模型。而對于核酸序列，一般選擇Kimura 2-parameter（Kimura-2參數）模型。如果對各種模型的理解并不深入，作者并不推薦初學者使用其他復雜的模型。Bootstrap幾乎是一個必須的選項。一般Bootstrap的值70，則認為構建的進化樹較為可靠。如果Bootstrap的值太低，則有可能進化樹的拓撲結構有錯誤，進化樹是不可靠的。對于進化樹的構建，如果對理論的了解并不深入，作者推薦使用缺省的參數。需要選擇模型的時候（例如用NJ或者ML建樹），對于蛋白序列使用Poisson Correction模型，對于核酸序列使用Kimura-2參數模型。另外需要做Bootstrap檢驗，當Bootstrap值過低時，所構建的進化樹其拓撲結構可能存在問題。并且，一般推薦用兩種不同的方法構建進化樹，如果所得到的進化樹類似，則結果較為可靠。 三、軟件的選擇表1中列出了一些與構建分子進化樹相關的軟件。構建NJ樹，可以用PHYLIP（寫得有點問題，例如比較慢，并且Bootstrap檢驗不方便）或者MEGA。MEGA是Nei開發(fā)的方法并設計的圖形化的軟件，使用非常方便。作者推薦MEGA軟件為初學者的首選。雖然多雪列比對工具ClustalW/X自帶了一個NJ的建樹程序，但是該程序只有p-distance模型，而且構建的樹不夠準確，一般不用來構建進化樹。構建MP樹，最好的工具是PAUP，但該程序屬于商業(yè)軟件，并不對學術免費。因此，作者并不建議使用PAUP。而MEGA和PHYLIP也可以用來構建進化樹。這里，作者推薦使用MEGA來構建MP樹。理由是，MEGA是圖形化的軟件，使用方便，而PHYLIP則是命令行格式的軟件，使用較為繁瑣。對于近緣序列的進化樹構建，MP方法幾乎是最好的。構建ML樹可以使用PHYML，速度最快?；蛘呤褂肨ree-puzzle，速度也較快，并且該程序做蛋白質序列的進化樹效果比較好。而PAML則并不適合構建進化樹。ML的模型選擇是看構出的樹的likelihood值，從參數少，簡單的模型試起，到likelihood值最大為止。ML也可以使用PAUP或者PHYLIP來構建。這里作者推薦的工具是BioEdit。BioEdit集成了一些PHYLIP的程序，用來構建進化樹。Tree-puzzle是另外一個不錯的選擇，不過該程序是命令行格式的，需要學習DOS命令。PHYML的不足之處是沒有win32的版本，只有適用于64位的版本，因此不推薦使用。值得注意的是，構建ML樹，不需要事先的多序列比對，而直接使用FASTA格式的序列即可。貝葉斯的算法以MrBayes為代表，不過速度較慢。一般的進化樹分析中較少應用。由于該方法需要很多背景的知識，這里不作介紹。 表1 構建分子進化樹相關的軟件軟件網址說明ClustalXhttp:/bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/圖形化的多序列比對工具ClustalWhttp:/www.cf.ac.uk/biosi/research/biosoft/Downloads/clustalw.html命令行格式的多序列比對工具GeneDoc/biomed/genedoc/多序列比對結果的美化工具BioEdit/BioEdit/bioedit.html序列分析的綜合工具MEGA/圖形化、集成的進化分析工具，不包括MLPAUP/商業(yè)軟件，集成的進化分析工具PHYLIP/phylip.html免費的、集成的進化分析工具PHYMLhttp:/atgc.lirmm.fr/phyml/最快的ML建樹工具PAMLhttp:/abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.htmlML建樹工具Tree-puzzlehttp:/www.tree-puzzle.de/較快的ML建樹工具MrBayes/基于貝葉斯方法的建樹工具MAC5/software/mac5/基于貝葉斯方法的建樹工具TreeViewhttp:/taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html進化樹顯示工具需要注意的幾個問題是，其一，如果對核酸序列進行分析，并且是CDS編碼區(qū)的核酸序列，一般需要將核酸序列分別先翻譯成氨基酸序列，進行比對，然后再對應到核酸序列上。這一流程可以通過MEGA 3.0以后的版本實現。MEGA3現在允許兩條核苷酸，先翻成蛋白序列比對之后再倒回去，做后續(xù)計算。其二，無論是核酸序列還是蛋白序列，一般應當先做成FASTA格式。FASTA格式的序列，第一行由符號“”開頭，后面跟著序列的名稱，可以自定義，例如user1，protein1等等。將所有的FASTA格式的序列存放在同一個文件中。文件的編輯可用Windows自帶的記事本工具，或者EditPlus（google搜索可得）來操作。文件格式如圖1所示：圖1 FASTA格式的序列另外，構建NJ或者MP樹需要先將序列做多序列比對的處理。作者推薦使用ClustalX進行多序列比對的分析。多序列比對的結果有時需要后續(xù)處理并應用于文章中，這里作者推薦使用GeneDoc工具。而構建ML樹則不需要預先的多序列比對。因此，作者推薦的軟件組合為：MEGA 3.1 + ClustalX + GeneDoc + BioEdit。四、數據分析及結果推斷一般碰到的幾類問題是，（1）推斷基因/蛋白的功能；（2）基因/蛋白家族分類；（3）計算基因分化的年代。關于這方面的文獻非常多，這里作者僅做簡要的介紹。推斷基因/蛋白的功能，一般先用BLAST工具搜索同一物種中與不同物種的同源序列，這包括直向同源物（ortholog）和旁系同源物（paralog）。如何界定這兩種同源物，網上有很多詳細的介紹，這里不作討論。然后得到這些同源物的序列，做成FASTA格式的文件。一般通過NJ構建進化樹，并且進行Bootstrap分析所得到的結果已足夠。如果序列近緣，可以再使用MP構建進化樹，進行比較。如果序列較遠源，則可以做ML樹比較。使用兩種方法得到的樹，如果差別不大，并且Bootstrap總體較高，則得到的進化樹較為可靠?；?蛋白家族分類。這方面可以細分為兩個問題。一是對一個大的家族進行分類，另一個就是將特定的一個或多個基因/蛋白定位到已知的大的家族上，看看屬于哪個亞家族。例如，對驅動蛋白（kinesin）超家族進行分類，屬于第一個問題。而假如得到一個新的驅動蛋白的序列，想分析該序列究竟屬于驅動蛋白超家族的14個亞家族中的哪一個，則屬于后一個問題。這里，一般不推薦使用MP的方法。大多數的基因/蛋白家族起源較早，序列分化程度較大，相互之間較為遠源。這里一般使用NJ、ME或者ML的方法。計算基因分化的年代。這個一般需要知道物種的核苷酸替代率。常見物種的核苷酸替代率需要查找相關的文獻。這里不作過多的介紹。一般對于這樣的問題，序列多數是近緣的，選擇NJ或者MP即可。如果使用MEGA進行分析，選項中有一項是“Gaps/Missing Data”，一般選擇“Pairwise Deletion”。其他多數的選項保持缺省的參數。五、總結 在實用