氯化膽堿基礎知識.ppt

飼料添加劑氯化膽堿中氯化膽堿的測定方法 潘翔動物營養(yǎng)碩士技術(shù)支持經(jīng)理宜興阿克蘇諾貝爾三元化學有限公司上海辦事處 飼料添加劑氯化膽堿中氯化膽堿的測定 氯化膽堿的作用及其在飼料工業(yè)中的應用摻假向含量測定方法提出挑戰(zhàn)新方法的宗旨 目標 方法的選擇和必需解決的關鍵技術(shù)研究與測定條件 實驗參數(shù)的確定方法的性能檢驗結(jié)論 氯化膽堿的重要作用 氯化膽堿 cholinechloride 化學名稱 2 羥乙基 三甲胺鹽酸鹽CH3 HOCH2CH2NCH3 ClCH3根據(jù)歐盟動物添加劑標準修訂版91 924 EEC 膽堿被列為維生素類化合物 B4 在動物體內(nèi) 以多種形式起著極其重要的作用 構(gòu)成卵磷脂和鞘磷脂 構(gòu)成體內(nèi)磷脂的70 80 乙酰膽堿的主要成分 在建立和維持細胞膜結(jié)構(gòu) 促進脂肪代謝 預防脂肪肝 以及大腦和神經(jīng)組織脈沖傳導中起著重要作用 同時作為重要的甲基供體 可促進蛋氨酸轉(zhuǎn)化 機體代謝和動物生長 對于幼小動物尤為重要 天然飼料組分含有一定量的膽堿 但不能滿足動物迅速生長的需要 缺乏氯化膽堿對動物生長的影響 家禽 生長滯緩蛋質(zhì)量 大小變差孵化率下降禽骨畸形肝腎脂肪堆積 變性行為異常營養(yǎng)不良豬 生長滯緩神經(jīng) 行為異常脂肪肝繁殖力下降營養(yǎng)不良 牛 生長滯緩行為異常食欲下降小牛呼吸障礙魚 生長滯緩其他動物 貓 狗和其他皮毛動物 生長滯緩行為異常皮毛色質(zhì)變差 氯化膽堿在飼料工業(yè)中的應用 氯化膽堿已成為最直接 最經(jīng)濟的補充膽堿的方式 目前已用于各種飼養(yǎng)動物 而且其用量比任何維生素都大 每年世界生產(chǎn)20萬噸 90 用做飼料添加劑 隨著動物生產(chǎn)的集約化 需求增長大大大于其他維生素 飼料級氯化膽堿質(zhì)量標準 飼料級氯化膽堿的種類氯化膽堿水劑 70 75 氯化膽堿粉劑 水劑 賦形劑 玉米芯粉 脫脂米糠 麩皮 稻殼粉和無水硅酸等 50 60 質(zhì)量標準 HG2941 1999 摻假行為向原國標檢測方法提出挑戰(zhàn) HG2941 1999質(zhì)量要求水劑 7項 含量 PH 乙二醇 總游離氨 灰份 重金屬 粉劑 3項 含量 水分 細度 含量測定方法高氯酸非水滴定法銀量法基于氯化膽堿中的CL 并非基于氯化膽堿的特異結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) 許多廉價無機氯化物和有機鹽酸鹽如NaCl NH4Cl 三甲胺氯化物等均可參與和干擾測定 目前摻假現(xiàn)象泛濫的一個重要原因就是利用了現(xiàn)行標準的這一先天缺陷 同時由于粉劑氯化膽堿質(zhì)量標準的規(guī)定項目過少 更是成了摻假行為的重災區(qū) 其他方法及應對措施 四苯硼鈉法 歐洲應用較多四苯硼鈉法基于有機胺的特性 但易受多種一價陽離子 特別是K NH4 等的干擾 如以此法做標準 易步現(xiàn)行標準的后塵 GB T17481 1998預混料中氯化膽堿的測定雷氏鹽法是反應基于有機胺的特性 常見干擾離子少 但比色法很靈敏 測定大含量樣品時變異大 精度差 數(shù)法并用檢測非水滴定法 銀量法 定氮法 K氏定氮 直接堿蒸餾 各方法的結(jié)果不同說明產(chǎn)品可能摻假 然后用四氯化碳浮選法識別可能的摻雜物 這樣做十分煩瑣 有的方法存在原理上的問題 無法得到準確的結(jié)果和結(jié)論 新方法的宗旨 目標和必需解決的關鍵技術(shù) 宗旨 目標 研制一種能消除當前常見摻假物的影響準確測定氯化膽堿含量 同時又適用于基層簡易實驗室的常規(guī)方法 研制一種更為科學嚴謹?shù)目梢苑婪犊赡艹霈F(xiàn)的其他摻假行為的仲裁方法 方法選擇及需解決的關鍵技術(shù) 常規(guī)法 擬選雷氏鹽法 雷氏鹽反應被認為是氯化膽堿的特異反應 干擾少 美國飼料工業(yè)協(xié)會 NFIA 即用此法測定植物載體粉劑和預混料中的氯化膽堿 但并非全無干擾 有些有機胺 如三甲胺等 有類似的反應 必須在沉淀前予以消除 同時要尋找適當途徑克服比色法的缺點 仲裁法 擬選色譜法 根據(jù)氯化膽堿的結(jié)構(gòu)特點 選擇適宜的色譜類型 柱 色譜條件和檢測方式 雷氏鹽重量法的研究 測定條件確定1粉劑產(chǎn)品氯化膽堿的提取提取劑和不同溫度下的提取效率2可能干擾物 有機胺 的排除a 加堿煮沸效果b 加堿量c 煮沸時間3雷氏鹽沉淀a pHb 沉淀劑用量 見圖1c 雷氏鹽沉淀的熱穩(wěn)定性 粉劑產(chǎn)品氯化膽堿的提取 提取劑 氯化膽堿屬離子型化合物 水提取溫度表1不同溫度的提取效果 提取方式溫度 提取效率 振蕩室溫98 5加熱振蕩5099 2加熱振蕩70 80100 考慮粉劑載體中均含有一定量的淀粉 其在80 糊化 影響以后的過濾和測定 故溫度定為70 3 2 1可能干擾物的排除 a 加堿煮沸的效果雷氏鹽與一般的一價陽離子不反應 但可能與有機胺 特別是三甲胺反應生成類似的紅色沉淀 我們翻閱了有關資料發(fā)現(xiàn)氯化膽堿作為四級胺它與伯 仲 叔胺的重要區(qū)別在于加堿煮沸后 不能變?yōu)榘睔庖绯?我們在實驗室找了三甲胺 三乙胺 乙醇胺 鹽酸羥胺 苯胺等一些可能與雷氏鹽生成沉淀的有機胺 作了實際驗證 即加堿煮沸一定時間后 用離子色譜和雷氏鹽試劑檢測 證明再無有機胺存在 2 2可能干擾物的排除條件 b 加堿量 從含有0 3000g氯化膽堿和約0 20三甲胺的100mL水溶液中 吸取10 00mL于150mL高腳燒杯中 分別加40 NaOH溶液2 3 4 5mL 邊煮沸 邊用pH試紙測定 直至無NH3溢出 然后以雷氏鹽法測定氯化膽堿的回收率 證明2 5mL回收率無差異 c 煮沸時間 用同樣的方法測定加堿5mL 煮沸3 5 7min的效果 證明去胺效果與測得的氯化膽堿回收率也無差異 為留有一定的保險系數(shù)我們將條件定為 加40 NaOH溶液3mL 煮沸5min 3雷氏鹽沉淀 條件pH 我們分別用上述水溶液和以玉米芯為載體的 含有對應量氯化膽堿和三甲胺的樣品提取液加堿3mL 煮沸5min 然后分別將溶液pH調(diào)至3 4 5 6 6 7和8 9 證明溶液調(diào)至pH8 9易產(chǎn)生絮狀沉淀 雷氏鹽沉淀后結(jié)果偏高 而調(diào)至3 4結(jié)果又有偏低的傾向 故認為將pH調(diào)至6左右較合適 沉淀劑用量 我們以操作條件下可能出現(xiàn)的最大氯化膽堿量 0 06g 為前提 分別加入不同體積的2 m v 的雷氏鹽溶液觀察沉淀量結(jié)果見圖1 圖1沉淀劑的用量 3雷氏鹽沉淀 沉淀的熱穩(wěn)定性 我們考察了裝有反應沉淀物坩堝濾器在105 不同烘干時間的質(zhì)量變化 發(fā)現(xiàn)烘干2h后即可從沉淀量計算得到化學計量的氯化膽堿含量 而且烘干16h和2h后 沉淀的質(zhì)量差異均在0 0005g以內(nèi) 說明在該溫度下 氯化膽堿的雷氏鹽沉淀物有很好的熱穩(wěn)定性 為雷氏鹽重量法測定氯化膽堿建立了重要理論支持 方法確定的操作程序 稱取經(jīng)105 干燥至衡重的試樣1g 精確0 0002g 置于100mL容量瓶中 水約70mL 70 水浴中加熱15min 震蕩10min 用水定容 過濾 吸取10 00mL至150mL高腳燒杯中 40 的NaOH溶液3mL 搖勻 蓋一倒置的漏斗 電爐上加熱 并煮沸5min 冷卻 加酸調(diào)節(jié)溶液pH5 6 移入冰水浴冷卻至5 以下 2 雷氏鹽甲醇溶液15mL 不時攪拌 反應30min 靜置陳化1h 將沉淀定量轉(zhuǎn)移到已在105 烘至衡重并稱量過的G4砂芯漏斗中 減壓抽濾 用水洗滌燒杯和沉淀3 4次 105 烘干2h 稱重 結(jié)果的計算 m2 m1氯化膽堿 10 0 33045m0式中 m0 試樣質(zhì)量 gm1 空砂芯漏斗質(zhì)量 gm2 沉淀 砂芯漏斗的質(zhì)量 g10 稀釋倍數(shù)0 33045 換算系數(shù) 139 63 422 55 方法的性能檢驗 方法的準確度與精密度線性檢驗結(jié)果見表 添加回收率結(jié)果與變異系數(shù)見表 與現(xiàn)行國標比較 方法的優(yōu)越性與HG標準的比較 摻假樣品的鑒別見表7與GB T雷氏鹽比色法比較 好的精密度見表8方法的適用性不同劑型 不同賦形劑與不同添加量氯化膽堿的添加回收率及測定的變異系數(shù) 見表4 5實驗室間比對 見表6不同烘干溫度測定結(jié)果比較 烘干變黑仍可準確測定 見表9 表2雷氏鹽重量法的線性檢驗 氯化膽堿加量三甲胺加量測得氯化膽堿含量 050010409 93203021 12302030 14401041 7750051 29y 0 077 1 0314x r 0 9996 表3回收率 精密度測定結(jié)果 1 劑型添加量測定值相對偏差回收率 載體 5050 260 16100 5粉劑5050 230 19100 5 玉5051 090 67102 2米5050 290 13100 6芯 5050 230 19100 5 平均值 50 42變異系數(shù)CV 0 74 同上3029 85 n 5 cv 2 0299 5109 93 n 7 cv 6 299 3 表4回收率 精密度測定結(jié)果 劑型添加量測定值相對偏差回收率 載體 水劑7574 620 5199 57574 780 2899 77574 320 9199 17069 790 3099 77069 440 8099 27069 720 4099 6 平均值 0 5399 5CV 1 0 表5回收率 精密度測定結(jié)果 3 氯化膽堿在不同載體市售產(chǎn)品中的添加回收率 粉劑氯化膽堿測定次數(shù)測定值回收率CV載體總量 n 稻殼粉60459 5899 30 62麥麩50550 021001 2無水硅酸50550 44100 90 74 表6實驗室間比對試驗 氯化膽堿在不同載體市售產(chǎn)品中的添加回收率室間比對 粉劑氯化膽堿測定值回收率CV 載體總量121212 稻殼粉61 8061 1861 7699 099 91 30 7麥麩60 6861 0461 221001010 460 71無水硅酸59 3459 6359 961001010 410 65 表7雷氏鹽重量法和高氯酸非水滴定法的比較 樣品編號雷氏鹽重量法色譜法高氯酸非水滴定法161 3762 1961 92250 8850 6750 83350 8450 7950 06450 8150 52 550 6649 2552 28645 9146 1652 63746 1244 7749 64811 6911 8450 0599 008 8855 26108 748 3752 98110067 71120023 6 表8雷氏鹽重量法和雷氏鹽比色法的比較 重復次數(shù)重量法比色法 測定次數(shù)雷氏鹽重量法雷氏鹽比色法 50 2645 77 50 2351 41 51 0948 40 50 2351 78 50 2952 96平均值50 4250 06平均回收率 100 8100 1CV 0 745 85 表9不同烘干條件的氯化膽堿的測定 樣品烘干溫度和時間測定結(jié)果 50 1105 2h49 6180 4h49 572105 2h50 1980 4h50 303105 2h52 5780 4h52 36 小結(jié) 本標準法干擾小 可識別摻假樣品 方法有很好的準確度與精密度 方法適用于測定不同劑型和不同賦形劑的產(chǎn)品 不受烘干溫度的影響 方法簡便易行 不需特殊分析儀器 普通飼料廠均可自己控制氯化膽堿的質(zhì)量 色譜法 色譜硬件的選擇氯化膽堿屬離子型化合物 在常用的HPLC柱上不保留分子中無任何發(fā)色團 不能用分光光度法檢測選擇陽離子交換柱 電導檢測器 降低本底加抑制器 色譜條件的確定色譜柱 4mm 250mm 裝有羧基 磷酸基弱酸陽離子交換樹脂 粒徑8 5 m柱溫 30 流動相 17 5mmol LH2SO4水溶液流速 1mL min檢測器 具抑制器的電導檢測器 氯化膽堿 三甲胺鹽酸鹽和六種常見陽離子標準色譜圖 色譜法性能檢驗 線性 編號玉米芯氯化膽堿上機濃度響應ggmg L s min00 5000010 450 0520 075330 350 1560 239350 250 25100 402070 500 30160 685380 500 40200 870290 500 50251 0872100 500 60301 3020y 0 02236 0 04423xr 0 9998 色譜法性能檢驗 準確度 精密度 載體測定次數(shù)添加量回收率CVng 玉米芯50 2599 040 55稻殼60 25100 10 93麩皮50 25101 11 25硅膠50 20102 40 81 一些實際樣品的測定結(jié)果 不同方法測定的12個樣品結(jié)果見前表7幾種典型粉狀樣品的色譜圖1 5 樣品三種方法結(jié)果基本吻合 氯化膽堿均約61 62 色譜圖上雜峰少而小 6 10 樣品中有氯化膽堿 但離子色譜和雷氏鹽法大大低于高氯酸非水滴定的結(jié)果 如8 Su04前兩者測定值11 7 而后者50 色譜圖上可見 有大的Na 峰和小的三甲胺峰 11 12 樣品中Na NH4 K 三甲胺 Ca 2 Mg 2應有盡有 唯獨沒有氯化膽堿 1 樣品 Hu24 8 粉劑樣品 su04 11 樣品 Su38 來自馬來西亞的驗證 1 樣品雷氏鹽重量法色譜法非水滴定法 151 350 852 2246 944 449 2316 913 452 245 86 056 856 95 854 7624 524 058 4評論 雷氏鹽重量法是一種非常適合的測定方法 它對膽堿的選擇性高 足以鑒別產(chǎn)品的真假 優(yōu)劣 方法重現(xiàn)性高 精密度好 來自馬來西亞的驗證 2 樣品色譜法NaNH4KTMACaMg mg kg150 850 1760370600180 0 03 0 6 0 06 0 4 0 21 244 4 17135 285 4 0 0 3 313 4540028800270022000650147 3 3 22 3 1 0 5 1 0 4 0 2 46 0480001002800 170006500 29 1 0 1 1 0 11 9 7 5 55 816900 750073000700 10 3 1 7 51 5