高致病性禽流感血凝(HA).ppt

高致病性禽流感血凝 HA 和血凝抑制試驗 HI 慶城縣疫病預防控制中心 簡介 禽流感 AD 是有正黏病毒科A型禽流感病毒中有致病性的任何一型毒株引起以禽類為主的烈性傳染病 我國將其列為一類動物疫病 流感病毒顆粒表面的血凝素 HA 蛋白 可以識別并吸附于紅細胞表面受體的結構 出現(xiàn)血凝現(xiàn)象 但是當病毒懸液中加入特異性抗體 且該抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲嘏c紅細胞表面受體相結合 則紅細胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑| 這時紅細胞凝集現(xiàn)象就被抑制 稱為血凝凝集抑制 HI 反應 簡介 血凝實驗 HA 血凝抑制 HI 實驗是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的實驗方法 可用于鑒定所有的流感病毒分離株可用來檢測家禽血清中的感染或免疫抗體本實驗室常采用HA HI實驗檢測禽血清中的免疫抗體 實驗的原理 用途 用已知抗原測抗體 抗體可以抑制抗原凝集紅細胞 用來檢測禽流感疫苗免疫水平 實驗準備工作 試驗用溶液的配制1 雞紅細胞保存液 阿氏Alsevers液 配制阿氏液 Alsever sSolution 是一種紅細胞保存液 含有抗凝劑檸檬酸鈉和細胞需要的養(yǎng)分葡萄糖 葡萄糖 2 05克檸檬酸鈉 0 8克檸檬酸 0 055克氯化鈉 0 42克加蒸餾水至100毫升 加熱溶解后將pH值調到6 1 經過69千帕 15分鐘的高壓滅菌 放置在4 的環(huán)境內 保存?zhèn)溆?阿氏液主要用于保存紅細胞 在4 的環(huán)境下 紅細胞可以保存2周而不改變活性和特性 因此阿氏液用于采血 保存和運送紅細胞進行化驗 2 1 雞紅細胞懸液制備采血用注射器吸取阿氏液1ml 取至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液3 4ml 與等量的阿氏液混勻 裝入離心管中備用 洗滌紅細胞將離心管中的血液經過1500 1800r min離心8分鐘 棄去上清液 在沉淀物中加入本實驗要求的PBS液 輕輕混勻 以均勻沉淀的紅細胞 在經過1500 1800r min離心8分鐘 用吸管移去上清液及沉淀的紅細胞上層的白細胞薄膜 再重復2次以上過程后 4 保存?zhèn)溆?1 雞紅細胞懸液制備用微量移液器取洗滌后的紅細胞沉淀泥0 1ml 加入到9 9ml本實驗要求的PBS液 輕輕混勻 制成1 雞紅細胞懸液 備用 3 pH7 2 0 01mol LPBS的配制a 配制25 PB 稱量2 74g磷酸氫二鈉 Na2HPO412H2O 和0 79g磷酸二氫鈉 NaH2PO42H2O 加蒸餾水至100mL b 配制1 PBS 量取40ml25 PB 加入8 5g氯化鈉 加蒸餾水至1000mL c 用氫氧化鈉或鹽酸調pH至7 2 d 滅菌或過濾 e PBS一經使用 于4 保存不超過3周 PBS對其它酸堿物質具有一定的緩沖能力 維持反應所需的pH 因而比使用生理鹽水的效果好 儀器及診斷液等的準備96孔V型微量血凝集反應板 微量吸液器 混合振蕩器 恒溫培養(yǎng)箱 待檢血清 雞新城疫標準陽性血清和陰性血清 pH7 2 0 01mol LPBS 1 雞紅細胞懸液 稀釋禽流感病毒H5亞型抗原 用注射器吸取本抗原規(guī)定劑量加入PBS液稀釋好備用 稀釋禽流感H5亞型標準陽性血清 用注射器吸取本血清規(guī)定劑量加入PBS液稀釋好備用 待檢血清要新鮮 無雜質 無紅細胞 不腐敗 盛血清的容器要清潔 注意 所有試劑及待檢血清在試驗前必須恢復室溫 且室內溫度保持在 20 25 血凝 HA 試驗 抗原效價的測定在微量反應板的1孔 12孔均加入25ulPBS液 換滴頭 吸取稀釋禽流感病毒H5亞型試驗抗原25ul加入第1孔 吹吸取10 15次混勻 從第1孔吸取25ul病毒抗原液加入到第2孔 吹吸同樣次數(shù)混勻后吸取25ul加入第3孔 如此進行對倍稀釋至第11孔 從第11孔吸取25ul棄之 換滴頭 每孔再加入25ulPBS 每孔均加入25ul1 RBC液 振蕩混勻 在室溫 20 25 靜置40min后觀察結果 結果判定 將板傾斜 觀察紅細胞有無呈淚珠狀流淌 完全血凝 不流淌 的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位 血凝試驗 抗原效價的測定 操作表 抗原效價的測定結果判定 1 紅細胞100 凝集的抗原最高稀釋度為血凝價 2 為100 凝集 為不完全凝集 為不凝集3 上表例抗原血凝為2564 對照孔的紅細胞將成明顯的紐扣狀沉到孔底 抗原回歸試驗 1 4 單位抗原配制血凝價數(shù)除以4 如表一256 4 64 即1毫升 抗原 63毫升 PBS 即成 2 4 單位抗原驗證配制好后和每天應用前都必須對4 單位抗原進行測試驗證 操作按表二進行 3 作兩排孔第1 5孔加PBS液25ul4 第1孔加4 單位抗原液25ul 吹吸10 15次混勻吸取第2孔用同樣次數(shù)吹吸混勻吸取25ul加入到第3孔 如此進行到第5孔棄去25ul 換滴頭 5 每孔再加入25ulPBS 6 每孔均加入25ul1 RBC液 7 振蕩混勻 在室溫 20 25 靜置40min后觀察結果 血凝試驗 抗原效價的測定 操作表 1 單位抗原孔的紅血球必須達到100 凝集 同時0 5 孔紅血球達到50 凝集 50 下沉孔底才符合要求 否則重新調配 4 單位抗原驗證結果判定 血凝抑制試驗 加PBS液在微量反應板上的1孔 11孔加入25ulPBS 第12孔加入50ulPBS 加被檢血清吸取25ul被檢血清加入第1孔吹吸吹吸取10 15次混勻 從第1孔吸取25ul血清稀釋液加入到第2孔 吹吸同樣次數(shù)混勻后吸取25ul加入第3孔 如此進行對倍稀釋至第10孔 從第10孔吸取25ul棄之 換滴頭 1 11孔均加入含4 單位抗原液25ul 室溫下靜置30min 每孔均加入25ul1 RBC液 振蕩混勻 在室溫 20 25 靜置40min后觀察結果 對照孔紅細胞將呈紐扣狀沉于孔底 結果判定 以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為H