《基因工程的基本原理學(xué)案》.doc

基因工程的基本原理學(xué)案張建尚/江蘇【學(xué)習(xí)目標(biāo)】站得高明確學(xué)習(xí)目標(biāo)。1.簡述DNA重組技術(shù)所需的三種基本工具。2.認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。3.簡述基因工程原理及基本操作程序。4.嘗試設(shè)計某一轉(zhuǎn)基因生物的研制過程?！局攸c和難點】重點：1.DNA重組技術(shù)所需的三種基本工具的作用。2.基因工程基本操作程序的四個步驟。難點：1.基因工程載體需要具備的條件。2.從基因文庫中獲取目的基因和利用PCR技術(shù)擴增目的基因。【學(xué)法提示】1.聯(lián)系DNA分子的結(jié)構(gòu)，理解限制酶、DNA連接酶和載體的作用及特點，準(zhǔn)確畫出限制酶切割產(chǎn)生的末端；通過比較掌握DNA連接酶和DNA聚合酶的作用特點。2.聯(lián)系DNA復(fù)制、基因表達過程，理解PCR過程、基因表達載體的構(gòu)建和目的基因的檢測與鑒定?！菊n前預(yù)習(xí)】起步穩(wěn)知識源于生活。1.基因工程中使用的“分子手術(shù)刀”是 ，它能夠識別 的某種 ，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的 斷開，從而使DNA DNA片段產(chǎn) 末端或 末端；基因工程中使用的“分子縫合針”是 ，其作用是將 “縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開了的 ；基因進入受體細胞的載體被稱為“ ”，常用的載體有 等。2.作為載體DNA必須具備的特點有：具有一個至多個 ，供外源DNA片段插入其中；攜帶外源DNA進入受體細胞后，停留在細胞中進行 ，或者整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行 。具有特殊的 ，供重組DNA的 ；載體DNA必須是安全的。3.基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟： 、 和 。4.獲取目的基因的方法有以下幾種： 、 、 ?；虮磉_載體的構(gòu)建是基因工程的 ，一個基因表達載體的組成除了 外，還必須有 、 以及 等。其中 是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位。5.將目的基因?qū)胫参锛毎捎米疃嗟姆椒ㄊ?， 是轉(zhuǎn)基因動物中采用最多，也是最為有效的一種將目的基因?qū)雱游锛毎姆椒ā＾D(zhuǎn)化大腸桿菌細胞時要先用 處理細胞，使其成為 細胞。用 方法可以檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因，用 方法可以檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，用 方法可以檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。除了上述分子檢測外，有的還需要進行 的鑒定。答案1. 限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）雙鏈DNA特定核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端平DNA連接酶雙鏈DNA片段磷酸二酯鍵分子運輸車質(zhì)粒、噬菌體的衍生物和動植物病毒2. 限制酶切割位點自我復(fù)制同步復(fù)制遺傳標(biāo)記基因鑒定和選擇3.目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定4.從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術(shù)擴增目的基因通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成核心目的基因啟動子終止子標(biāo)記基因啟動子5. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+感受態(tài)細胞DNA分子雜交分子雜交技術(shù)抗原-抗體雜交個體生物學(xué)水平 【課堂探究】走得歡探索成長快樂。一、DNA重組技術(shù)的基本工具1.分析回答下列問題：（1）從噬菌體侵染細菌的實驗來看，細菌等原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但這類原核生物沒有絕滅，其保護機制是 。GGATCC CCTAGG （2）限制酶不能任意切割DNA分子的原因是 。 （3）已知限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是-GGATCC-，請畫出該酶切割 所產(chǎn)生的黏性末端。2.比較：DNA連接酶DNA聚合酶作用對象連接 DNA連接 DNA作用部位將DNA雙鏈上 個缺口連接起來將 個核苷酸加到已存在的核酸片段上模板 共同點 3.思考并回答問題：（1）為什么不能把單獨的DNA片段直接導(dǎo)入受體細胞？ 。如果選擇的載體沒有限制酶切割位點，能否制作出重組DNA？ 。（2）能否選用從霍亂弧菌中分離出來的質(zhì)粒做載體？ 。（3）我們用肉眼不能直接觀察到載體進入受體細胞，那如何鑒定呢？ 。生物材料DNA a一定大小范圍DNA PCRcDNA 基因文庫 基因組文庫 c 人工合成獲取目的基因d導(dǎo)入受體細胞得到轉(zhuǎn)基因生物eb限制酶切割包括二、基因工程的基本操作程序完成基因工程的基本操作流程圖，并回答問題：（1）填寫圖中ae的內(nèi)容。復(fù)制原點1抗生素基因2（2）PCR過程中利用 使DNA解鏈為單鏈，所用DNA聚合酶的特點是 ，需要的引物有 種。（3）右圖是基因表達載體模式圖，圖中1是 ，作用是 ，2是 ，作用是 ?？股鼗虻淖饔檬?，目的基因應(yīng)該插入在 之間。（4）如果要將某目的基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入植物細胞，先要將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的 中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細胞的 上。受體細胞若是體細胞則可以通過 技術(shù)獲得個體，而動物基因工程的受體細胞通常是 。在用表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，常用 處理大腸桿菌，以利于表達載體進入。（5）用 方法可以檢測目的基因是否整合到染色體DNA上，為了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用標(biāo)記的目的基因片段作探針與mRNA雜交，該雜交技術(shù)稱為 ，為了檢測目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA是否翻譯成 ，常用抗原-抗體雜交技術(shù)。檢測抗蟲基因是否導(dǎo)入棉花體內(nèi)，簡便方法是 。G GATCCCCTAG G答案一、1.（1）細菌細胞內(nèi)的限制酶能切割侵入的噬菌體DNA，使之失去遺傳作用（2） 限制酶具有特異性，能夠識別特定核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子（3）2.雙鏈單鏈兩單不需要模板以一條DNA鏈為模板都能形成磷酸二酯鍵3.（1）直接導(dǎo)入的DNA片段不能復(fù)制，也容易被受體細胞水解不能（2）不能（3）利用載體上特殊的遺傳標(biāo)記基因進行鑒定和選擇基因工程的基本原理基本工具基本操作程序DNA分子雜交RNA-DNA分子雜交抗原-抗體雜交目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定從基因文庫中獲取PCR擴增化學(xué)方法人工合成目的構(gòu)成導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入微生物細胞限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶載體分子水平個體水平農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+處理二、（1）mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA文庫構(gòu)建表達載體目的基因的檢測與鑒定（2）高溫耐高溫2（3）啟動子是RNA聚合酶識別和轉(zhuǎn)錄的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子終止基因轉(zhuǎn)錄為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來啟動子與終止子（4）T-DNA染色體的DNA植物組織培養(yǎng)受精卵Ca2+（5）DNA分子雜交分子雜交技術(shù)蛋白質(zhì)用棉花葉直接飼喂害蟲【知識體系】【課堂鞏固】跑得快善于學(xué)習(xí)，手不釋卷！ C T G C A G G A C G T Caabb5533為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處（填“a”或“b”）。構(gòu)建重組DNA分子的載體一般選用病毒或 ，后者的形狀成 。構(gòu)建重組DNA分子時應(yīng)將目的基因插入到載體上的 和 之間。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的 做探針進行分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。GGATCCGATC CCTAGGCTAG 用酶I和酶切割（5）已知限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是-GGATCC-，限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是-GATC-。在目的基因的左側(cè)有酶的一個切點，右側(cè)各有酶的一個切點（如下圖所示）。請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶和限制酶同時切割后所形成的黏性末端。GGATCCGATC G GATCC GATCCCTAGGCTAG CCTAG GCTAG 用酶I和酶切割目的基因答案（1）a ；a ；質(zhì)粒；小型環(huán)狀；啟動子；終止子（2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養(yǎng)（4）耐鹽基因（目的基因；一定濃度的鹽水澆灌（移植到鹽堿地中）（5）【課后作業(yè)】步步高鞏固成果，對答如流！（2008海南）右圖為某種質(zhì)粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tctR 為四環(huán)素抗性基因，P啟動子，T為終止子，ori為復(fù)制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內(nèi)的多種酶的酶切位點。據(jù)圖回答：ToriampRtctRPEcoRIBamHI（1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達載體分別用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有 、 、 三種。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進行 。（2）用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物是 ；若接種到含青霉素培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含的連接產(chǎn)物是 。（3）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點是，其合成的產(chǎn)物是 。（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應(yīng)選用的酶是 。答案（1）目的基因載體連接物；載體-載體連接物；目的基因-目的基因連接物；分離純化（2）載體-載體連接物；目的基因-載體連接物、載體-載體連接物（3）啟動子；mRNA（4）EcoRI和BamHI解析（1）目的基因的DNA與質(zhì)粒表達載體分別用EcoRI酶切后產(chǎn)生的黏性末端相同，此時在DNA連接酶的作用下會產(chǎn)生自身環(huán)化或形成串聯(lián)寡聚物，由于題中求 的是“兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物”，可排除自身環(huán)化這一情況，得到目的基因與目的基因、目的基因與質(zhì)粒表達載體、質(zhì)粒表達載體與質(zhì)粒表達載體三種連接物。（2）由于質(zhì)粒上的抗四環(huán)素基因被EcoRI切斷失去作用，所以目的基因載體連接物和目的基因-目的基因連接物也就失去抗四環(huán)素的作用，只有載體載體連接物修復(fù)了抗四環(huán)素基因，使受體細胞（原核宿主細胞）能夠在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上正常生長。EcoRI沒有破壞抗青霉素基因，所以導(dǎo)入基因載體連接物和載體載體連接物的原核宿主細胞能夠在含有青霉素的培養(yǎng)基上正常生長。（3）如果用EcoRI、BamHI兩種限制酶同時處理目的基因的DNA和質(zhì)粒表達載體，分離出的目的基因和質(zhì)粒表達載體各自具有兩個不同的