「實驗一底物濃度對酶促反應(yīng)的影響」.doc

實驗一 底物濃度對酶促反應(yīng)的影響1、 實驗?zāi)康恼莆盏孜餄舛葘γ富钚缘挠绊?，了解堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的Km值的測定原理和方法，理解Km值的意義。二、實驗原理在溫度、pH及酶濃度等恒定的條件下，底物濃度對酶的催化作用有很大的影響。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，酶促反應(yīng)速度V隨底物濃度S的增高而顯著加快，隨著底物濃度漸高，反應(yīng)速度加快程度漸小，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭纫陨蠒r，再增高底物濃度，反應(yīng)速度亦不再增加，成為該條件下極限最大反應(yīng)速度Vmax。底物濃度與反應(yīng)速度的這種關(guān)系可以用下列米曼（Michaclis-Menten）氏方程式表示。V=或Km=S( 1)式中，Km為米氏常數(shù)。當(dāng)V=Vmax/2時，則Km=S，即米氏常數(shù)是反應(yīng)速度等于最大速度一半時底物物濃度的數(shù)值。如圖所示： VVmax Km S圖1 底物濃度與酶促反應(yīng)速度的關(guān)系Km是酶的特征性常數(shù)，不同酶的Km值不同，同一酶作用于不同底物的Km值亦不同。大多數(shù)純酶的Km值在0.01100mmol/L之間。Km值的測定在酶學(xué)研究中有重要的實際意義。根據(jù)實驗結(jié)果繪制上述直角雙曲線，難以準(zhǔn)確求出Km和Vmax值。而用米曼氏方程式的下列變換式，則容易求得Km及Vmax值。米曼氏方程式中各項皆采用倒數(shù)表示，則成為LineweaverBurk氏方程式：=+ 如圖所示： 斜率= 圖2 LineweaverBurk氏法作圖求Km值這是個上截式直線方程式。與為直線關(guān)系，如上圖。直線斜率為，縱軸截距為，橫軸截距為.據(jù)此可以測定不同濃度底物的反應(yīng)速度，按與關(guān)系作圖而容易正確得出Km值。另有其他變換式，例如把上式兩側(cè)皆乘以S，則轉(zhuǎn)換成Wilkinson氏方程式。=+S如圖所示：斜率=-K m S圖3 Wilkinson氏法作圖求Km值這也是直線方程式。以為縱軸，S為橫軸作圖，則直線在橫軸上的截距為Km.本實驗利用磷酸苯二鈉法測定不同濃度底物的堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）的反應(yīng)速度，作圖求出Km值。AKP的催化原理為：在一定pH和溫度下，待測液中的AKP作用于基質(zhì)液中的磷酸苯二鈉，使之水解釋放出酚。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林(AAP)作用并經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色醌類化合物。以酚作標(biāo)準(zhǔn)液同樣處理顯色進行比色，可測知酚的生成量，從而計算出酶的活力。三、實驗器材試管、37水浴鍋、可見分光光度計、座標(biāo)紙。四、實驗試劑1、0.04mol/L基質(zhì)液 稱取磷酸苯二鈉 2H2O 10.16g，用煮沸冷卻的蒸餾水溶解并稀釋至1000mL。加4mL氯仿防腐貯于棕色瓶中冰箱保存，可用一周。2、0.1mol/L pH10碳酸鹽緩沖液（含0.3% 4-氨基安替比林） 稱取4-氨基安替比林（AAP）3g，用0.1mol/L pH10碳酸鹽緩沖液溶解并稀釋至1000mL，放棕色瓶內(nèi)，冰箱保存。3、酚標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）與酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（0.1mg/mL）酚標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）：稱取結(jié)晶酚1.0克溶于0.1N鹽酸至1000mL。酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（0.1mg/mL）：準(zhǔn)確吸取酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液（1mg/1mL）10.0 mL于100mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，貯存冰箱中可保存一個月。4、0.5鐵氰化鉀溶液稱取5g鐵氰化鉀和15g硼酸，分別溶于400mL蒸餾水中，溶解后兩液混合，再加蒸餾水至1000mL，置于棕色瓶中暗處保存。5、0.1mol/L pH10碳酸鹽緩沖液(37時)稱取無水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g溶解于蒸餾水中，稀釋至1000mL。6、0.01mol/L pH8.8 Tris緩沖液稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.1g，用蒸餾水溶解并稀釋到1000mL，此即為0.1mol/L Tris溶液。取上液100mL，加蒸餾水約700mL，再加0.1mol/L醋酸鈉100mL，混勻后用%醋酸調(diào)pH到8.8，用蒸餾水稀釋至1000mL。7、酶液AKP（10mg，10U/mg）用0.01mol/L Tris緩沖液稀釋成每mL含0.71.0單位的酶溶液。五、實驗操作 取干凈試管8支，編號，按下表操作。特別注意準(zhǔn)確吸取酶液、基質(zhì)液及標(biāo)準(zhǔn)液。管 號123456SB0.04mol/L基質(zhì)液（mL）0.100.200.300.400.801.00水（mL）1.401.301.201.100.700.501.501.50碳酸鹽緩沖液（含AAP）（mL）1.501.501.501.501.501.501.501.50搖勻37，保溫5min0.1mg/mL酚標(biāo)準(zhǔn)液（mL）0.10酶 液（mL）0.100.100.100.100.100.100.10充分搖勻，37準(zhǔn)確保溫15min0.5%鐵氰化鉀（mL）2.002.002.002.002.02.002.002.00混勻，室溫放置10min以B管調(diào)零，讀記在510nm處的各管光密度值OD，并填入下表，計算有關(guān)數(shù)據(jù)并作圖。如按林貝氏法可如下進行：列表并計算記入各有關(guān)數(shù)據(jù)。底物濃度對酶促反應(yīng)的影響管號t1t2t3t4t5t6S光密度ODV1/VS1/S(1) 計算出各管的酶活性單位ODt/ODs0.01，此數(shù)代表反應(yīng)速度（V）。(2) 計算出各管底物濃度：基質(zhì)液濃度=0.04(3) 進一步計算出各管