細(xì)胞凋亡實驗ppt課件.ppt

細(xì)胞凋亡與檢測方法 匯報人 凋亡 apoptosis 機(jī)體在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的 程序化的死亡過程 壞死 Necrosis 各種致病因子 干擾和中和了細(xì)胞的正常代謝活動 造成細(xì)胞的意外死亡 一 細(xì)胞的死亡方式 二 細(xì)胞壞死與凋亡的比較 三 細(xì)胞凋亡的生理意義 1 確保正常發(fā)育 生長如 指 趾 間隙的形成2 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定如 清除受損 突變或衰老的細(xì)胞3 發(fā)揮防御功能如 使受到病毒感染的細(xì)胞凋亡 細(xì)胞變圓微絨毛消失胞質(zhì)濃縮空泡化 凋亡小體 初期 核染色質(zhì)高度濃縮凝集在核周邊 邊集細(xì)胞體積縮小 中期 胞膜內(nèi)陷出芽 濃縮核裂解膜自行分割 后期 鄰近的上皮細(xì)胞 M 瘤細(xì)胞等吞噬凋亡小體 四 凋亡時細(xì)胞的主要變化 一 形態(tài)學(xué)改變 NormalCell Apoptoticcell 二 生化改變 DNA片段化 主要特征2 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶 nase 激活3 凋亡蛋白酶 Caspases 激活 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用 H1 核心顆粒 連接區(qū) 180 200bp 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶 Zn2 Ca2 Mg2 五 細(xì)胞凋亡的檢測方法 1 形態(tài)學(xué)檢測 一 HE染色 凋亡細(xì)胞呈圓形 胞漿紅染 細(xì)胞核染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀 二 透射電鏡觀察 三 熒光顯微鏡觀察 透射電鏡觀察 凋亡細(xì)胞體積變小 細(xì)胞質(zhì)濃縮 凋亡 期 pro apoptosisnuclei 的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞 出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象 cavitations 的空泡結(jié)構(gòu) 圖2 a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚 邊緣化 細(xì)胞凋亡的晚期 細(xì)胞核裂解為碎塊 產(chǎn)生凋亡小體 熒光顯微鏡 期的細(xì)胞核呈波紋狀 rippled 或呈折縫樣 creased 部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài) a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚 邊緣化 b期的細(xì)胞核裂解為碎塊 產(chǎn)生凋亡小體 圖1 2 DNA片斷化檢測 細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂 形成50 300kbp長的DNA大片段 或180 200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜 DNAladder 細(xì)胞經(jīng)處理后 采用常規(guī)方法分離提純DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色 在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNAladder 如果細(xì)胞量很少 還可在分離提純DNA后 用32P ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 TdT 使DNA標(biāo)記 然后進(jìn)行電泳和放射自顯影 觀察凋亡細(xì)胞中DNAladder的形成 3 流式細(xì)胞儀檢測flowcytometer 一 PI單染 二 Annexin PI雙染色 一 PI單染 熒光染料PI 碘化丙啶 是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑 常用于細(xì)胞凋亡檢測 英文全稱是PropidiumIodide 它是一種溴化乙啶的類似物 在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光 細(xì)胞凋亡之初 由于核酸內(nèi)切酶的激活 將DNA從核小體間切斷 產(chǎn)生游離寡核苷酸片段 這些片段彌散到胞漿中 但是細(xì)胞膜完整 不能離開細(xì)胞 乙醇固定 PBS洗滌 使細(xì)胞膜通透性增加 并從細(xì)胞漿彌散出胞外 但是大分子DNA在胞內(nèi) 不能被抽提 判斷 在直方圖上 Go G1期前有一個亞二倍體峰 檢測晚期凋亡 但不能判斷是晚期凋亡還是壞死 二 Annexin PI雙染色 原理 磷脂酰絲氨酸 PS 主要存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè) 細(xì)胞凋亡時 它移向細(xì)胞外側(cè) 可能是PS膜內(nèi)外轉(zhuǎn)位酶的早期激活有關(guān) Annexin 是一種Ca2 依賴磷脂結(jié)合蛋白 對PS有高度親和性 PS外翻不是凋亡細(xì)胞所特有 壞死細(xì)胞也可發(fā)生 兩種細(xì)胞的區(qū)別在于早期凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜是完整的 而壞死細(xì)胞膜完整性受到破壞 可用PI區(qū)分 檢測標(biāo)準(zhǔn) 早期凋亡細(xì)胞 Annexin FITC PI 壞死細(xì)胞和晚期凋亡繼發(fā)性壞死細(xì)胞 Annexin FITC PI 機(jī)械性壞死及非特異性染色 Annexin FITC PI 正常細(xì)胞 Annexin FITC PI C mycASO200nmol L 凋亡結(jié)果 壞死結(jié)果 4 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用 多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡 而線粒體跨膜電位DYmt的下降 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件 它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征 染色質(zhì)濃縮 DNA斷裂 出現(xiàn)之前 一旦線粒體DYmt崩潰 則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn) 線粒體跨膜電位的存在 使一些親脂性陽離子熒光染料如可結(jié)合到線粒體基質(zhì) 其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低 親脂性陽離子熒光探針JC 1以單體形式存在 可發(fā)出綠色熒光 527nm 若以多聚體形式存在 可發(fā)出紅色熒光 590nm JC 1可透過正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)進(jìn)入胞內(nèi) 正常健康線粒體的膜電位 具有極性 JC 1依賴于 的極性被迅速攝入線粒體內(nèi) 并形成多聚體 發(fā)出紅色熒光 590nm 線粒體 和綠色熒光 527nm 胞液 而細(xì)胞發(fā)生凋亡時 線粒體跨膜電位被去極化 JC 1從線粒體內(nèi)釋放 線粒體內(nèi)紅光強(qiáng)度減弱 590nm 以單體的形式存在于胞液內(nèi)而發(fā)綠色熒光 527nm 因此在雙色濾光片下觀察 正常細(xì)胞為高綠高紅 凋亡細(xì)胞為高綠低紅 正常細(xì)胞為高綠高紅 凋亡細(xì)胞為高綠低紅 5 Caspase 3活性的檢測 Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用 其中caspase 3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子 它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能 Caspase 3正常以酶原 32KD 的形式存在于胞漿中 在凋亡的早期階段 它被激活 活化的Caspase 3由兩個大亞基 17KD 和兩個小亞基 12KD 組成 裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物 最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡 但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞 caspase 3的活性明顯下降 Westernblot分析caspase 3的活化Caspase3 6 7 Caspase 3正常以酶原 32KD 活化的Caspase 3由兩個大亞基 17KD 和兩個小亞基 12KD 組成 原理 活化的Caspase 3能夠特異切割D1E2V3D4 X底物 水解D4 X肽鍵 根據(jù)這一特點 設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac DEVD AMC 在共價偶聯(lián)時 AMC不能被激發(fā)熒光 短肽被水