《疫學原理及檢測》PPT課件.ppt

免疫學原理及檢測 技術支持部胡賀 主要內容 免疫學基本內容血清學一般特點ELISA方法的技術根據ELISA方法的種類影響因素中山生物產品各類產品簡介 免疫學 一門自然科學 從研究機體對傳染病的抵抗力開始 是微生物學的一個分支 但隨著科技的發(fā)展 成為了一門獨立的學科 免疫學反應 是抗原與抗體的反應 僅在高等脊椎動物中存在 這是已知的最精妙復雜的身體抵御外部物質的系統(tǒng) 抗原 Antigen 抗原是指能刺激機體免疫系統(tǒng)產生免疫應答而生成抗體和致敏淋巴細胞等免疫應答產物 并能與之發(fā)生特異性結合的物質 具有免疫原性和反應原性 一般抗原都是外來物 如細菌 病毒 寄生蟲 大分子蛋白等 抗體 Antibody 機體受外來抗原物質刺激后 產生的一種能與該抗原發(fā)生特異性結合的免疫球蛋白 Ig 免疫球蛋白分類 Ig通常是指具有抗體活性和 或 抗體樣結構的球蛋白 應用免疫電泳與超速離心分析可將Ig分5類 IgG IgA IgM IgD IgE IgG 含量最多或最主要的Ig 75 唯一能夠通過胎盤的Ig 主要由脾臟和淋巴結中的漿細胞合成與分泌 IgM 分子量最大 由5個IgM單體通過J鏈連接 是最早出現的Ig 是抗原刺激后最早出現的抗體 其殺菌 溶菌 溶血 促吞噬以及凝集作用比IgG高500 1000倍 IgG抗體的結構及與抗原的反應 血清學反應的一般特點 1 抗原 抗體的結合具有特異性 但當有共同抗原 抗體存在時 會出現交叉反應 2 抗原 抗體的結合是分子表面的結合 這種結合雖相當穩(wěn)定 但是可逆的 3 抗原 抗體的結合是按一定比例進行的 只有比例適當時 才能出現可見反應 最適比例示意圖 4 血清學反應大體分為兩個階段進行 但其間無嚴格界限 第一階段為抗原抗體特異性結合階段 反應速度很快 只需幾秒至幾分鐘反應即可完畢 但不出現肉眼可見現象 第二階段為抗原抗體反應的可見階段 表現為凝集 沉淀 補體結合反應等 反應速度慢 需幾分 幾十分以至更長時間 血清學反應的一般特點 酶聯(lián)免疫吸附試驗enzymelinkedimmuno sorbentassayELISA ELISA方法的技術根據 抗原或抗體能結合到固相載體的表面 并保持其免疫活性 抗原或抗體與酶連接所形成的結合物仍保持免疫學和酶的活性 在測定時待測血清與固相載體的抗原或抗體結合 然后再加入酶標記的抗原或抗體 形成復合的結合物 最后加入底物溶液 與酶反應的顏色深淺與標本中相應抗原或抗體的量成比例 ELISA方法的種類 雙抗體夾心ELISA法示意圖 影響因素 試劑因素標本因素 內源性 外源性 操作因素 試劑因素 選擇優(yōu)良的檢測試劑 操作前平衡到室溫不同批號的試劑不能混用在有效期內使用 標本因素 外源性干擾 標本應避免溶血 細菌的污染 假陽性 抗凝不完全的標本 假陽性 建議盡量不用抗凝劑血尤其是肝素抗凝劑 標本保留時間過長 間接法本底值增高 如需保存一周以上 則應 20 保存 融解后應充分混勻 標本間應避免交叉污染 不應與生化標本共用同一管標本 不能用NaN3防腐 標本因素 內源必干擾 類風濕因子 假陽性 檢測抗原時可用2 巰基乙醇加入到標本稀釋液中 使其降解或F ab 2代替完整IgG 補體 假陽性 可用EDTA稀釋標本或滅活補體 嗜異性抗體 自身免疫性抗體 交叉反應物質等 操作時影響因素 加樣應加在孔的下1 3處 注意不可濺出或有氣泡產生 加樣應每人一吸頭 防止交叉污染 樣本的稀釋 目的是減少非特異性反應 要先加稀釋液再加標本并用微量振蕩器混勻30秒 加試劑時應搖勻并棄去第一滴 洗滌應徹底 中山生物產品 乙肝兩對半 缺少e抗原 丙肝梅毒EB病毒登革熱G6PD 乙型肝炎病毒血清標志物檢測 常用ELISA法檢測 目前HBsAg診斷試劑質量較高 靈敏度可達0 2ng L 從全國室間質控評價結果顯示 陽性標本率達到或超過98 HBsAg滴度越高 HBeAg HBVDNA陽性的可能性越大 血液與肝組織的HBsAg含量并不完全相關 HBsAg 為什么血清HBsAg陰性不能排除HBV感染 檢測試劑不夠敏感 S基因變異 抗原性發(fā)生改變 X基因變異 轉錄受抑制 重疊HCV感染 干擾HBsAg合成 如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染 提高檢測敏感性 采用針對變異抗原的檢測試劑 HBVDNA的檢測 組織中標志物的檢測 陽性就萬無一失了嗎 低滴度應注意假陽性單一HBsAb陽性HBVDNA檢出率0 11 8 先后感染了不同的HBV亞型 S基因變異 X基因變異 HBsAb HBsAb陽性HBVDNA陰性并不排除肝細胞內HBV的存在 可出現在HBV感染的恢復期 此時HBsAg未消失 HBsAb已產生 大部分歸功于檢測敏感性的提高 S基因發(fā)生變異 野生株HBsAb不能將其清除 HBsAb陽性者感染了不同亞型HBV或免疫逃避株 HBsAg與HBsAb共存 是重要的免疫耐受因子 大部分情況下其存在表示患者處于高感染低應答期 HBeAg與HBVDNA有良好的相關性 陽性標本檢出率90 左右 HBeAg HBeAg與HBeAb HBeAg的存在表示病毒復制活躍且有較強的傳染性 HBeAg消失而HBeAb產生稱為血清轉換 HBeAb陽轉后 病毒復制多處于靜止狀態(tài) 傳染性降低 長期HBeAb陽性者并不代表病毒復制停止或無傳染性 研究顯示20 50 仍可檢測到HBVDNA 部分可能由于前C區(qū)基因變異 導致不能形成HBeAg HBeAg與HBeAb共存 血清轉換過程中 檢測敏感性提高 野生株與變異株同時存在 HBcAb 反映肝細胞受到HBV侵害的一種指標 主要包括IgM IgG IgA 抗HBcIgM陽性是最早出現的特異性抗體 是診斷急性乙型肝炎和判斷病毒復制活躍的指標 并提示病人的血液有強傳染性 也見于慢性活動性肝炎 抗HBcIgG其陽性滴度高 表明患有乙型肝炎 指正在感染 低滴度為既往感染指標 體內時間長 乙型肝炎病毒各項標志物檢測的臨床意義 臨床二對半檢測常見模式 建議每個病人都要進行HBVDNA檢測 HBVDNA檢測的臨床意義 1 診斷方面 HBVDNA是HBV存在最直接的依據 HBVDNA是HBV復制的標志 HBVDNA是患者具有傳染性的標志 4 對HBV M起補充作用 HBeAg HBeAb 乙型肝炎 前C區(qū)變異 HBsAg 乙型肝炎 S區(qū)變異 低水平感染單項抗HBc 乙型肝炎 HBVDNA檢測的臨床意義 2 療效判斷 HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標 3 預后判斷 HBVDNA水平與病情有一定的關系 HBVDNA檢測的臨床意義 調查表明并不是所有 大三陽 的病人都處于HBV復制期 具有傳染性 也不是所有 小三陽 的病人HBV都無復制 因此 要準確知道HBV是否處于復制狀態(tài) 最準確的方法還是通過檢測HBVDNA來決定 為什么建議每個病人都要進行HBVDNA檢測 HBsAg和HBeAg均陽性而HBVDNA陰性可能的原因 干擾素或拉米夫定等治療后病毒復制受抑制 PCR所用引物相應的DNA序列發(fā)生突變 此引物與突變DNA不能配對結合 病毒DNA整合于宿主肝細胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏 丙型肝炎 HCV抗體不是保護性抗體 是存在HCV感染的標志 抗HCVIgM在發(fā)病后即可檢測到 一般持續(xù)1 3個月 如果抗HCVIgM持續(xù)陽性 提示病毒持續(xù)復制 易轉為慢性 低滴度抗HCVIgG提示病毒處于靜止狀態(tài) 高滴度提示病毒復制活躍 HCVRNAHCVRNA陽性是病毒感染和復制的直接標志 HCVRNA亦可定量 定量測定有助于了解病毒復制程度 抗病毒治療的選擇及療效評估等 為什么要同時檢測抗HCV及HCVRNA 抗病毒治療的要求 防止漏診 有報道223例丙型肝炎病例中 抗HCV和HCVRNA同時陽性86例 單純抗HCV陽性118例 單純HCVRNA陽性19例 表明單做其中一項可能導致漏診 艾滋病血清學檢測 初篩試驗 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA 用于對檢測對象感染情況的初步篩查 檢測結果可能會有假陽性 不能發(fā)抗體陽性報告 確認試驗 免疫印跡法 WesternBlot 確定檢測對象是否有HIV抗體 可發(fā)抗體陽性報告 第一代ELISA試劑 標記抗原 全病毒裂解抗原優(yōu)點 靈敏度高 可檢出各種抗體缺點 制備麻煩 成本高 假陽性 1985年 FDA批準第一個HIV抗體篩選試劑 第二代ELISA試劑 標記抗原 重組或合成多肽抗原優(yōu)點 重組抗原可消除HLA所致的抗體假陽性 生產成本低 不使用HIV病毒顆粒 較為安全 敏感性特異性較高缺點 仍有一定的假陽性 1990年 FDA批準第一個重組抗原篩選試劑 第三代ELISA試劑 標記抗原 重組或合成多肽優(yōu)點 可檢測所有不同種類的抗體 增加了試劑的敏感性和特異性 1994年發(fā)展了雙抗原夾心法 酶標物由抗人IgG改變?yōu)樘禺愋訦IV抗原 第四代ELISA試劑 標記物 重組或多肽抗原 重組抗體優(yōu)點 同時檢測HIV抗原抗體 縮短窗口期注意 抗原檢測敏感性低于單獨抗原試劑 20 100pg ml 3 5 10pg ml 1998年第四代試劑首次上市 快速檢測試驗 特點 1 操作簡便 快速 2 普通室溫下可以完成 無需特殊儀器 3 判讀受主觀因素影響 適用范圍 野外 緊急情況 HIV 窗口期 ELISA法檢測假陽性的原因 由于儀器或加樣頭造成的交叉污染潮濕或試劑滴漏底物被金屬離子污染洗板不充分讀取錯誤生物因素 抗體初篩試驗的局限性 陽性結果不能確認 需用其他試劑復查 陰性結果不能排除HIV感染 在感染早期 血清陽轉前存在 窗口期 在感染晚期 某些抗體可能檢測不到 如p24抗體 反應中抗體過量 抗原抗體比例不合適而不能形成特定結構 出現凝集抑制 不能診斷 18月齡嬰兒的母嬰垂直感染 新出現的亞群難以檢測 梅毒 syphilis 由梅毒螺旋體引起的慢性全身性疾病梅毒螺旋體每30 33小時繁殖一次 為厭氧微生物 在體外很容易死亡梅毒分為三期 一期和二期梅毒病程在2年以內稱為早期梅毒 三期梅毒病程已超過2年稱為晚期梅毒傳播途徑 主要為性行為傳播 少數通過間接感染或血液 起源及流行情況 15世紀末 梅毒起源并廣泛流行于歐洲 通過商業(yè)往來 也進入了我國 于1505年在廣東省首先發(fā)現梅毒病例 此后 梅毒便從沿海到內地在我國廣泛傳播開來 發(fā)病率居高不下 居性病之首 解放后 黨和政府有效地取締了妓院 對性病進行廣泛的普查普治 經過十年的努力 已于1959年基本上消滅了梅毒 1964年我國向全世界宣布基本消滅了性病 這一舉動震驚了世界 轟動了全國 世界各國積極防治 在美國 澳大利亞 加拿大以及歐洲發(fā)達國家等 已經將梅毒的預防和治療納入到公共衛(wèi)生的范疇在全球層次上 已經提出了消滅胎傳梅毒的全球行動策略在我國 目前已經開始制定全國梅毒控制規(guī)劃 梅毒檢測方法 病原體檢查 硬下疳部位的分泌物見到螺旋體梅毒血清學檢查常規(guī)篩查方法 非梅毒螺旋體抗原血清試驗 性病研究實驗室試驗 不加熱血清反應素玻片試驗 若篩查陽性 應做梅毒螺旋體抗原血清試驗 熒光密螺旋體抗體吸收試驗 梅毒螺旋體血凝試驗 測定血清特異性抗體 現在通常是用梅毒血清學的檢測來加以診斷 目前各大醫(yī)院比較常用的是RPR 快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗 和TPHA 梅毒螺旋體血球凝集試驗 ELISA檢測梅毒螺旋體抗體試劑盒則主要應用于大規(guī)模梅毒篩查 如血篩 流行病篩查等 EBV 鼻咽癌 NPC 鼻咽癌簡介 鼻咽癌又稱廣東癌 高發(fā)于我國廣東廣西及東南亞 我國3 5歲兒童90 以上已感染EB病毒 華南地區(qū)人群的感染率接近100 早期無明顯癥狀 不易發(fā)現 是我國死亡率最高的10大惡性腫瘤之一 主要受遺傳因素 EB Epstein Barr 病毒感染以及某些環(huán)境因素相互影響而形成 微生物學檢查 EBV分離培養(yǎng)較困難 一般用血清學方法做輔助診斷 1 EBV特異性抗體檢測 對鼻咽癌早期診斷有很大幫助 2 異嗜性抗體檢測 主要用于診斷傳染性單核細胞增多癥 EBV核酸檢測 原位核酸雜交或PCR G6PD 6 磷酸葡萄糖脫氫酶 蠶豆病 是一種遺傳性酶缺乏病 我國高發(fā)區(qū) 南高北低 主要分布在長江以南各省 以海南廣東廣西云南貴州四川等省為高 病因是由于G6PD基因突變 導致該酶活性降低紅細胞不能抵抗氧化損傷而遭受迫壞 引起溶血性貧血 臨床表現 G6PD缺乏癥的臨床表現與一般溶血性貧血大致相同 分新生兒黃疸 蠶豆病 藥物性溶血 感染性溶血 非球形細胞溶血性貧血等臨床類型 因G6PD缺乏誘發(fā)的嚴重的急性溶血性貧血因紅細胞破壞過多 如不及時處理 可引起肝 腎 或心功能衰竭 甚至死亡 G6PD缺乏癥又是新生兒病理性黃疸的主要原因 據中山醫(yī)大的一項統(tǒng)計表明 患G6PD缺乏癥的新生兒中 約50 的患兒會出現新生兒黃疸 其中約12 可發(fā)展為核黃疸 導致腦部損害 引起智力低下 遺傳方式 G6PD缺乏癥屬X連鎖不完全顯性遺傳 酶缺乏的表現度不一 一些女性雜合子酶活性可能正常 男性患者多于女性 是否有必要做產前篩查 G6PD缺乏癥不是產前診斷的嚴格指征 因為一些患者在無誘因不發(fā)病時與正常人一樣 危害不大 但一旦發(fā)病 又屬于嚴重遺傳病之列 臨床醫(yī)生應酌情掌握 關鍵是要將篩查工作做好 使患者本人明白自己帶有該基因 婚后預測胎兒患病風險 做好防治工作 檢查方法 原理 比色法 試劑盒的組成 6 磷酸葡萄糖酸 6PG 6 磷酸葡萄糖 G6P 硝基四氮唑藍 NBT 吩嗪硫酸甲酯 PMS 尿素適用范圍 適用于人體全血標本中6 磷酸葡萄糖脫氫酶的檢測 比色基本原理 以可見光作光源 比較溶液顏色深淺度以測定所含有色物質濃度的方法 以生成有色