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文檔簡介
血清中總蛋白和白蛋白測定的實(shí)驗(yàn)方案血清總蛋白的測定:實(shí)驗(yàn)原理血清(漿)中蛋白質(zhì)的肽鍵(-CO-NH-)在堿性溶液中能與2價(jià)銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)和2個(gè)尿素分子縮合后生成的雙縮脲(H2N-OC-NH- CO-NH2)在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應(yīng)相似,故稱之為雙縮脲反應(yīng)。這種紫紅色絡(luò)合物在540nm處有明顯吸收峰,吸光度在一定范圍內(nèi)與血清蛋白含量呈正比關(guān)系,經(jīng)與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較,即可求得蛋白質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)器材 分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)試劑1.6mol/L NaOH溶液稱取NaOH 240g,溶于新鮮制備的蒸餾水約800ml中,定容至1L,貯于有蓋塑料瓶中。2.雙縮脲試劑 稱取硫酸銅結(jié)晶(CuSO45H2O)3g溶于新鮮制備的蒸餾水500ml中,加入酒石酸鉀鈉(NaKC4H4064H2O),用以結(jié)合Cu2+,防止CuO在堿性條件下沉淀)9g和KI(防止堿性酒石酸銅自動(dòng)還原并防止Cu2O的離析)5g。待完全溶解后,在攪拌下加入6mol/L NaOH溶液100ml,并用蒸餾水定容至1L,置塑料瓶中蓋緊保存。此試劑室溫下可穩(wěn)定半年,若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn),則需要重新配制。3.6070g/L蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液可用定值參考血清或標(biāo)準(zhǔn)白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)操作取試管3支,混勻,置2530min或37 10min,在波長540mm處比色,用空白管調(diào)零,測各管吸光度。參考范圍6080g/L。注意事項(xiàng)1.黃疸血清,嚴(yán)重溶血,葡萄糖,酚酞及溴磺酞鈉對本法有明顯干擾,故用標(biāo)本空白管來消除。但如標(biāo)本空白管吸光度太高,可影響測定的準(zhǔn)確度。2.高脂血癥混濁血清會(huì)干擾比色,可采用下述方法消除:取2支帶塞試管或離心管,各加待測血清0.1ml,再加蒸餾水0.5ml和丙酮10ml,塞緊并顛倒混勻10次后離心,傾去上清液,將試管倒立于濾紙上吸去殘余液體。向沉淀中分別加入雙縮脲試劑及雙縮脲空白試劑,再進(jìn)行與上述相同的其他操作和計(jì)算。方法評價(jià)1.雙縮脲顯色反應(yīng)僅和蛋白質(zhì)中肽鍵數(shù)成正比關(guān)系,與蛋白質(zhì)的種類、分子量及氨基酸的組成無明顯關(guān)系,各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同。2.本法重復(fù)性好,RCV為4%,CCV為3.9%;線性范圍為0140g/L;本法干擾少,并且大多可以避免;使用單一的穩(wěn)定試劑,操作簡便、快速,既適于手工操作,也便于自動(dòng)化分析,已被推薦為測定血清總蛋白的參考方法。3.唯一的缺點(diǎn)是靈敏度較低,比酚試劑法低約100倍。但本法的檢出限為0.21.7g/L,這相當(dāng)于70g/L的血清324l,已能滿足臨床生化檢驗(yàn)的需要。4.本法是臨床測定血清總蛋白質(zhì)首選最方便、最實(shí)用的常規(guī)方法。5.臨床上常見的血清蛋白定量法主要有雙縮脲法、臨床折射計(jì)法、染料結(jié)合法、BCA法和免疫比濁法。臨床意義 血清總蛋白濃度受到血容量變化的影響,脫水時(shí)蛋白濃度相對增加,水潴留時(shí)則降低。在生理情況下,體位、運(yùn)動(dòng)等也可使血蛋白濃度發(fā)生輕微變化。 1.血清總蛋白濃度升高 (1)各種原因失水所致的血液濃縮:如嘔吐、腹瀉、燒傷、糖尿病酮癥酸中毒、急性傳染病、急腹癥等。 (2)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)疾病:如多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥、單核細(xì)胞性白血病等; (3)風(fēng)濕性疾?。喝缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化。 (4)慢性傳染?。喝缃Y(jié)核、梅毒等 2.血清總蛋白濃度降低 (1)各種原因引起的血清蛋白丟失或攝入不足:如腎病綜合征、營養(yǎng)不良、消耗增加; (2)蛋白質(zhì)合成障礙,如肝臟疾病。 血清白蛋白測定血清白蛋白溴甲酚綠法測定實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)原理:在pH42的緩沖液中,白蛋白作為一種陽離子,結(jié)合陰離子染料溴甲酚綠(BCG)形成藍(lán)綠色化合物,在波長630nm處有吸收峰,其吸光度與白蛋白濃度成正比例,與同樣處理的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較可求得血清中白蛋白含量。實(shí)驗(yàn)試劑1、05molL琥珀酸緩沖貯存液(PH40)溶解Na0H 10g琥珀酸 56g于 800m1蒸餾水中,用1molL氫氧化鈉調(diào)至pH4.10.05加水稀釋至1000ml此液置4冰箱保存2、BCG已存液(10molL):溶解BCG(MW720.22)1.80g于5m1 Na0H中用蒸餾水稀釋至250ml3、疊氮鈉貯存液:溶解疊氮鈉40g于1000ml蒸餾水中。4、聚氧化乙烯月桂醚(BYij35)貯存液溶解2.5g聚氧化乙烯月桂醚于80ml蒸餾水中,加熱助溶然后加蒸餾水至10ml5、BCG試劑:與1L容量瓶中盛蒸餾水約400m1,加琥珀酸緩沖貯存100ml,用吸管準(zhǔn)確加入BCG貯存液80m1,并用蒸餾水將吸管壁上殘留的少量染料沖洗到液體中加疊氮鈉25ml,聚氧化乙烯月桂醚25ml最后用蒸餾水稀釋到刻度,配好BCG試劑應(yīng)為4.15土0.05。6、40gL白蛋白標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液實(shí)驗(yàn)步驟 波長630nm。用空白管調(diào)零,用定量加液器加BCG應(yīng)用液與血清標(biāo)本混合后,立即在30土3S,讀取吸光度,如果標(biāo)本混濁可做標(biāo)本空白管(血清002m1加琥珀酸緩沖液40ml)以琥珀酸緩沖液調(diào)零測定標(biāo)本空白管吸光度,測定管吸光度減去標(biāo)本空白管吸光度后計(jì)算結(jié)果測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管待測血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水BCG應(yīng)用液計(jì)算:血清白蛋自(gL)測定管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管白蛋白濃度(g/L)同時(shí)測定血清標(biāo)本的總蛋白濃度,減去血清白蛋白濃度,即得血清球蛋白濃度,并可計(jì)算血清白、球蛋白比值參考值:3555g/L注意事項(xiàng):1、實(shí)驗(yàn)證明BCG不但與白蛋白顯色,而且與各種蛋白成分顯色其中以球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、融珠蛋白更為顯著,其反應(yīng)度較該蛋白稍慢,故有人主張用定值參考血清作標(biāo)準(zhǔn)比較理想,BCG與血清特異結(jié)合后,在此
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