血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳.ppt

血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳PolyAcrylamideGelElectrophoresis PAGE pp61 掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分離混合蛋白質(zhì)的原理 熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)方法和操作技術(shù) 目的與要求 制備凝膠安裝凝膠管加樣 血清樣品15 20 L 其中含甘油 溴酚蘭 電泳 3mA 管 剝膠染色和脫色 操作步驟 實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下 聚合交聯(lián)而成 具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠 并以此為支持物在垂直的玻璃管中進(jìn)行電泳 電泳分離的區(qū)帶類似圓盤狀故命名為圓盤電泳 結(jié)果 聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳兩類 連續(xù)電泳指整個(gè)電泳系統(tǒng)中所用緩沖液 pH值和凝膠網(wǎng)孔的孔徑都是相同的 不連續(xù)電泳是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液 pH值和孔徑 具有濃縮效應(yīng) 電荷效應(yīng) 分子篩效應(yīng) 不連續(xù)圓盤電泳的凝膠管中置有兩種不同的凝膠層 濃縮膠 分離膠 不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過(guò)程中濃縮成層 從而提高分辨能力 濃縮膠的濃縮效應(yīng) 電極緩沖液 Tris Gly溶液 pH8 3 濃縮膠緩沖液 Tris Cl溶液 pH6 7 分離膠緩沖液 Tris Cl溶液 pH8 9 溶液中主要的負(fù)離子 pI 血清蛋白質(zhì) 5 0左右 甘氨酸 5 97 以及完全解離的Cl離子形成先導(dǎo)離子 快離子 尾隨離子 慢離子 P26 在緩沖系統(tǒng)中的弱酸 如甘氨酸 在pH6 7時(shí)很少解離 其有效泳動(dòng)速率很低 而氯離子卻有很高的泳動(dòng)速率 蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率介于兩者之間 加上電壓以后 作為先導(dǎo)離子的氯離子和尾隨離子的甘氨酸離子分離開(kāi)來(lái) 并在其后面留下一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶 由于導(dǎo)電性和電場(chǎng)強(qiáng)度成反比 這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度 加速甘氨酸離子的泳動(dòng) 使其趕上氯離子 建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)速率乘積相等的穩(wěn)定態(tài) 使這些帶電顆粒以相同的速度泳動(dòng) 兩種離子之間有明顯的邊界 當(dāng)甘氨酸 氯離子界面通過(guò)樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí) 在移動(dòng)界面前有一低電壓梯度 界面后有一高電壓梯度 由于在移動(dòng)界面前的蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)速率比氯離子低 因此氯離子能迅速越過(guò) 移動(dòng)界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中 其泳動(dòng)速率比甘氨酸快 因此 移動(dòng)的界面將蛋白質(zhì)分子堆積到一起 形成一條狹窄的區(qū)帶 由于濃縮膠為大孔凝膠 故對(duì)蛋白樣品沒(méi)有分子篩作用 當(dāng)移動(dòng)的界面到達(dá)濃縮膠和分離膠的界面時(shí) 凝膠的pH明顯增加 導(dǎo)致甘氨酸大量解離 此時(shí) 甘氨酸的有效泳動(dòng)速率明顯增加 超越蛋白分子 直接在氯離子后移動(dòng) 由于凝膠孔徑變小 蛋白質(zhì)分子的遷移速率降低 落在后面的蛋白質(zhì)便在均一的電壓梯度和pH環(huán)境中泳動(dòng) 并根據(jù)其固有的電荷與分子大小進(jìn)行分離 可見(jiàn) 甘氨酸并非作為緩沖成分參與 而是作為尾隨離子來(lái)參與電泳過(guò)程 制備凝膠安裝凝膠管加樣 血清樣品15 20 L 其中含甘油 溴酚蘭 電泳 3mA 管 剝膠染色和脫色 操作步驟 制備凝膠 分離膠 濃縮膠 過(guò)硫酸銨后加 1 AP 過(guò)硫酸銨 引發(fā)劑 1 TEMED 四甲基乙二胺 催化劑 引發(fā)劑在凝膠形成中提供自由基 通過(guò)自由基的傳遞 使丙烯酰胺成為自由基 導(dǎo)致聚合反應(yīng) 催化劑則可加快引發(fā)劑產(chǎn)生自由基的速度 注意事項(xiàng) 丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性 避免呼吸道吸