高效液相色譜儀校驗(yàn)規(guī)程.doc

標(biāo) 準(zhǔn) 文 件Standard document文件編號(hào)Document No.SOP-LOP-790-8/00高效液相色譜儀校驗(yàn)規(guī)程Calibration SOP for HPLC頁(yè) 碼Page1 / 9狀 態(tài)Status正式Formal備 份 號(hào)Control No.起 草 人Written by起草日期Written date年 月 日頒發(fā)部門(mén)Issued department質(zhì)量管理部Quality department審 核 人Reviewed by審核日期Reviewed date年 月 日批 準(zhǔn) 人Approved by批準(zhǔn)日期Approved date年 月 日生效日期Effective date年 月 日分發(fā)部門(mén)Distributed department：質(zhì)量負(fù)責(zé)人 質(zhì)量管理部 QA QC1、目的Objective：建立高效液相色譜儀內(nèi)部校驗(yàn)規(guī)程，確保校驗(yàn)工作規(guī)范、順利進(jìn)行。2、范圍Scope ：本規(guī)程適用于本公司使用的高效液相色譜儀（紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器/二極管陣列檢測(cè)器）的校驗(yàn)。3、職責(zé)Responsibilities：3.1 培訓(xùn)職責(zé)：本文件起草人或?qū)徍巳嘶蚺鷾?zhǔn)人負(fù)責(zé)對(duì)質(zhì)量管理部全體人員培訓(xùn)。3.2 QC：負(fù)責(zé)制定本規(guī)程，并對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。3.3 QA：負(fù)責(zé)監(jiān)督和檢查本規(guī)程的實(shí)施。4、定義Definition：無(wú)。5、程序Procedures：5.1 依據(jù)國(guó)家計(jì)量校驗(yàn)規(guī)程JJG 705-2002液相色譜儀，安捷倫液相說(shuō)明書(shū)，島津液相說(shuō)明書(shū)。5.2 備件及材料5.2.1水：HPLC級(jí)水。5.2.2化學(xué)試劑：乙腈（HPLC）、丙酮（分析純）。5.2.3咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品。5.2.4咖啡因標(biāo)樣。0.005 mg/ml, 0.010 mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml和0.250 mg/ml咖啡因水溶液。5.2.5色譜柱： 4.6mm250mm，C18，5m。5.2.6 容量瓶：10ml。5.2.7玻璃注射器。5.2.8 限流阻尼管。5.2.9 分析天平。5.2.10 秒表。5.2.11 熱電偶5.3 校驗(yàn)項(xiàng)目及技術(shù)指標(biāo)5.3.1泵性能的測(cè)試表1校 驗(yàn) 項(xiàng) 目指 標(biāo)流量設(shè)定值(ml/min)0.51.01.52.02.5流量設(shè)定值誤差，|SS |5%2%2%2%2%流量穩(wěn)定性誤差，SR 3%2%2%2%2%5.3.2柱溫箱溫度穩(wěn)定性測(cè)試*表2校 驗(yàn) 項(xiàng) 目指 標(biāo)溫度設(shè)定值 ()2025303540溫度設(shè)定值誤差|T|2控溫穩(wěn)定性誤差TC 1備注：如藥典專(zhuān)論規(guī)定的特定柱溫，不在以上溫度范圍之內(nèi)，則對(duì)分析該品種的儀器增加該溫度點(diǎn)校驗(yàn)，校驗(yàn)項(xiàng)目和可接受指標(biāo)相同。5.3.3 檢測(cè)器性能測(cè)試表3 校 驗(yàn) 項(xiàng) 目指 標(biāo)基線噪聲：510-4AU基線漂移：510-3AU/h波長(zhǎng)準(zhǔn)確度：|2nm線性測(cè)試： 相關(guān)系數(shù)R 響應(yīng)因子f的RSD 0.9995.0%5.3.4進(jìn)樣器性能測(cè)試表4校 驗(yàn) 項(xiàng) 目指 標(biāo)進(jìn)樣器精密度測(cè)試：定性重復(fù)性(Rt)RSD定性 1.0%定量重復(fù)性(峰面積) RSD定量 2.0%自動(dòng)進(jìn)樣器線性測(cè)試*： 相關(guān)系數(shù)R響應(yīng)因子f的RSD0.9995.0%5.3.5梯度組成的測(cè)試*表5校 驗(yàn) 項(xiàng) 目指 標(biāo)梯度準(zhǔn)確度|TSH-MSH|2%梯度準(zhǔn)確度的精密度0.5%注：*表示該項(xiàng)目的內(nèi)部校驗(yàn)取決于儀器的配置，有該配置則為必檢項(xiàng)目。5.4 校驗(yàn)方法5.4.1校驗(yàn)通則5.4.1.1 HPLC的內(nèi)部校驗(yàn)由儀器所屬部門(mén)經(jīng)培訓(xùn)的使用者按本規(guī)程進(jìn)行校驗(yàn)，其校驗(yàn)項(xiàng)目依儀器配置和使用范圍而定。5.4.1.2 政府部門(mén)每一年對(duì)HPLC進(jìn)行校驗(yàn)，每六個(gè)月內(nèi)部對(duì)HPLC進(jìn)行一次校驗(yàn)；儀器配置的關(guān)鍵部件大修或更換后，可參考本規(guī)程對(duì)該部件相關(guān)的項(xiàng)目進(jìn)行校驗(yàn)，以對(duì)儀器的性能進(jìn)行確認(rèn)。5.4.1.3 校驗(yàn)時(shí)，同時(shí)檢查、確認(rèn)儀器的安裝，使用環(huán)境符合要求，儀器處于正常的狀態(tài)下，并檢查、確認(rèn)儀器的接線牢固，接地良好。5.4.1.4 不同配置的儀器，須按照規(guī)定的校驗(yàn)項(xiàng)目及指標(biāo)進(jìn)行內(nèi)部校驗(yàn)，以保證該儀器的所有使用功能均進(jìn)行了校驗(yàn)。5.4.2 泵性能的測(cè)試SS和SR的測(cè)定5.4.2.1 測(cè)試條件： 流動(dòng)相：水；色譜柱：限流阻尼管。5.4.2.2 測(cè)試：分別設(shè)定流速為0.5ml/min， 1.0ml/min，1.5ml/min，2.0ml/min，2.5ml/min等值進(jìn)行校驗(yàn)，這些流速覆蓋了實(shí)驗(yàn)室使用的流速范圍。待流速穩(wěn)定后，在流動(dòng)相流出口處用容量瓶準(zhǔn)確地收集流動(dòng)相10.0ml，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，各測(cè)量3次，按公式(1)、(2)計(jì)算SS和SR，并以下表所列內(nèi)容記錄測(cè)試數(shù)據(jù)和結(jié)果。表6 泵性能的測(cè)試 泵流量設(shè)定值： 流動(dòng)相體積： 次數(shù)項(xiàng)目123收集時(shí)間t(秒)流量實(shí)測(cè)值Fm(ml/min)泵流量設(shè)定值誤差SS泵流量穩(wěn)定性誤差SR5.4.3柱溫箱溫度穩(wěn)定性測(cè)試T 和Tc的校驗(yàn)5.4.3.1測(cè)試將測(cè)溫儀之熱電偶固定在柱溫箱中央，關(guān)好柱箱門(mén)。以限流阻尼管替代色譜柱，分別設(shè)定柱溫箱溫度為20，25，30，35，40等值進(jìn)行校驗(yàn)，這些溫度覆蓋了實(shí)驗(yàn)室使用的柱溫范圍。待測(cè)溫儀指示溫度穩(wěn)定后，記錄溫度顯示值，每隔5分鐘測(cè)一次，每個(gè)溫控點(diǎn)測(cè)定1小時(shí)，求出平均值，并以下表所列內(nèi)容記錄測(cè)試數(shù)據(jù)和結(jié)果。設(shè)定值與平均值之差為設(shè)定值誤差T，13次測(cè)量值中最大值與最小值之差為控溫穩(wěn)定性誤差Tc。表7 柱溫箱溫度穩(wěn)定性測(cè)試溫度設(shè)定值： 次數(shù)項(xiàng)目12345678910111213平均值溫度實(shí)測(cè)值設(shè)定值誤差T穩(wěn)定性誤差Tc5.4.4 檢測(cè)器性能測(cè)試5.4.4.1基線漂移和基線噪聲的測(cè)試5.4.4.1.1 測(cè)試條件 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流動(dòng)相：水；流速：1.0ml/min；色譜柱：4.6mm250mm，C18，5m。5.4.4.1.2測(cè)試按不同的儀器配置，設(shè)定檢測(cè)器的靈敏度為較靈敏值。待系統(tǒng)平衡后，調(diào)整基線在圖譜的中部位置，記錄基線30分鐘。以圖譜顯示的刻度值或靈敏度與積分儀的匹配關(guān)系，計(jì)算基線噪聲和漂移值?；€噪聲為峰峰噪聲，選擇最大的噪聲作為基線噪聲。計(jì)算方法：基線噪聲圖譜單位距離對(duì)應(yīng)的吸光度AU噪聲峰峰間的垂直距離。漂移值為30分鐘內(nèi)噪聲的最高值和最低值之間垂直距離L對(duì)應(yīng)的吸光度AU。計(jì)算方法：漂移值圖譜單位距離對(duì)應(yīng)的吸光度AUL/0.5h。5.4.4.2 波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的測(cè)試5.4.4.2.1 DAD/PDA的測(cè)試取咖啡因標(biāo)樣2)進(jìn)樣，記錄色譜圖和200nm400nm范圍內(nèi)的紫外吸收?qǐng)D譜，其205nm處的最大吸收處波長(zhǎng)與205nm比較，其273nm處的最大吸收處波長(zhǎng)與273nm比較，最小吸收處的波長(zhǎng)與245nm比較，三波長(zhǎng)處的差值|均應(yīng)2nm。5.4.4.2.2 UV檢測(cè)器的測(cè)試a.具備紫外圖譜掃描功能的檢測(cè)器：以水流過(guò)流通池時(shí)作一空白掃描，然后，以手動(dòng)方式將咖啡因標(biāo)樣2)注入流通池，掃描200nm300nm范圍內(nèi)的紫外吸收?qǐng)D譜。記錄咖啡因最大吸收和最小吸收處的波長(zhǎng)，其205nm處的最大吸收波長(zhǎng)與205nm比較，其273nm處的最大吸收波長(zhǎng)與273nm比較， 最小吸收波長(zhǎng)與245nm比較，三波長(zhǎng)處的差值|均應(yīng)2nm。b.不具備紫外圖譜掃描功能的檢測(cè)器：以水注入流通池調(diào)零，然后，將咖啡因標(biāo)樣2)注入流通池，通過(guò)設(shè)定不同波長(zhǎng)，記錄205nm、245nm、273nm三個(gè)波長(zhǎng)上下各5個(gè)nm范圍內(nèi)的吸收度A或流通池參比能量R與樣品能量S的比值，205nm、273nm波長(zhǎng)處各取該波長(zhǎng)范圍內(nèi)最大的吸收值或比值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)；245nm波長(zhǎng)處取該波長(zhǎng)范圍內(nèi)最小的吸收值或比值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。測(cè)定波長(zhǎng)分別與對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)205nm、245nm、273nm比較，三波長(zhǎng)處的差值|均應(yīng)2nm。5.4.4.2.3 線性測(cè)試a測(cè)試條件流速：1.5ml/min； 流動(dòng)相：水-乙腈=85：15； 檢測(cè)波長(zhǎng)：273nm；色譜柱：4.6mm250mm，C18，5m。b測(cè)試待系統(tǒng)平衡后， 分別取咖啡因標(biāo)樣1)、2)、3)、4)、5)、6)，手動(dòng)進(jìn)樣器依儀器配置之定量環(huán)的體積進(jìn)樣，記錄色譜圖。以標(biāo)樣濃度Ci為橫坐標(biāo)，以咖啡因峰面積Ai為縱坐標(biāo)作線性回歸，得其線性方程及相關(guān)系數(shù)R。對(duì)各標(biāo)樣濃度的響應(yīng)因子fi進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，按公式（3）計(jì)算其RSD。其中fi =Ci/Ai。5.4.5 進(jìn)樣器性能測(cè)試5.4.5.1 定性、定量重復(fù)性的測(cè)試a.測(cè)試條件流速：1.5ml/min；流動(dòng)相：水-乙腈=85：15；檢測(cè)波長(zhǎng)：273nm；色譜柱：4.6mm250mm，C18，5m。b.測(cè)試取咖啡因標(biāo)樣5)（濃度為0.125mg/ml），自動(dòng)進(jìn)樣器以5l，10l，20l的體積各連續(xù)進(jìn)樣6次；手動(dòng)進(jìn)樣器依儀器配置之定量環(huán)的體積連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以咖啡因峰的保留時(shí)間和峰面積，按公式(3)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD，并以下表所列內(nèi)容記錄測(cè)試數(shù)據(jù)和結(jié)果。表8 定性、定量重復(fù)性的測(cè)試進(jìn)樣體積次數(shù)n123456平均值RSD保留時(shí)間(min)峰面積5.4.5.2 線性測(cè)試a測(cè)試條件流速：1.5ml/min； 流動(dòng)相：水-乙腈=85：15； 檢測(cè)波長(zhǎng)：273nm；色譜柱：4.6mm250mm，C18，5m。b測(cè)試取咖啡因標(biāo)樣3)（濃度為0.025mg/ml），分別以5l，10l，15l，20l，25l的體積進(jìn)樣，記錄色譜圖。以進(jìn)樣體積V i為橫坐標(biāo)，以咖啡因峰面積Ai為縱坐標(biāo)作線性回歸，得其線性方程及相關(guān)系數(shù)R。對(duì)各進(jìn)樣體積對(duì)應(yīng)的響應(yīng)因子fi進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，按公式（3）計(jì)算其RSD。其中fi =Vi/Ai。 5.4.6 梯度組成測(cè)試5.4.6.1 測(cè)試條件流速： 2.0ml/min；流動(dòng)相1：水；流動(dòng)相2： 0.5% 丙酮的水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：265nm；色譜柱：限流阻尼管。5.4.6.2 測(cè)試以限流阻尼管替代色譜柱，以流動(dòng)相1平衡系統(tǒng)，通道A、B匹配（或通道C、D匹配），按下表之梯度程序，平行測(cè)試3次，記錄色譜圖。將色譜圖按0%到100%B（或D）重新標(biāo)定刻度，以測(cè)定每個(gè)梯級(jí)的理論高度（TSH）與實(shí)測(cè)高度（MSH），見(jiàn)圖1“梯度組成準(zhǔn)確度示意圖”，其差值（TSH-MSH）即為準(zhǔn)確度，以%B（或D）單位表示。取3次測(cè)定中50.0%B、6.0%B和5.0%B（或D）等值的準(zhǔn)確度進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，計(jì)算其準(zhǔn)確度的精密度SD。表9 梯度測(cè)試程序表時(shí)間(分)%通道A(或C)：流動(dòng)相1%通道 B (或 D) ：流動(dòng)相21.001000.01.010.01006.000.01006.0110.090.09.0010.090.09.0111.089.012.0011.089.012.0149.051.016.0049.051.016.0150.050.019.0050.050.019.0194.06.023.0094.06.023.0195.05.026.0095.05.026.01100.00.0圖1 梯度組成準(zhǔn)確度示意圖5.5 計(jì)算公式SS=(Fm-Fs)/Fs100% (1)SR=(Fmax-Fmin)/ F100% (2)其中：Fm=10.060/t為流量實(shí)測(cè)值(ml/min) t ：收集流動(dòng)相的時(shí)間(秒)Fs ，F(xiàn)max，F(xiàn)min，F(xiàn) ：分別為同一組測(cè)量中流量設(shè)定值、流量最大值、最小值、平均值(ml/min)RSD=100% (3)SD= (4)5.6 結(jié)果及結(jié)論每臺(tái)HPLC校驗(yàn)完畢，由QC主管對(duì)校驗(yàn)記錄和結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，無(wú)誤后，依據(jù)該HPLC的配置，發(fā)出校驗(yàn)報(bào)告，并交領(lǐng)導(dǎo)審核。6、參考資料References：