Western Blot技巧.doc

聚丙烯酰胺凝膠溶液：分離膠12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml超純水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 mlpH8.8、1.5mol/LTris溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 mlTEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml10%過(guò)硫酸銨 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml濃縮膠：5% ，pH6.8 2 ml4 ml6 ml超純水1.4 ml2.8 ml4.1 ml30%丙烯酰胺溶液0.3 ml0.6 ml1.0 mlpH6.8、1.0mol/LTris溶液0.25 ml0.5 ml0.75 ml10%SDS0.02 ml0.04 ml0.06 mlTEMED0.002 ml0.004 ml0.006 ml10%過(guò)硫酸銨0.02ml0.04ml0.06ml一配膠1注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。2分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過(guò)濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過(guò)程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.70.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可3封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動(dòng)。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過(guò)降低張力清除殘留水滴。4灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正；若變形嚴(yán)重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長(zhǎng)時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。二樣品處理1培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）： 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。 對(duì)于6孔板來(lái)說(shuō)每孔加200300l，6080的1loading buffer。 100，1min。 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 23次。 用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒(méi)有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0后在1400016000g離心2min，再次挑絲。若無(wú)團(tuán)塊也無(wú)絲狀物但溶液有些粘稠，可通過(guò)使用1ml注射器反復(fù)抽吸來(lái)降低溶液粘滯度，便于上樣。 待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。2培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）： 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上1020min。 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲（100200w）3s，2次。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進(jìn)行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70一個(gè)月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。3組織： 勻漿 對(duì)于心肝脾腎等組織可每50100mg加1ml裂解液，肺100200mg加1ml裂解液?？墒謩?dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進(jìn)行定量。 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70一個(gè)月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。三電泳1上樣前將膠板下的氣泡趕走。2所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1loading buffer上樣，Marker也用1loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。2以初始電壓為45V時(shí)的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá)65V時(shí)改為穩(wěn)壓電泳。3在目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1cm以上結(jié)束。四轉(zhuǎn)膜1電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開(kāi)始準(zhǔn)備：濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去離子水至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每50ml加入10%SDS180ul。浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。2取膠：將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張（干轉(zhuǎn)每側(cè)三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過(guò)多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路）3轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過(guò)夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。負(fù)載電壓不宜超過(guò)1V/cm2膠面積。五封閉及雜交1封閉：將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒(méi)于封閉液中緩慢搖蕩一小時(shí)。必要時(shí)可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。2結(jié)合一抗：一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時(shí)每張39cm2膜約需2ml一抗稀釋液。反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時(shí)或4靜置過(guò)夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤(rùn)平皿以防止液體過(guò)多蒸發(fā)。3洗滌：一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。4結(jié)合二抗：根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋（1:10001:10000），室溫輕搖一小時(shí)。5洗滌：二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。六發(fā)光鑒定一般使用辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。1HRP-ECL發(fā)光法：將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見(jiàn)淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見(jiàn)熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。2AP-NBT/BICP顯色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個(gè) EP管中，每張39cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過(guò)的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。七增強(qiáng)敏感性若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度：1用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進(jìn)行曝光，可延長(zhǎng)曝光時(shí)間。2將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長(zhǎng)，期間至少換2次液。3封閉4060min4一抗雜交，室溫1h。37 1h 會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。5PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。6二抗雜交，37 1h。7PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。8發(fā)光鑒定。9若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。10三抗雜交，室溫1h。37 1h 會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時(shí)三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。11PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。12發(fā)光鑒定。八NC膜的多次使用一張NC膜可使用多次，對(duì)多種蛋白進(jìn)行雜交，步驟與“七增強(qiáng)敏感性”相近。1如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發(fā)光液（10min3次）后從一抗雜交開(kāi)始，后續(xù)步驟同前。2如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置較近則需更強(qiáng)的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）于室溫?fù)u動(dòng)洗滌30min60min，然后用PBST洗滌10min3次，再?gòu)姆忾]開(kāi)始，后續(xù)步驟同前。3對(duì)于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強(qiáng)度更強(qiáng)的自配的strip液（可用雜交袋）于50洗滌30min，然后用PBST洗滌10min3次，再?gòu)姆忾]開(kāi)始，后續(xù)步驟同前。Western的原理幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑，借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物，則可測(cè)算出多肽鏈的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液，當(dāng)兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動(dòng)界面，并帶動(dòng)加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過(guò)高度多孔性的積層膠后，復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，樣品和積層膠中的氯離干形成移動(dòng)界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動(dòng)界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動(dòng)樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過(guò)堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動(dòng)。從移動(dòng)界面中解脫后，SDS多肽復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動(dòng)穿過(guò)分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。電泳 丙烯酰胺凝膠電泳通常用來(lái)查看蛋白混合物樣品的復(fù)雜程度和監(jiān)測(cè)純化效果。這種方法分離效果極好，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規(guī)模，因?yàn)殡S著膠厚度的增加，電泳時(shí)的熱效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重干擾蛋白的泳動(dòng)。Western bloting首先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用重物壓好，緩沖液就會(huì)通過(guò)毛細(xì)作用流過(guò)凝膠。緩沖液通過(guò)凝膠時(shí)會(huì)將蛋白質(zhì)帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白質(zhì)通過(guò)疏水作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。但是這種方法轉(zhuǎn)移效率低，通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中的一小部分蛋白質(zhì)（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)移。這種方法是用有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)在電場(chǎng)力的作用下離開(kāi)凝膠結(jié)合到NC膜上。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉(zhuǎn)移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱為一個(gè)印跡（blot）,用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。處理過(guò)的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠