含乳飲料及其乳原料中酪蛋白含量的測定（BJS 201915）

附件4含乳飲料及其乳原料中酪蛋白含量的測定BJS 2019151 范圍 本方法規(guī)定了含乳飲料及其原料中酪蛋白四種亞型s1-酪蛋白、s2-酪蛋白、-酪蛋白、-酪蛋白含量測定的方法。 本標準適用于含乳飲料及其原料中酪蛋白總含量的測定，不適用于發(fā)酵法、酶解法、水解法等工藝對蛋白質(zhì)改性的樣品。2 原理試樣溶液中的酪蛋白采用等電點沉淀后復溶，用胰蛋白酶進行酶解，同時加入同位素內(nèi)標，C18水相柱分離，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，內(nèi)標法定量。 3試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。3.1試劑3.1.1 濃鹽酸（HCl）。3.1.2 甲酸（CH2O2）：質(zhì)譜級。3.1.3 醋酸（CH3COOH）：色譜級。3.1.4 氯化鈉（NaCl）。3.1.5 乙腈（CH3CN）：質(zhì)譜級。3.1.6 三羥甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3）。3.1.7 聚乙二醇辛基苯基醚 （Triton X-100, C34H62O11）。3.1.8 胰蛋白酶（Trypsin，C6H15O12P3）：質(zhì)譜級，豬源、牛源、基因工程來源均可；建議采用基因工程級的胰蛋白酶以降低雜酶的影響。3.2 試劑配制3.2.1 鹽酸溶液（6 mol/L）：吸取25 mL 濃鹽酸，用水稀釋并定容至50 mL。3.2.2 甲酸溶液（10% V/V）：吸取1 mL甲酸，用水稀釋并定容至10 mL。3.2.3 醋酸溶液（0.3% V/V）：吸取0.3 mL醋酸，用水稀釋并定容至100 mL。3.2.4 氯化鈉溶液 （0.5 mol/L，含0.2% Triton-X 100）：稱取14.625 g，加200 mL水溶解后，加入1 mL Triton X-100（3.1.7），混勻溶解后，用水定容至500 mL。3.2.5 Tris-HCl溶液（50 mmol/L）：稱取6.057 g Tris，加900 mL水溶解，用6 mol/L鹽酸溶液（3.2.1）調(diào)pH至8.5后，用水定容至1000 mL，經(jīng)0.45 m微孔濾膜過濾，備用。3.2.6 胰蛋白酶液：用醋酸溶液（3.2.3）將胰蛋白酶粉末溶解至1 mg/mL后，按照單次使用量進行稀釋分裝，如每瓶50 L或100L的0.2 mg/mL胰蛋白酶，-80C冷凍保存，避免反復凍融。3.2.7 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（基于考馬斯亮藍-Bradford測定法或BCA蛋白質(zhì)測定法均可）。3.2.8 甲酸水溶液（0.1% V/V）：吸取0.5 mL甲酸，用水稀釋并定容至500 mL。3.3 標準品3.3.1 s1-酪蛋白特征肽標準品：YLGYLEQLLR，純度須準確標定，或經(jīng)國家認證的標準物質(zhì)。3.3.2 s2-酪蛋白特征肽標準品：FALPQYLK，純度須準確標定，或經(jīng)國家認證的標準物質(zhì)。3.3.3 -酪蛋白特征肽標準品：VLPVPQK，純度須準確標定，或經(jīng)國家認證的標準物質(zhì)。3.3.4 -酪蛋白特征肽標準品：YIPIQYVLSR，純度須準確標定，或經(jīng)國家認證的標準物質(zhì)。3.3.5 s1-酪蛋白特征肽內(nèi)標標準品：PSERYLGYL*（13C6，15N）EQLLRLKKY，HPLC級純度 98%。3.3.6 s2-酪蛋白特征肽內(nèi)標標準品：RYQKFALPQYL*（13C6，15N）KTVYQ，HPLC級純度 98%。3.3.7 -酪蛋白特征肽內(nèi)標標準品：SQSKVL*（13C6，15N）PVPQKAVPY，HPLC級純度 98%。3.3.8 -酪蛋白特征肽內(nèi)標標準品：KIAKYIPIQYVL*（13C6，15N）SRYPSY，HPLC級純度 98%。L*（13C6，15N）同位素標記亮氨酸，以上標準品的相對分子量見附錄A表A1。3.4標準溶液配制3.4.1 標準儲備溶液（400 mol/L）：根據(jù)標準品純度及肽段標準品相對分子量計算不同酪蛋白亞型（3.3.1-3.3.4）稱樣量，精確稱取適量（精確至0.01 mg）標準品后，用Tris-HCl溶液（3.2.5）溶解，定容于10 mL 容量瓶中，各酪蛋白亞型特征肽（3.3.1-3.3.4）濃度均為400 mol/L，此溶液密封后-20冷凍保存，有效期3個月。3.4.2 混合標準溶液：準確吸取各酪蛋白亞型特征肽標準儲備液（3.4.1）1 mL至100 mL容量瓶中，加入Tris-HCl溶液（3.2.5）稀釋至刻度，得到各酪蛋白亞型特征肽濃度為4 mol/L 的混合標準溶液，此溶液密封后-20冷凍保存，有效期1個月。3.4.3 混合標準工作溶液：準確吸取混合標準溶液（3.4.2），用純水稀釋，配制成濃度依次為0.02 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、1.0 mol/L、2 mol/L 的系列混合標準工作液， -20冷凍保存，有效期1周。3.4.4 內(nèi)標標準儲備溶液（10 mol/L）：根據(jù)標準品純度及肽段標準品相對分子量計算不同酪蛋白亞型（3.3.5-3.3.8）稱樣量，精確稱取適量（精確至0.01 mg）內(nèi)標標準品后，用Tris-HCl溶液（3.2.5）溶解，配制成各酪蛋白亞型特征肽（3.3.5-3.3.8）濃度均為10 mol/L的內(nèi)標標準儲備溶液，此溶液密封后-20冷凍保存，有效期3個月。3.4.5 內(nèi)標混合標準溶液：準確分別吸取0.25 mL各酪蛋白亞型特征肽內(nèi)標標準儲備溶液（3.4.4）混合，配制成濃度為2.5 mol/L 內(nèi)標混合標準溶液1 mL，-20冷凍保存，有效期1個月。3.4.6 混合標準品酶解溶液：分別準確吸取500 L 各系列混合標準工作溶液（3.4.3）到2 mL低吸附聚丙烯（PP）離心管中，向每個濃度中加入40 L 內(nèi)標混合標準溶液（3.4.5），再加入5 L的 0.2 mg/mL的胰蛋白酶液（3.2.6） （含1 g胰蛋白酶），用純水定容至1 mL后充分渦旋，在1000 r/min，4條件下，離心1 min。蓋緊瓶蓋，在37水浴或者恒溫箱內(nèi)孵育15-16 h后，取出加入20 L 10% 的甲酸溶液（3.2.2）終止酶解反應?；靹蚝?，在10 000 r/min，4條件下離心10 min，靜置，取上清液備用。上清液在-20冷凍保存放置4-5天內(nèi)穩(wěn)定。3.5材料3.5.1 低吸附型2 mL、15 mL、50 mL聚丙烯（PP）離心管。3.5.2 低吸附型聚丙烯（PP）槍頭。3.5.3 低吸附型聚苯乙烯（PS）96孔板（用于總蛋白含量測定）。4 儀器和設備4.1高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。4.2 酶標儀。4.3分析天平：感量分別為0.001 g、0.000 1 g和0.000 01 g。4.4低溫離心機：轉(zhuǎn)速6 000 r/min。4.5恒溫水浴鍋或可控溫培養(yǎng)箱。4.6 pH計。4.7渦旋振蕩器。5分析步驟5.1 試樣蛋白提取含乳飲料固體試樣（若含乳包裝為獨立包裝，應與其他調(diào)味粉末混合后取樣，例如：咖啡、奶茶等飲品）：試樣稱取1 g5 g (精確至0.001 g) 于錐形瓶中；若為乳飲料液體試樣：精密量取試樣10 mL 于錐形瓶中，加入30 mL 預溫（40）的Tris-HCl溶液（3.2.5），混勻后，放入60水浴恒溫振蕩1 h，取出冷卻后用Tris-HCl溶液（3.2.5）轉(zhuǎn)移定容至50 mL容量瓶（V溶解體積）。乳粉原料粉試樣：稱取試樣0.5 g1 g (精確至0.001 g) 于錐形瓶中；若為液體乳試樣：精密量取試樣12 mL 于錐形瓶中，加入30 mL 預溫（40）的Tris-HCl溶液（3.2.5），混勻后，放入60水浴恒溫振蕩1 h，取出冷卻后用Tris-HCl溶液（3.2.5）轉(zhuǎn)移定容至50 mL容量瓶（V溶解體積）。精密量取10 mL（V沉淀體積）上述完全溶解的試樣溶液（視檢無明顯結塊），按體積比（v/v =1:1）加入10 mL 氯化鈉溶液（3.2.4）, 渦旋振蕩?；靹蚝?，用10% 甲酸溶液（3.2.2）調(diào)節(jié)試樣的pH值到4.64.8之間，2-8條件下靜置過夜，待所有蛋白沉淀析出。已析出的沉淀試樣在10000 r/min，4條件下離心15 min，棄去上清液，沉淀以備復溶。5.2 試樣復溶 向上述沉淀試樣（5.1）中加入5 mL Tris-HCl溶液（3.2.5），渦旋振蕩 510 min，使溶液充分溶解，放入60水浴恒溫振蕩30 min，取出后繼續(xù)混勻（視檢無明顯結塊）。試樣溶液在10 000 r/min， 4條件下離心15 min，棄去沉淀，留取上清液。上述步驟重復1次，合并兩次復溶的上清液后，可用Tris-HCl溶液（3.2.5）定容至10 mL（V復溶體積）。5.3 試樣總蛋白的含量測定 按照Bradford或BCA法試劑盒所述方法測定復溶試樣溶液（5.2）中總蛋白質(zhì)的含量（單位：mg/mL）。5.4 試樣的稀釋 為保證該實驗在最佳的酶解效率下進行，需根據(jù)試樣中總蛋白的含量測定結果（5.3）, 用Tris-HCl溶液（3.2.5）對復溶后的試樣溶液進行稀釋（f3稀釋倍數(shù)），使試樣稀釋液中的總蛋白含量保持在0.2 mg/mL0.7 mg/mL之間。5.5 試樣的酶解該實驗的最佳酶解效率為：酶的質(zhì)量/總蛋白質(zhì)量（w/w）=1:20，根據(jù)此原則推算，若試樣稀釋液中總蛋白含量在0.2 mg/mL0.7 mg/mL之間，按取樣量200 L進行酶解（V酶解體積），則其對應的總蛋白質(zhì)質(zhì)量范圍在40 g140 g之間，加入胰蛋白酶的量則在2 g7 g范圍內(nèi)。取 200 L （V酶解體積）稀釋后的試樣（5.4），按照上述計算依據(jù)，加入適量胰蛋白酶液（3.2.6），向試樣中加入 40 L 內(nèi)標混合標準溶液（3.4.5），用純水定容至1 mL（V定容體積）后充分渦旋，在1000 r/min，4條件下，離心1 min。蓋緊瓶蓋，在37水浴或者恒溫箱內(nèi)孵育15-16 h后，取出加入20 L 10% 的甲酸溶液（3.2.2）終止酶解反應?；靹蚝?，在10000 r/min，4條件下離心10 min，靜置，上清液以備分析。注：當回收率達不到本標準要求時，應考慮對蛋白酶活力進行評價?？梢赃x用市售標準蛋白質(zhì)質(zhì)控樣品（標明準確蛋白含量且已知目標肽段分子量的產(chǎn)品）隨行酶解步驟，檢測評估及控制。5.6 儀器參考條件5.6.1 液相色譜參考條件a) 色譜柱：C18親水柱（T3），柱長100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑 1.8 m，填料孔徑 100或性能相當者；b）流動相：流動相A為0.1%甲酸-水溶液（3.2.8），流動相B為乙腈（3.1.5），參考梯度洗脫程序見表1；c) 流速：0.3 mL/min；d）柱溫：30；e）進樣量：5 L；表1 參考梯度洗脫程序時間(min)A：0.1%甲酸-水溶液（%）B：乙腈（%）09550.59554.550504.635656.635656.79559.09555.6.2 質(zhì)譜參考條件a) 離子源：電噴霧離子源；b）掃描方式：正離子掃描；c）監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測模式,酪蛋白母離子、子離子和碰撞能量見表2。d）毛細管電壓：3 500V；e）錐孔電壓：10 V；f）離子源溫度：150 ；g）偏轉(zhuǎn)電壓：50 V；h）錐孔氣流量：150 L/h；i）脫溶劑氣溫度：500 ；j）脫溶劑氣流速：800 L/h；表2 酪蛋白各亞型特征肽的主要質(zhì)譜參數(shù)序號化合物母離子（m/z）子離子（m/z）碎裂電壓（V）碰撞能量（eV）1s1-酪蛋白特征肽634.5991*452124945282s1-酪蛋白特征肽(內(nèi)標)638998*452124945283s2-酪蛋白特征肽490.5648*401522640304s2-酪蛋白特征肽(內(nèi)標)494655*401521940185-酪蛋白特征肽391568*30112133096-酪蛋白特征肽 (內(nèi)標)394.5568*301128530127-酪蛋白特征肽626.5975*402224940248-酪蛋白特征肽 (內(nèi)標)630492*45182494522*為定量離子。5.7 定性判定按照上述條件測定待測液和混合標準工作液，如果試樣待測液中色譜峰的保留時間與混合標準使用液中某一組分保留時間一致（變化范圍在2.5%之內(nèi)），試樣待測液中色譜峰定性離子對的相對豐度與濃度相當?shù)幕旌蠘藴适褂靡合鄬ωS度一致，相對豐度（k）偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該成分。表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度（%）k50%50%k20%20%k10%k10%允許的最大偏差（%） 20% 25% 30% 50%6 分析結果的表述6.1 試樣溶液中各酪蛋白亞型的濃度計算溶解的試樣中各酪蛋白亞型的濃度按式（1）計算：C溶解酪蛋白=C測定濃度f1f2f3 (1)f1 = V定容體積V酶解體積 f2 = V復溶體積V沉淀體積 f3 = 稀釋倍數(shù)式中：C溶解酪蛋白 （步驟5.1中）50 mL試樣溶解液中各酪蛋白亞型的蛋白濃度S1-、S2-、-、-， 單位為mol/L; C測定濃度 經(jīng)標準曲線計算后各酪蛋白亞型的肽段濃度，即代表各酪蛋白亞型蛋白濃度，單位為mol/L；V定容體積 （步驟5.5中）試樣酶解后的定容體積，單位為mL（1 mL）；V酶解體積 （步驟5.5中）試樣稀釋液的酶解體積，單位為mL（0.2 mL）；V復溶體積 （步驟5.2中）復溶試樣中沉淀蛋白的溶液體積，單位為mL（10 mL）；V沉淀體積 （步驟5.1中）從溶解的試樣中抽取用于沉淀蛋白的溶解液體積，單位為mL（10 mL）；f3 （步驟5.3中）Bradford或BCA法測定后，稀釋復溶蛋白溶液的稀釋因子。6.2 試樣溶液中各酪蛋白亞型的含量計算試樣中各酪蛋白亞型的含量按式（2）計算： Xi = C溶解酪蛋白MV溶解體積m10-7 (2)式中：Xi 試樣中各酪蛋白亞型的含量S1-、S2-、-、-，單位為g/100g 或g/100mL；C溶解酪蛋白（公式1中）試樣溶解液中的各酪蛋白亞型濃度S1-、S2-、-、-， 單位為mol/L; M S1-、S2-、-、-酪蛋白的相對分子量（附錄A表A.2），單位為g/mol; V溶解體積 溶解樣品的溶液體積，單位為mL（50mL）； m 試樣質(zhì)量或體積，單位為g或者mL。 注：試樣中各酪蛋白亞型的含量需按照附錄A表A.2中的蛋白分子量計算。 計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留兩位有效數(shù)字。6.3 總酪蛋白含量計算試樣中酪蛋白總含量按式（3）計算：A=XS1+XS2+X+X.(3)A 試樣中各種酪蛋白亞型含量的總和，即試樣中酪蛋白的總含量，單位為g/100g 或g/100mL；XS1 試樣中S1-型酪蛋白的含量，單位為g/100g 或g/100mL；XS2 試樣中S2-型酪蛋白的含量，單位為g/100g 或g/100mL；X 試樣中-型酪蛋白的含量，單位為g/100g 或g/100mL；X 試樣中-型酪蛋白的含量，單位為g/100g 或g/100mL。7 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。8 其他本方法的特征肽段、粉狀及液體含乳飲料、粉狀及液體乳原料的檢出限與定量限如下表4所示：表4 儀器、方法檢出限及定量限特征肽段儀器LOD/LOQs1-型酪蛋白nmol/Ls2-型酪蛋白nmol/L-型酪蛋白nmol/L-型酪蛋白nmol/L檢出限LOD1111定量限LOQ3333粉末狀含乳飲料方法LOD/LOQ（以5g試樣稱取，50mL溶液定容計算）s1-型酪蛋白g/gs2-型酪蛋白g/g-型酪蛋白g/g-型酪蛋白g/g檢出限LOD0.250.260.250.21定量限LOQ0.740.780.750.64液體狀含乳飲料方法LOD/LOQ（以10mL試樣量取，50mL溶液定容計算）s1-型酪蛋白g/mLs2-型酪蛋白g/mL-型酪蛋白g/mL-型酪蛋白g/mL檢出限LOD0.120.130.130.11定量限LOQ0.370.390.380.32粉末狀乳原料方法LOD/LOQ（以1g試樣稱取，50mL溶液定容計算）s1-型酪蛋白g/gs2-型酪蛋白g/g-型酪蛋白g/g-型酪蛋白g/g檢出限LOD1.21.31.31.1定量限LOQ3.73.93.83.2液體乳原料方法LOD/LOQ（以2mL試樣量取，50mL溶液定容計算）s1-型酪蛋白g/mLs2-型酪蛋白g/mL-型酪蛋白g/mL-型酪蛋白g/mL檢出限LOD0.610.650.630.53定量限LOQ1.82.01.91.6本方法的準確度如下表5所示：酪蛋白加標水平（mol/L）回收率（%）精密度（%）0.0171.07.70.0571.65.50.164.34.50.5