傳代培養(yǎng)和細(xì)胞計數(shù)課件

細(xì)胞傳代培養(yǎng)及細(xì)胞計數(shù) 人癌細(xì)胞系傳代培養(yǎng) 1 觀察 培養(yǎng)細(xì)胞生長活躍 占瓶底80 90 無污染 2 棄廢液 倒掉瓶中培養(yǎng)液 盡量瀝干液體 3 漂洗 加1ml0 25 胰蛋白酶消化液漂洗1次 棄去消化液 4 消化 再加1ml消化液漂洗1次 倒掉大部分消化液 保留約0 3ml 室溫放置3 5min 5 吹打 鏡下看到細(xì)胞收縮變園 加1 2ml含血清培養(yǎng)液 用吸管按順序輕輕吹打 避免出現(xiàn)泡沫 6 計數(shù) 取樣 計數(shù) 調(diào)整細(xì)胞濃度 7 接種及培養(yǎng) 按104細(xì)胞 ml接種 37 5 CO2 飽和濕度條件下培養(yǎng) 注意事項 細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積80 左右時 開始傳代 首次傳代培養(yǎng)應(yīng)適當(dāng)提高接種細(xì)胞濃度 細(xì)胞混雜生長時 可根據(jù)需要選擇合適的方法純化細(xì)胞 血球計數(shù)板法 制備細(xì)胞懸液 細(xì)胞密度 104 ml 細(xì)胞過多時需適當(dāng)稀釋 單個細(xì)胞率 95 加樣 混懸細(xì)胞 取少許細(xì)胞懸液 從計數(shù)池一側(cè)加入 不要溢出或出現(xiàn)氣泡 計數(shù) 10倍物鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞 壓線者只計左邊線和上邊線 計算 細(xì)胞數(shù) ml 四大格細(xì)胞總數(shù) 4 104 稀釋倍數(shù) 細(xì)胞活力測定 臺盼藍(lán)染色法 制備單個細(xì)胞懸液 105 106 ml染色 0 04 臺盼藍(lán)染色1min 9滴細(xì)胞懸液 1滴0 4 臺盼藍(lán) 3min內(nèi)計數(shù)計數(shù) 用血細(xì)胞計數(shù)板鏡下分別計數(shù)活細(xì)胞 染料拒染 和死細(xì)胞 呈淡藍(lán)色 計算細(xì)胞活力 活細(xì)胞率 活細(xì)胞數(shù) 活細(xì)胞數(shù) 死細(xì)胞數(shù) 100 細(xì)胞密度調(diào)整 稀釋公式 C1 V1 C2 V2稀釋前細(xì)胞密度C1 溶液體積V1稀釋后細(xì)胞密度C2 溶液體積V2 細(xì)胞計數(shù) 106 mlCellsusspension 105 ml 104 ml 103 ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml Medium0 9ml 細(xì)胞生長曲線測定 計數(shù)法 DT t lg2 lgNt lgNo 培養(yǎng)細(xì)胞的純化方法 機(jī)械刮除法 用細(xì)胞刮刮出不需要的細(xì)胞差速粘附法 成纖維樣細(xì)胞 上皮樣細(xì)胞選擇性酶消化法 金屬管套取需要的細(xì)胞密度梯度離心法 細(xì)胞漂浮密度 Ficoll Percoll克隆化培養(yǎng)法 瓊脂法 有限稀釋法免疫磁珠分離法 細(xì)胞表面標(biāo)志 免疫磁珠速度沉降法 細(xì)胞大小 離心淘洗技術(shù)電泳分離法 細(xì)胞表面電荷 細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的問題 培養(yǎng)液pH值快速偏離 CO2濃度異常 培養(yǎng)瓶蓋過緊 細(xì)菌 酵母或霉菌污染培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀 細(xì)菌或霉菌污染細(xì)胞不貼壁 胰酶過度消化細(xì)胞 支原體污染 缺乏附著因子 細(xì)胞死亡 孵箱中缺CO2 孵箱溫度不穩(wěn)定 細(xì)胞凍融損傷 滲透壓改變 培養(yǎng)液中毒性代謝產(chǎn)物堆積細(xì)胞生長緩慢 培養(yǎng)液或血清改變 基本促生長成分的消耗