密度梯度離心法 density gradient centrifugation .doc

密度梯度離心法 density gradient centrifugation method， 為得到必要的濃度梯度，可采用濃氯化銫溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，預(yù)先在分離超離心機(jī)的樣品地內(nèi)制備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液后，離心，大分子就形成層狀而沉降。不連續(xù)密度蔗糖梯度離心液一般可以采用優(yōu)級(jí)純的蔗糖用超純水配制成百分比濃度分別為16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，從離心管底部逐層向上鋪設(shè)。也有用8層Feicoll梯度離心,即在14mL離心管中由下至上從84到35Feicoll液，按7遞減，各加10mL，形成7層Feicoll梯度。連續(xù)密度蔗糖梯度離心液則需要用專用儀器配制。 密度梯度離心又稱速率區(qū)帶離心,沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)分離的方法；原理：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成，介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶；可用來(lái)分離核酸、蛋白質(zhì)、核糖體亞基及其它成分1亦稱平衡密度梯度離心法。用超離心機(jī)對(duì)小分子物質(zhì)溶液，長(zhǎng)時(shí)間加一個(gè)離心力場(chǎng)達(dá)到沉降平衡，在沉降池內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會(huì)上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。利用這種現(xiàn)象，測(cè)定核酸或蛋白質(zhì)等的浮游密度，或根據(jù)其差別進(jìn)行分析的一種沉降平衡法。自1958年米西爾遜（MMeselson），斯塔爾（FWStahl），維諾格拉德（JVinograd）成功地分離了15NDNA和14NDNA以來(lái)，該法取得許多成果。為得到必要的濃度梯度，多采用濃氯化銫溶液，所以有時(shí)也使用氯化銫濃度梯度離心法這個(gè)名稱，還可采用氯化銣、溴化銫等溶液。通常利用分析超離心機(jī)，但在將細(xì)胞顆粒成分進(jìn)行分離等以純化為目的的情況，利用密度差，使用分離超離心機(jī)，采用預(yù)先制備好的蔗糖等的密度梯度。2采用蔗糖等一些小分子溶液，預(yù)先在分離超離心機(jī)的樣品地內(nèi)制備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液后，離心，大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降系數(shù)不同的許多成分，就會(huì)出現(xiàn)許多層。這種情況采用適當(dāng)?shù)木幣盘?hào)碼，取出樣品池內(nèi)的溶液，然后進(jìn)行研究。這是與1不同的一種沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分離物這點(diǎn)上是有優(yōu)越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦稱為蔗糖密度梯度離心法。按同樣原理，也可使用分析超離心機(jī)進(jìn)行測(cè)定。 編輯本段工作原理又稱速率區(qū)帶離心,沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)分離的方法； 原理：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。 介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成，介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油； 密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度注意事項(xiàng)離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。再通過(guò)虹吸、穿刺或切割離心管的方法將不同區(qū)帶中的顆粒分開(kāi)收集，得到所需的物質(zhì)。 1、梯度介質(zhì)應(yīng)具備足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍。 2、梯度介質(zhì)不會(huì)與樣品中的組分發(fā)生反應(yīng)。 3、梯度介質(zhì)也不會(huì)引起樣品