趙曉妮細胞培養(yǎng)論文.doc

動物胚胎干細胞的培養(yǎng)技術(shù)摘要：1885年，W Rou嘗試使組織離體培養(yǎng)，被認(rèn)為是組織細胞培養(yǎng)技術(shù)的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動物細胞的培養(yǎng)，標(biāo)志著細胞培養(yǎng)技術(shù)（Cell culture technology）的誕生。此后，隨著抗生素、培養(yǎng)基、培養(yǎng)裝置以及工藝方法的不斷改進，動物細胞培養(yǎng)（Animal cell culture）的研究和應(yīng)用逐步增多和深入，發(fā)展至今已成為在生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法。利用細胞培養(yǎng)開展體外試驗，成為了闡釋生命現(xiàn)象、發(fā)病機理和篩選藥物的重要手段；利用細胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合細胞融合（Cell fusion）、細胞雜交（Cell hybridization）以及轉(zhuǎn)基因（Trans-gene）技術(shù)進行基因重組、組織構(gòu)建是遺傳和組織工程的重要工具；利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體等，已成為醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。1干細胞最早出現(xiàn)于19世紀(jì)的文獻中。1896年，Wilson在一篇論述細胞生物學(xué)的文獻中首次使用干細胞這一概念，專門用于描述寄生蟲（線蟲、蠕蟲）生殖系的祖細胞。1897年，Boveri等在進行絲蟲研究時發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過連續(xù)的卵裂之后，只有一個細胞保留了全部的染色體，這一細胞包含有成體生殖細胞的全部成分。但到目前為止，干細胞仍然是一個廣義的概念，但現(xiàn)代干細胞的概念與早期干細胞相比，已經(jīng)賦予了新的內(nèi)涵，認(rèn)為干細胞的最基本特征是具有自我更新能力和分化為成熟細胞的潛能。1962年Edwards首先觀察到兔胚泡ES細胞的分化現(xiàn)象。之后，科學(xué)工作者對ES細胞進行了深入的研究，取得了諸多突破性的進展。2003年，韓國和美國科學(xué)家聯(lián)手，利用體細胞克隆技術(shù)獲得人類克隆胚胎干細胞，這一技術(shù)的成功表明可以用任何人的自體細胞培育ES細胞，從而使ES細胞向臨床應(yīng)用邁進了一大步。2004年，日本科學(xué)家在體外將小鼠的ES細胞誘導(dǎo)分化為精子和卵子細胞，結(jié)果進一步證實ES細胞具有向生殖細胞分化的潛能。最近還有科學(xué)家利用孤雌繁殖法（卵細胞體外激活培養(yǎng)）培養(yǎng)出早期胚胎，預(yù)示人類的自然生殖面臨新的課題。3關(guān)鍵詞：胚胎干細胞；來源；特點；培養(yǎng)；保存；復(fù)蘇；前沿；進展1、胚胎干細胞（ES細胞）的生物學(xué)特性 3 1.1 ES細胞的來源 ES細胞是來源于特定解剖部位的細胞，包括：胚胎瘤干細胞、由著床前胚泡的內(nèi)細胞團分離建系而來的胚胎干細胞、胚胎生殖細胞（由早期胚胎原始生殖嵴細胞分離建系而來）。1.2 ES細胞的基本特點4 具有經(jīng)培養(yǎng)不定期地分化并產(chǎn)生特化細胞的能力，具有以下特點：有多向分化潛能和受精卵的某些特性，可以分化為胎兒和成體內(nèi)各種類型的組織細胞；可在體外培養(yǎng)的條件下建立穩(wěn)定的細胞系，可長期增殖培養(yǎng)、凍存并保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性；將ES細胞與8-16階段的胚胎共培養(yǎng)后，植入假孕母體子宮，可發(fā)育成嵌合動物，其遺傳特性可進入胚系，遺傳給下一代；對組織損傷產(chǎn)生反應(yīng)，可遷徙、增殖分化并參與修復(fù)過程。體外ES細胞具有培養(yǎng)細胞的特征，最大特點是可對它進行遺傳改造、核轉(zhuǎn)移和凍存等而不失去潛能性。1.3 ES細胞的形態(tài)學(xué)特點 ES細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與早期胚胎細胞具有相似性，細胞相對較小，細胞核明顯，核質(zhì)比較高，染色質(zhì)比較分散，有一個或多個核仁，胞質(zhì)內(nèi)除游離核糖體外，其他細胞器很少；細胞呈多層集落狀生長，緊密堆積在一起，無明顯的界限，形似鳥巢。人和靈長類動物的ES細胞形成的細胞集落相對扁平、松散，容易被胰蛋白酶消化成單細胞。而小鼠的ES細胞和人的EG細胞形成的集落一般呈緊密的球形，不易被常規(guī)的消化方法消化成單個細胞。 1.4 ES細胞的分子生物學(xué)標(biāo)志 堿性磷酸酶、胚胎階段特異性表面抗原（SSEA）、端粒酶、Oct-4/Oct-3、干細胞因子和生殖細胞核因子等。2、干細胞實驗條件與設(shè)備5 干細胞制備培養(yǎng)技術(shù)是一種無菌操作技術(shù)，要求實驗室環(huán)境和條件必須保證無微生物污染，不受其他有害因素的影響，并且是符合操作全過程質(zhì)量控制可追溯性的要求，才能成為臨床生物治療應(yīng)用技術(shù)平臺。細胞實驗室設(shè)立必須符合國家藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范和GMP要求，應(yīng)當(dāng)遵循科學(xué)、安全、規(guī)范、有效、經(jīng)濟、符合倫理的原則。細胞實驗室還必須配備符合現(xiàn)代工藝要求和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的硬件設(shè)備。 干細胞實驗硬件設(shè)備主要有細胞采集儀，細胞分離儀，生物安全柜和凈化工作臺，低溫細胞離心儀，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，細胞質(zhì)量和活力分析儀，流式細胞儀，倒置顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡，深低溫生物冰箱和普通冰箱，程序降溫儀和液氮罐，管道熱合儀及制冰機等。3、ES細胞的制備（以小鼠為例）53.1內(nèi)細胞團的分離與培養(yǎng) 內(nèi)細胞團的分離方法有兩種：顯微分離法和免疫外科法。顯微分離法是在顯微鏡直視下機械地進行分離出內(nèi)細胞團。免疫外科法的原理是：大分子如免疫球蛋白不能通過囊胚滋養(yǎng)外胚層進入囊胚腔，因此利用，免疫介導(dǎo)的細胞毒作用，可選擇地破壞滋養(yǎng)外胚層細胞，二囊胚腔內(nèi)的細胞-細胞團則不受影響。主要介紹免疫方法分離內(nèi)細胞團。材料與試劑：兔抗鼠血清、豚鼠血清、0.5%鏈霉蛋白酶、ES細胞培養(yǎng)液、高糖DMED、FCS、1%非必需氨基酸、129Sv孕鼠。操作方法：分離的過程均在石蠟油覆蓋的30ul液滴中進行；孵育條件為37、5%CO2；抗體和豚鼠血清均用DMEM培養(yǎng)液稀釋。 將見栓3.5d的129Sv孕鼠脫頸處死，剖開腹部，取下子宮角，用37預(yù)熱的含血清培養(yǎng)液沖出胚胎。0.5%鏈霉蛋白酶消化約5分鐘以去除透明帶。然后將胚胎移入含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3小時。用免疫溶解法去除外滋養(yǎng)細胞，過程如下：將胚胎移入1:10稀釋的抗鼠血清液滴中孵育30分鐘；DMEM液滴洗3-5次，每次5分鐘；再在1:10稀釋的豚鼠血清液滴中孵育15-30分鐘；DMEM液滴清洗；然后用尖端直徑為30-40um的細吸管輕輕吹打，分出細胞團，接種到飼養(yǎng)細胞上，在37、5%CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。3.2 ES樣細胞擴增 內(nèi)細胞團經(jīng)過培養(yǎng)后會出現(xiàn)典型的干細胞的集落，將典型的集落用機械法取下，0.05%胰酶消化，打散成單細胞，接種至新飼養(yǎng)細胞上，每天更換培養(yǎng)液，從而得到多個干細胞集落。建立細胞系，傳代、凍存。 4、干細胞的保存與復(fù)蘇 5 4.1 冷凍保存設(shè)備 Cryologic 程序降溫儀、液氮罐、冷凍保存液（滲透性冷凍保護液、非滲透性冷凍保護液）。4.2 冷凍保存方法 在醫(yī)學(xué)和研究領(lǐng)域多采用細胞外冷凍法，即使在溫度相當(dāng)?shù)偷那闆r下細胞也不會致命。冷凍保存細胞的技術(shù)已廣泛用于臨床，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的關(guān)鍵步驟，10%DMSO-196液氮冷凍保存細胞是最經(jīng)典的方法。傳統(tǒng)的慢速冷存法對于可消化為單細胞的小鼠胚胎干細胞系保存是有效的，但對人類胚胎干細胞效果較差。按照冷凍保護液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，干細胞凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。4.3 干細胞復(fù)蘇方法 干細胞復(fù)蘇一般采用快速融化法，以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。 注意：自液氮或干冰中取出冷凍管后，首先要檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉或注意冷凍袋有否破裂并采取相應(yīng)應(yīng)急措施。每批次冷凍和復(fù)蘇的干細胞存活率可能會不相同，為避免這個問題，每次干細胞凍存最好分兩批以上進行。臨床應(yīng)用或再次培養(yǎng)細胞時應(yīng)采用細胞活力儀檢測細胞存活率。5、干細胞研究前沿與展望5.1 ES細胞研究與應(yīng)用 干細胞研究是21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的一大熱門課題。回到令人矚目的1998年，幾乎同時，威斯康星大學(xué)的Thomson等和霍普金斯大學(xué)的Gearhart等分別報告說，他們利用不同的方法成功地使人類胚胎干細胞在體外生長和增殖，由此獲得了具有無限增殖和分化潛力的人胚胎干細胞。5.1.1胚胎干細胞的分離建系與體外培養(yǎng)8 有關(guān)人胚胎干細胞的建系方法有多種，研究最多的是從胚胎的囊胚期內(nèi)細胞群中直接分離胚胎干細胞。另一種建系方法則是從終止妊娠的胎兒組織中分離出胚胎干細胞。5.1.2 誘導(dǎo)分化與發(fā)育6 胚胎干細胞是最早期的未分化細胞。當(dāng)處于合適的培養(yǎng)條件下，胚胎干細胞可以分化形成多種細胞類型。正是由于具有這種在體外培養(yǎng)條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細胞類型的潛能，是胚胎干細胞成為一種研究哺乳動物細胞分化、組織形成過程的基本體系，也成為臨床移植治療的新的細胞來源。然而，目前科學(xué)家對胚胎干細胞定向誘導(dǎo)分化的機制尚不完全清楚，即還不明白胚胎干細胞接受誰的“命令”，此時分化為造血干細胞，二彼時又分化為神經(jīng)干細胞或別的什么干細胞。這是干細胞工程進一步研究與應(yīng)用面臨的最大困擾，也限制了胚胎干細胞的臨床應(yīng)用。因此，干細胞研究的主要問題之一就是要弄清胚胎干細胞發(fā)育分化為的調(diào)控機制，從而在體外培養(yǎng)擴增胚胎干細胞并進行定向誘導(dǎo)分化。近年來，科學(xué)家們利用胚胎干細胞建立了不同的體外分化模型，并建立各種基因改變的胚胎干細胞系，以求發(fā)現(xiàn)某些基因或因子在胚胎發(fā)育早期對不同類型細胞或組織分化的調(diào)控作用。胚胎干細胞體外分化體系已被成功地用于確定一些細胞活性因子，為在細胞水平上分析基因功能提供了強有力的模型系統(tǒng)。5.1.3 遠大的潛力與挑戰(zhàn)世界范圍內(nèi)的干細胞研究熱潮，可以說是由1998年人胚胎干細胞的成功建立而帶動的。胚胎干細胞最偉大的用途首先是作為科學(xué)研究的工具。當(dāng)然，此項進展也使科學(xué)家們看到了干細胞生物工程的曙光。胚胎干細胞在臨床醫(yī)療等領(lǐng)域也顯示了誘人的應(yīng)用前景。有諸多理由可說明胚胎干細胞對科學(xué)和人類健康發(fā)展的重要性。最基本的是人胚胎細胞系的建立及人胚胎干細胞研究可以幫助我們理解人類發(fā)育過程中的復(fù)雜事件，使人深刻認(rèn)識數(shù)十年來困擾著胚胎學(xué)家的一些基本問題，促進對人胚胎發(fā)育細節(jié)的基礎(chǔ)研究。胚胎干細胞系可分化為多種細胞類型，又是能在培養(yǎng)基中不斷自我更新的細胞來源，它發(fā)展為胚體后的生物系統(tǒng)，可模擬體內(nèi)細胞與組織間復(fù)雜的相互作用，這在藥物研究領(lǐng)域具有廣泛的用途。胚胎干細胞有望在短期內(nèi)就能體現(xiàn)的優(yōu)勢在于藥物篩選中。目前，在候選藥物對各種細胞的藥理作用和毒性試驗中，胚胎干細胞提供了新藥的藥理、藥效、毒理及藥代等研究的細胞水平的研究手段，大大減少了藥物檢測所需動物的數(shù)量，降低了成本。另外，由于胚胎干細胞類似于早期胚胎的細胞，它們有可能用來揭示哪些藥物會干擾胎兒發(fā)育和引起出生缺陷。胚胎干細胞最誘人的前景和用途是生產(chǎn)組織和細胞，用于“細胞療法”，為細胞移植提供無免疫原性的材料。任何涉及喪失正常細胞的疾病都可以通過移植由胚胎干細胞分化而來的特異組織細胞來治療，如用神經(jīng)細胞治療神經(jīng)退變性疾病。5.1.4胚胎干細胞研究面臨的難題及倫理學(xué)爭議7 胚胎干細胞研究仍面臨許多技術(shù)難題，包括：如何維持體外擴增時不分化？分化細胞的增殖是一個瓶頸問題，如何獲得組織工程所需要的種子細胞的數(shù)量，很值得研究。而如何得到純化的分化細胞也有很多工作要做。如何定向誘導(dǎo)干細胞的分化？由胚胎干細胞在體外發(fā)育成一完整的器官尤其是像心、肝、腎、肺等大型精細復(fù)雜的器官，并真正用于器官克隆與移植仍需有技術(shù)上得突破。 除以上所面臨的難題外，有胚胎干細胞研究所引發(fā)的涉及倫理、社會、法律、醫(yī)學(xué)、神學(xué)和道德的爭議和大辯論也不能不引起重視。胚胎干細胞最終能否得以應(yīng)用在很大程度上將取決于倫理學(xué)與法律問題的解決與否。這些問題有一下幾個方面：胚胎干細胞的來源是否合乎法律及道德？將人胚胎干細胞嵌入家畜胚胎中創(chuàng)立嵌合體來獲得移植用人體器官是否道德？目前克隆技術(shù)尚不完善，沒有保障且不安全。任何分化細胞都有形成腫瘤或無控制地生長的特性。胚胎干細胞的安全性如何？5.2干細胞與組織工程9 完美地修復(fù)或替代因疾病、戰(zhàn)傷、意外事故或遺傳因素造成的組織、肢體或器官的傷殘一直是人類的“夢想”。而最新的研究結(jié)果表明，利用組織工程和干細胞等現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，有可能使這一“夢想”成為現(xiàn)實。 目前組織工程、干細胞研究已經(jīng)成為21世紀(jì)生命科學(xué)研究的焦點。組織工程研究涉及種子細胞、支架材料以及組織構(gòu)建等眾多研究領(lǐng)域，干細胞研究則有望解決組織工程研究中的種子細胞來源問題。前者屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域中的一門新興學(xué)科，而后者屬于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究范疇，兩者之間緊密聯(lián)系，但又各有側(cè)重。5.3干細胞與基因治療10 自從基因治療進入臨床試驗后，有關(guān)的基礎(chǔ)研究已取得很大進展，為了使目的基因能在患者體內(nèi)長期或永久地表達，并且表達具有靶向性，必須選擇一種適合的靶細胞。干細胞因為具有自我更新或自我復(fù)制的能力而成為基因治療理想的靶細胞。 總結(jié)：無論是從科學(xué)研究還是臨床應(yīng)用角度都有必要盡快加強國產(chǎn)化胚胎干細胞的建系與定向誘導(dǎo)分化研究。重要的研究領(lǐng)域可歸納為幾點：建立及完善維持胚胎干細胞的體外增殖與定向誘導(dǎo)分化的體系；研究轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)核胚胎干細胞的增殖與分化及其調(diào)控機制；誘導(dǎo)分化細胞性能的分析與鑒定；探索克服移植排斥等的技術(shù)與方法。設(shè)想在不久的將來，干細胞治療疾病的新技術(shù)將被應(yīng)用到臨床，造福于人類。參考文獻：1裴雪濤，等，干細胞生物學(xué)，北京；科學(xué)出版社，2003.7。2楊曉鳳、張素芬、郭子寬，干細胞應(yīng)用新技術(shù)，北京；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2010.7。3王延華、羊惠君，干細胞理論與技術(shù)，北京；科學(xué)出版社，2005.3。4王佃亮，干細胞組織工程技術(shù)，北京；科學(xué)出版社，2