光化學(xué)傳感器理論與實(shí)踐第七章

光化學(xué)傳感器理論與實(shí)踐第七章第一節(jié)識(shí)別原理

生物修飾傳感組成:由內(nèi)傳感器(普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器或化學(xué)修飾光化學(xué)傳感器)和修飾得生物敏感層組成。

識(shí)別原理:在生物修飾傳感器中,修飾得生物敏感層在對(duì)分析對(duì)象進(jìn)行生物識(shí)別得同時(shí),能向普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器或化學(xué)修飾光化學(xué)傳感器提供可檢測(cè)得光學(xué)信號(hào)。

特點(diǎn):與分子或離子化學(xué)識(shí)別相比,生物識(shí)別有更高得選擇性與靈敏度。 具有生物識(shí)別功能得生物物質(zhì)

生物修飾敏感層目前應(yīng)用:生物修飾敏感層主要涉及酶,抗原或抗體。酶微生物抗原或抗體激素抗體結(jié)合蛋白植物凝血素酶相關(guān)知識(shí)酶得定義:就是一類具有催化活性得蛋白質(zhì)分子。活性基團(tuán)種類:組氨酸上得咪唑基、絲氨酸上得羥基、半胱氨酸上得巰基等酶特點(diǎn)(優(yōu)點(diǎn))非常高的催化效率非常高的特異性影響酶活性因素環(huán)境因素:pH值影響(最佳:生理pH7、4),抑制劑(Ag+、Hg2+、As3+等)存在使酶失活活性中心得空間構(gòu)象:獨(dú)特得三維結(jié)構(gòu)決定了酶發(fā)揮其活性得基礎(chǔ)

酶分子上得親核基團(tuán)有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等,這些富含電子得基團(tuán)(有孤對(duì)電子),攻擊底物分子中電子云密度較小得親電子基團(tuán),并供出電子,二者形成共價(jià)鍵,酶和底物形成一個(gè)不穩(wěn)定得中間物,進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。蛋白質(zhì)中三種主要得親核基團(tuán)全酶得結(jié)構(gòu)與分子組成全酶酶蛋白活性中心輔助因子蛋白鏈底物

活性中心以外得必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)

催化基團(tuán)

活性中心

多肽鏈圖7-1酶活性中心示意圖底物敏感鏈類別功能舉例氧化還原酶促進(jìn)電子或氫轉(zhuǎn)移葡萄糖氧化酶轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)氨酶水解酶促進(jìn)水解反應(yīng)蛋白、淀粉酶裂解酶促進(jìn)消去反應(yīng)形成雙鍵碳酸酐酶異構(gòu)酶促進(jìn)同分異構(gòu)體得相互轉(zhuǎn)變磷酸葡萄糖變化酶連接酶促進(jìn)鍵得形成,同時(shí)使ATP分子中得高能磷酸鍵斷裂谷氨酰胺合成酶酶得分類目前主要限于:氧化還原酶,轉(zhuǎn)移酶。原因:常常伴隨有可供光學(xué)檢測(cè)得物質(zhì)得產(chǎn)生或消耗;可直接采用普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器作為內(nèi)傳感器器件;有時(shí)酶所催化得化學(xué)反應(yīng)可能不產(chǎn)生或不消耗可供檢測(cè)得物質(zhì),但往往伴隨有易于被化學(xué)修飾光化學(xué)傳感器檢測(cè)得物質(zhì)(例如H＋、O2、NH3等)得生成與消耗。酶在光化學(xué)傳感器中應(yīng)用大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜酶分化反應(yīng)速率方程(一)

E+SESP+E

(酶)(底物)(中間物)(產(chǎn)物)(酶)K1K-1K1葡萄糖(S)己糖激酶(E)復(fù)合物(ES)誘導(dǎo)契合作用例如:酶分化反應(yīng)速率方程(二)穩(wěn)態(tài)近似法:米氏方程(一):

米氏方程(二):

光學(xué)波導(dǎo)內(nèi)傳感器生物催化層底物產(chǎn)物酶圖7-2酶催化光化學(xué)傳感器識(shí)別原理底物產(chǎn)物樣品檢測(cè)器光極識(shí)別過程傳質(zhì)擴(kuò)散底物(分析對(duì)象)：樣品相生物催化層產(chǎn)物：生物催化層樣品相

穩(wěn)態(tài)響應(yīng)信號(hào):產(chǎn)物生成速度恰好等于產(chǎn)物離開生物層得凈速度。分析對(duì)象濃度測(cè)定根據(jù)校正曲線+穩(wěn)態(tài)響應(yīng)信號(hào)(快響應(yīng))根據(jù)校正曲線+反應(yīng)速率(響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng))免疫反應(yīng)免疫反應(yīng):當(dāng)動(dòng)物體收到外界異性物質(zhì)(抗原)得侵入時(shí),動(dòng)物體內(nèi)得免疫系統(tǒng)細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生一種與這些異性物質(zhì)相對(duì)抗得物質(zhì)(抗體),通過抗體與抗原得結(jié)合使抗原得作用消失。免疫反應(yīng)抗原:具有免疫原性與抗原特異性。按來源可分為天然抗原、人工抗原和合成原。一般為具有較大分子量得生物活性物質(zhì),例如蛋白質(zhì)、多糖、核酸等,有時(shí)為小分子活性物質(zhì)(半抗原),藥物,激素,肽等。免疫反應(yīng)抗體:就是一類稱為免疫球蛋白得蛋白質(zhì)。五種免疫球蛋白包括IgG(主要)、IgA、IgM、IgD、IgE。-COOH端-NH2端圖7-3IgG分子結(jié)構(gòu)示意圖結(jié)合抗原碎片F(xiàn)ab可結(jié)晶碎片F(xiàn)c重鏈(heavychain,H鏈)450～550個(gè)氨基酸殘基,分子量約55～75kD。根據(jù)Ig重鏈抗原性得差異,Ig可分為五類即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE,相應(yīng)H鏈為γ、μ、α、δ及ε鏈。五種免疫球蛋白結(jié)構(gòu)示意圖抗體與抗原得結(jié)合力非極性作用氫鍵力作用庫(kù)侖力作用分子間吸引力立體排斥力通過-NH2-OH作用通過非極性側(cè)鏈作用通過兩側(cè)鏈相反電荷吸引通過范德華力作用通過結(jié)合部電子云互補(bǔ)抗原-抗體結(jié)合力得主要貢獻(xiàn)者抗體識(shí)別抗原分子得基礎(chǔ)免疫光化學(xué)傳感器響應(yīng)免疫光化學(xué)傳感器響應(yīng)特點(diǎn):與熱力學(xué)平衡有關(guān)免疫光化學(xué)傳感器響應(yīng)抗原抗體檢測(cè)無需標(biāo)記:抗原-抗體結(jié)合前后會(huì)引起體系熒光強(qiáng)度或偏振程度得變化而直接被檢測(cè)。需標(biāo)記:無光學(xué)性質(zhì)變化,進(jìn)行熒光標(biāo)記?；蚪档涂乖?抗體結(jié)合力提高光化學(xué)傳感器得可逆性措施1、減少主體溶劑極性降低抗體－抗原之間得疏水相互作用從而降低抗原與抗體結(jié)合力(消極,因?yàn)?結(jié)合力發(fā)、靈敏度下降)2、通過改變測(cè)量溫度降低結(jié)合力得方法(消極)3、通過緩釋技術(shù),或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理可以作成可逆響應(yīng)得光化學(xué)傳感器(積極)第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識(shí)別原理第二節(jié)基于普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器得酶催化傳感器第三節(jié)基于化學(xué)修飾傳感器得酶催化傳感器第四節(jié)基于簡(jiǎn)單免疫體系得光化學(xué)傳感器第五節(jié)基于競(jìng)爭(zhēng)免疫體系得光化學(xué)傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第二節(jié)基于普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器

得酶催化傳感器概念:當(dāng)酶催化反應(yīng)直接產(chǎn)生或消耗可供光學(xué)檢測(cè)得物質(zhì)時(shí),可將相應(yīng)得酶固定于普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器得探頭上,構(gòu)成酶催化傳感器。第二節(jié)基于普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器

得酶催化傳感器類型(根據(jù)檢測(cè)信號(hào)分)紫外吸收熒光(NADH體系)化學(xué)發(fā)光(Luminol)探測(cè)光纖信號(hào)光纖尼龍網(wǎng)堿性磷酸脂酶+404nm樣品+酶鎢燈例:基于堿性磷酸酯酶得普通光化學(xué)傳感器基于紫外吸收信號(hào)檢測(cè)得酶催化傳感器對(duì)-硝基苯基磷酸鹽對(duì)-硝基酚濾光片404.7nmPMT公共端Anal、Chem、1985,57,565基于熒光信號(hào)檢測(cè)得酶催化傳感器基本上就是與輔酶I(煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸,NAD)參加得反應(yīng)聯(lián)系在一起NAD結(jié)構(gòu)式關(guān)于輔酶I分子生物學(xué)意義:就是參與生命體中能量代謝過程得重要物質(zhì),在反應(yīng)中主要起遞氫作用。輔酶I類型還原型(NADH):熒光較強(qiáng)lEx=360nm,

lEM=460nm氧化型(NAD):無熒光分析對(duì)象固定化酶催化反應(yīng)文獻(xiàn)乳酸、丙酮酸鹵酸脫氫酶乳酸+NAD

丙酮+NADH﹝7,8﹞葡萄糖葡萄糖脫氫酶葡萄糖+NAD

葡萄糖酸內(nèi)酯+NADH﹝9﹞膽酸羥基類固醇脫氫酶3-羥基膽酸+NAD

膽酸酮+DADH﹝10﹞乙醇醇脫氫酶乙醇+NAD

乙醛+NADH﹝7,11﹞蘋果酸、草酸鹽蘋果酸脫氫酶蘋果酸+NAD

草酸鹽+NADH﹝12﹞甘油-3-磷酸葡糖-6-磷酸-脫氫酶甘油-3-磷酸+NAD6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯+NADH﹝12﹞3-羥基-丁酸3-羥基-丁酸脫氫酶3-羥基-丁酸+NAD

乙酰乙酸+NADH﹝12﹞輔酶I醇脫氫酶乙醇+NAD

乙醛+NADH﹝12﹞睪酮雄(甾)酮羥基類固醇脫氫酶睪酮雄(甾)酮+NAD

類固醇+NADH﹝12﹞表7-3檢測(cè)NADH熒光得脫氫酶催化傳感器與NADH生成反應(yīng)耦合NADHNAD++心肌黃酶與NADH反應(yīng)產(chǎn)生更強(qiáng)熒光產(chǎn)物刃天青(無熒光)9-羥基異吩噁唑(強(qiáng)熒光)靈敏度提高2倍2、與NADH反應(yīng)產(chǎn)生紫外可見吸收NADHNAD++噻唑藍(lán)紫色甲臜強(qiáng)吸收lmax=558nm

心肌黃酶硫胺素+H2O2HRP基于其她熒光體系得酶催化傳感器基于辣根過氧化酶(HRP)催化硫胺素得H2O2熒光傳感器:HRP結(jié)構(gòu)示意圖意義:就是繼酶催化NADH熒光傳感器之后另一種非常有意義得酶催化熒光傳感器檢測(cè)H2O2本身;可檢測(cè)在酶催化反應(yīng)中生成H2O2得生物活性物質(zhì)(底物)硫胺熒(強(qiáng)熒光)+二硫化硫胺素(無熒光)基于化學(xué)或生物發(fā)光信號(hào)檢測(cè)得酶催化傳感器該傳感器得顯著特點(diǎn):體系只需要通過光學(xué)波導(dǎo)器件收集信號(hào)光,可直接將生物催化層修飾在光電檢測(cè)器上。基于化學(xué)或生物發(fā)光得酶催化反應(yīng)體系魯米諾(Luminol)+H2O2化學(xué)發(fā)光體系(最經(jīng)典)ATP-熒光素-O2-熒光素酶生物發(fā)光體系NADH-黃素單核苷酸(FMN)-氧化還原酶-O2-熒光素酶生物分化發(fā)光體系魯米諾(Luminol)+H2O2化學(xué)發(fā)光體系許多氧化酶催化得反應(yīng)伴隨有H2O2產(chǎn)生,將氧化酶與過氧化酶固定在一起可建立靈敏得化學(xué)發(fā)光酶催化傳感器,用于檢測(cè)底物,如:尿酸、氨基酸、乳酸、葡萄糖、膽固醇、胺類、丙酮酸等。ATP-熒光素-O2-熒光素酶生物發(fā)光體系A(chǔ)TP+熒光素+O2AMP+氧化熒光素+PPi+CO2熒光素酶hn(lmax=560nm)應(yīng)用:檢測(cè)ATP,DL=10-10molL-1其她有ATP參與得代謝過程所涉及得反應(yīng)物由Blum等人提出(Anal、Chim、Acta,1989,227,387)NADH-黃素單核苷酸(FMN)-氧化還原酶-O2-熒光素酶生物催化發(fā)光體系NADH+H++FMNNAD+FMNH2氧化還原酶FMNH2+RCHO+O2FMN+RCOOH+H2O熒光素酶hn(lmax=490nm)應(yīng)用測(cè)定輔酶I(NADH):C、Haggertyet、al、,Anal、Biochem、,88,162(1978)檢測(cè)其她底物:與相應(yīng)底物脫氫酶耦合后,參與遞氫作用得輔酶I起指示物質(zhì)得作用L、J、Blumet、al、,Anal、Lett、,21,717(1988)第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識(shí)別原理第二節(jié)基于普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器得酶催化傳感器第三節(jié)基于化學(xué)修飾傳感器得酶催化傳感器第四節(jié)基于簡(jiǎn)單免疫體系得光化學(xué)傳感器第五節(jié)基于競(jìng)爭(zhēng)免疫體系得光化學(xué)傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第三節(jié)基于化學(xué)修飾傳感器得酶催化傳感器技術(shù)產(chǎn)生背景

有些酶催化得反應(yīng)不產(chǎn)生或不消耗可直接光學(xué)檢測(cè)得物質(zhì),但涉及質(zhì)子得產(chǎn)生與消耗、氧氣得產(chǎn)生與消耗、酸性或堿性氣體(CO2或NH3)產(chǎn)生與消耗。這些物質(zhì)很容易被化學(xué)修飾光化學(xué)傳感器所檢測(cè),故可采用相應(yīng)化學(xué)修飾光化學(xué)傳感器作內(nèi)傳感器構(gòu)建酶催化傳感器。常用得內(nèi)傳感器種類氧光化學(xué)傳感器為內(nèi)傳感器;CO2光化學(xué)傳感器為內(nèi)傳感器;NH3光化學(xué)傳感器為內(nèi)傳感器。氧光化學(xué)傳感器為基礎(chǔ)光極得酶催化傳感器傳感器得結(jié)構(gòu)與原理:以測(cè)量葡萄糖為例葡萄糖樣品光學(xué)波導(dǎo)O2敏感熒光試劑葡萄糖葡萄糖酸氧化酶葡萄糖酸O2O2O2氣透膜生物催化層探測(cè)光激發(fā)信號(hào)光發(fā)射尼龍網(wǎng)+圖7-5氧光化學(xué)傳感器為基礎(chǔ)光極得葡萄糖生物傳感器內(nèi)傳感器氧光學(xué)傳感器傳感器得特性樣品中葡萄得濃度越大,傳感器得熒光強(qiáng)度信號(hào)越大;檢測(cè)范圍0、1~20mmol/L;響應(yīng)時(shí)間幾分鐘之內(nèi)。氨氣酶光極傳感器為基礎(chǔ)傳感器得酶催化傳感器傳感器得結(jié)構(gòu)與原理:以測(cè)量尿素為例NH2CONH2(尿素)+H2O2NH3+CO2脲酶底物樣品光學(xué)波導(dǎo)底物NH3脫氨酶NH3氣透膜生物催化層探測(cè)光信號(hào)光圖7-6以氨氣酶光極為基礎(chǔ)傳感器得酶催化傳感器內(nèi)傳感器氨氣敏光極NH3酶支持膜HINDH+IND-+NH4+H++化學(xué)修飾層厚度(m)傳感器得特性尿素得濃度越大,產(chǎn)生得NH3氣越多,使內(nèi)感器得吸收或熒光信號(hào)變化越明顯;檢測(cè)范圍5×10-5~1×10-2mol/L,DL=5×10-5mol/L;響應(yīng)時(shí)間約7分鐘。第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識(shí)別原理第二節(jié)基于普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器得酶催化傳感器第三節(jié)基于化學(xué)修飾傳感器得酶催化傳感器第四節(jié)基于簡(jiǎn)單免疫體系得光化學(xué)傳感器第五節(jié)基于競(jìng)爭(zhēng)免疫體系得光化學(xué)傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第四節(jié)基于簡(jiǎn)單免疫體系得光化學(xué)傳感器1、體系:一一對(duì)應(yīng)得免疫體系;適用范圍2、抗原抗體要有熒光活性:有內(nèi)源熒光得抗體(或抗原):許多抗體或抗原得多肽鏈含有熒光活性得氨基酸殘基礎(chǔ),如:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。熒光標(biāo)記后得抗體(或抗原)對(duì)標(biāo)記物得要求:

(1)穩(wěn)定;(2)熒光發(fā)射光譜與背景熒光有明顯差別;(3)高熒光量子產(chǎn)率;(4)大得Stokes位移;(5)有合適得與抗原或抗體連接得法;(6)不影響抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)。

主要基于抗原-抗體作用前后熒光強(qiáng)度得變化:非輻射熒光能量轉(zhuǎn)移:熒光熄滅

例:半抗原2,4-二硝基苯(DNP)DNP-賴氨酸+抗體→DNP-賴氨酸/抗體(有熒光活性)(無熒光活性)簡(jiǎn)單免疫熒光分析原理輻射熒光能量轉(zhuǎn)移:熒光增強(qiáng)例:二甲氨基萘-5-磺酰(DANS)DANS-賴氨酸+抗體→DANS-賴氨酸/抗體(有熒光活性)(強(qiáng)熒光活性)熒光強(qiáng)度增加25-30倍抗原抗體結(jié)合前后微環(huán)境變化引起熒光增強(qiáng)度變化構(gòu)建基于簡(jiǎn)單免疫體系得光化學(xué)傳感器1、采用熒光標(biāo)記物得簡(jiǎn)單免疫體系構(gòu)造光化學(xué)傳感F、V、Brightetal、,Anal、Chem、,62,1065(1990)光纖端部HSA:人血清白蛋白Fab:抗人血清白蛋白抗體碎片熒光試劑:丹酰氯Fab

與HSA結(jié)合后使熒光標(biāo)記物得微環(huán)境改變,熒光增強(qiáng)KSCN溶液能將Fab與HSA分開,從而使傳感器再生。2、酶聯(lián)免疫光化學(xué)傳感T、Vo-Dinhetal、,Appl、Spectrosc、,40,696(1986)非熒光物質(zhì):與磷酸根相結(jié)合得4-甲基傘形酮與抗體結(jié)合得酶:堿性磷酸酯酶酶催化分解產(chǎn)物:4-甲基傘形酮酶,強(qiáng)熒光活性EEEEEEEE激發(fā)發(fā)射酶催化反應(yīng)固定在池壁上的待測(cè)抗原非熒光酶底物E酶聯(lián)抗體酶催化產(chǎn)生的熒光活性物質(zhì)激發(fā)態(tài)的熒光活性物質(zhì)圖7-9酶聯(lián)免疫熒光傳感器原理示意圖定量分析得依據(jù):樣品中抗原濃度越大,結(jié)合酶聯(lián)抗體就越多,催化水解產(chǎn)生得游離4-甲基傘形酮越多,強(qiáng)熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。第七章生物修飾傳感器第一節(jié)識(shí)別原理第二節(jié)基于普通光學(xué)波導(dǎo)傳感器得酶催化傳感器第三節(jié)基于化學(xué)修飾傳感器得酶催化傳感器第四節(jié)基于簡(jiǎn)單免疫體系得光化學(xué)傳感器第五節(jié)基于競(jìng)爭(zhēng)免疫體系得光化學(xué)傳感器第六節(jié)核酸生物修飾傳感器第五節(jié)基于競(jìng)爭(zhēng)免疫體系得光化學(xué)傳感器原理:Optode-Ag+Ab*+AbOptode-Ag-Ab*+Optode-Ag-AbOptode-Ab+Ag*+AgOptode-Ab-Ag*+Optode-Ab-Ag或樣品中待測(cè)Ag(或Ab)越多,結(jié)合到光極探頭上得標(biāo)記物抗原Ag*(或標(biāo)記抗體Ab*)越少,傳感器得熒光強(qiáng)度越低。有可逆響應(yīng)得葡萄糖免疫光化學(xué)傳感器J、S、Schultzetal、,DiabetesCare,5,245(1982)第一個(gè)真正有可逆響應(yīng)得免疫光化學(xué)傳感器。所有基于熒光標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)得免疫體系均可以按此設(shè)計(jì)思想制成有可逆響應(yīng)得光化學(xué)傳感器。激發(fā)發(fā)射葡萄糖