人教版選修一 DNA的粗提取與鑒定 課件（29張）.ppt

專題5dna和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題1dna的粗提取與鑒定 課題目標(biāo) 1 嘗試對植物或動物組織中的dna進(jìn)行粗提取 2 了解dna的物理化學(xué)性質(zhì)3 理解dna精提取以及dna鑒定的原理 課題重點(diǎn)與難點(diǎn) 課題重點(diǎn) dna的粗提取與鑒定方法課題難點(diǎn) dna的粗提取與鑒定方法 想一想 dna主要存在于細(xì)胞核中 如何選取具核的生物組織作為實(shí)驗(yàn)材料 取雞血細(xì)胞液 其紅細(xì)胞橢圓具核 豬 羊 狗等哺乳動物紅細(xì)胞無核 或取新鮮豬肝 菜花 洋蔥等材料 雖然在細(xì)菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中提取的是無核細(xì)胞中的dna 但一般而言 均是從具核的生物材料中提取dna 當(dāng)然 在提取出的dna中也含有一定量的胞質(zhì)dna 即線粒體dna和葉綠體dna 值得推介的材料是洋蔥 取材容易 操作簡便 效果明顯 將家用加鹽洗潔精與洋蔥碎屑混合研磨并過濾后 再加酒精 微搖后即出現(xiàn)白色的毛絮狀dna混合物 如何除去核外的核膜和質(zhì)膜 對于植物細(xì)胞又如何破壁 使紅細(xì)胞溶血破膜以及化學(xué)藥劑十二烷基磺酸鈉sds 洗潔精的主要成分 或三氯乙酸溶膜 在低滲溶液中 如加蒸餾水使血細(xì)胞過度滲透吸水直至破裂 同時用玻棒加速血細(xì)胞及核破裂 經(jīng)一級過濾后濾出液為dna核蛋白和rna核蛋白 對于菜花 洋蔥等植物材料 在研磨破壞其細(xì)胞壁的同時 可考慮適量加入乙二胺四乙酸edta以防止dna酶解 細(xì)胞核中除dna外 還有rna 且dna以核蛋白體dnp的形式存在 那么 如何使dna和rna分開 又如何使dna和蛋白質(zhì)分開 利用dna和rna溶解度的不同析出dna 在濃氯化鈉溶液 2mol l 中 dna核蛋白的溶解度很大 而rna核蛋白的溶解度很小 在稀氯化鈉溶液 0 14mol l 中dna的溶解度最低 蛋白質(zhì)的溶解度很高而出現(xiàn)鹽溶現(xiàn)象 經(jīng)二級過濾后濾出液主要為dna粗制品 如何去除雜質(zhì)物質(zhì)使dna更加純化 dna不溶于酒精 經(jīng)三級過濾后 再利用乙醇沉淀法使其他物質(zhì)溶于酒精而進(jìn)一步純化dna 如何驗(yàn)證提取物主要是dna成分 二苯胺或甲基綠鑒定法即dna遇二苯胺 沸水浴 被染成藍(lán)色 遇甲基綠被染成藍(lán)綠色 且顏色的深淺與dna純化程度有關(guān) 在此過程中設(shè)計對照實(shí)驗(yàn) 以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)中二苯胺對dna專一性顯色結(jié)果的可信度 以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行dna的粗提取 本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個原因 一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的dna含量豐富 材料易得 二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破 而用動物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要勻漿和離心 對設(shè)備要求較高 操作繁瑣 歷時較長 課前準(zhǔn)備 教師可以到市場售活雞處索取雞血 所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑檸檬酸鈉溶液 具體制備方法如下 取質(zhì)量濃度為0 1g ml的檸檬酸鈉溶液100ml 置于500ml燒杯中 注入新鮮的雞血 約180ml 同時用玻璃棒攪拌 使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合 以免血液凝結(jié) 將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi) 靜置1d 使血細(xì)胞自行沉淀 有條件的學(xué)校也可以將血液倒入離心管內(nèi)進(jìn)行離心 用2000r min或3000r min的轉(zhuǎn)速 離心2min 使血細(xì)胞沉淀于離心管底部 這樣可以使血細(xì)胞沉淀更完全 用吸管除去上部的澄清液 就可以得到雞血細(xì)胞液 值得注意的是雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的dna 容易被玻璃容器吸附 所以在提取過程中為了減少dna的損失 最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液 提取dna的具體步驟 雞血細(xì)胞中的dna與核蛋白結(jié)合 位于雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中 正常情況下是不會釋放出來的 為了dna從細(xì)胞核中釋放出來 需要向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水 并且攪拌 從而使血細(xì)胞膜和核膜脹破 用玻璃棒攪拌可以加速細(xì)胞的破裂 注意應(yīng)沿一個方向快速攪拌 但也不能太快太猛 防止打碎dna 一般5 10ml的雞血細(xì)胞液加入20ml蒸餾水?dāng)嚢?min 釋放出來的大量dna和rna往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起 應(yīng)用3 4層紗布進(jìn)行過濾 除去一些顆粒較大的雜質(zhì) 1 破碎細(xì)胞 釋放dna 2 溶解細(xì)胞核內(nèi)的dna 在濃度較高的nacl溶液中核蛋白容易解聚 游離出的dna溶解在溶液中 在溶液中加入兩倍體積的濃度為2mol l的nacl溶液 攪拌1min 注意應(yīng)沿一個方向攪拌 使dna充分溶解 3 dna的析出 實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵 將溶液中的dna與其他雜質(zhì)分離 這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵 教材中列舉了提取dna的三種方案 本案例選取方案一 加蒸餾水降低nacl溶液濃度 使dna析出 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水 并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌 以利于dna分子的附著和纏繞 同時應(yīng)注意控制加水量 使nacl溶液的終濃度為0 1 0 2mol l 加水過程一般分三次進(jìn)行 當(dāng)總加水量為300ml左右時 dna已基本析出 加水太多 溶液過稀 會使dna分子又重新溶解 用多層紗布對dna稀釋液進(jìn)行過濾 濾去蛋白質(zhì) 收集dna的黏稠物 如果采用離心法 效果更好 用4000r min轉(zhuǎn)速的離心機(jī) 離心15min 除去上清液 含有蛋白質(zhì) 留下的沉淀物中含有dna 此時注意觀察dna黏稠物的顏色 4 dna的初步純化 如果提取的dna量不夠多且其中含有較多雜質(zhì) 或者加入溶液和攪拌等操作過程不規(guī)范 都會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯 常常使制取的dna粗制品不能顯示出dna的本色 白色 為了增進(jìn)實(shí)驗(yàn)效果 需要對dna粗制品進(jìn)行簡單的提純 下面的方案可供參考 將dna黏稠物再溶解 繼續(xù)用2mol l的nacl溶液20ml溶解dna黏稠物 仍舊沿一個方向不停攪拌3min 使dna充分溶解 以免損失 用2層紗布進(jìn)行過濾 或離心 濾去雜質(zhì) 收集含有dna的濾液 向?yàn)V液中貼壁緩慢加入50ml預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95 的乙醇 并用玻璃棒朝一個方向緩慢 均勻地攪拌 溶液中會出現(xiàn)dna絲狀物 實(shí)驗(yàn)一般要求采用預(yù)冷的95 的乙醇 但對比結(jié)果顯示 常溫下的乙醇溶液也可產(chǎn)生明顯效果 從理論上分析 預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn) 一是抑制核酸水解酶活性 防止dna降解 二是降低分子運(yùn)動 易于形成沉淀析出 三是低溫有利于增加dna分子柔韌性 減少斷裂 此時懸浮于溶液中的dna絲狀物相對含雜質(zhì)較少 如果出現(xiàn)的絲狀物較少 可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘 濃縮后的dna絲狀物 可以用緩緩旋轉(zhuǎn)玻璃棒的方法卷起 因?yàn)椴ＡО粲形絛na的作用 如果dna絲狀物較少 不易吸附在玻璃棒上 也可以用筷子等表面粗糙的用具來幫助dna分子纏繞 dna的純化還有許多其他方法 例如 添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 的十二烷基磺酸鈉 sds 溶液 使蛋白質(zhì)變性后與dna分開 隨后 加入氯仿 異丙醇混合液 體積比為24 1 通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去 取上清液 可重復(fù)上述操作幾次 直至上清液變成透明的黏稠液體 此外苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性 抑制核酸酶的活性 利用苯酚處理后 離心分層 dna溶于上層水相 蛋白質(zhì)變性存在于酚層中 這時可用分液漏斗或吸管等儀器將二者分開 教師可以根據(jù)學(xué)校的條件讓學(xué)生自己設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案 比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5 dna的鑒定 二苯胺法二苯胺試劑的配制及鑒定dna的方法參見教科書 需要注意的是 二苯胺試劑在冰箱內(nèi)可保存6個月 使用前需搖勻 4評價總結(jié)及批判性研究 1個目的 在體驗(yàn)科學(xué)思維的過程中提取和鑒定dna 2次用蒸餾水 蒸餾水破膜提取核物質(zhì)和蒸餾水稀釋析出dna 3次過濾 過濾核外物質(zhì) 過濾dna核蛋白 過濾dna 4個關(guān)鍵詞 dna提取 設(shè)計思路 科學(xué)思維和研究性學(xué)習(xí) 通過研究性學(xué)習(xí) 學(xué)生在發(fā)現(xiàn)問題 分析問題 處理問題的過程中 能不斷領(lǐng)悟科學(xué)思想和掌握科學(xué)方法 并以極大的探究樂趣主動地去探索生命的奧秘 5次攪拌 第1步同方向加力攪拌 第3 5步同方向輕緩攪拌 第7步同方向緩慢攪拌 第8步可不同方向攪拌 6種溶液 主要有檸檬酸鈉液 酒精液 二苯胺液 甲基綠液 0 015mol l和2mol l氯化鈉液 7種探究模式 本實(shí)驗(yàn)可嘗試性拓展為探究性實(shí)驗(yàn) 改型后主要參考課題有 a 探究使用雞的不同組織材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時的實(shí)驗(yàn)效果 b 探究蒸餾水量引起的雞血細(xì)胞在不同低滲狀態(tài)下的破裂程度 c 探究dna在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉溶液中的溶解度并繪出曲線圖 d 探究dna鑒定過程中不同水浴溫度對顯色的影響 e 探究沉淀dna時不同溫度的酒精對沉淀量的影響 f 探究過濾過程中紗布層數(shù)對最終提取物量的影響 g 探究使用玻璃燒杯 試管與使用塑料制品對dna提取量的影響 8個步驟 提取 過濾 溶解 過濾 再溶解 再過濾 提純 鑒定 旁欄思考題 答 蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體 水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi) 使血細(xì)胞脹裂 再加上攪拌的機(jī)械作用 就加速了雞血細(xì)胞的破裂 細(xì)胞膜和核膜的破裂 從而釋放出dna 1 為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂 2 加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么 答 洗滌劑是一些離子去污劑 能溶解細(xì)胞膜 有利于dna的釋放 食鹽的主要成分是nacl 有利于dna的溶解 3 如果研磨不充分 會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響 答 研磨不充分會使細(xì)胞核內(nèi)的dna釋放不完全 提取的dna量變少 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物 用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等 4 此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分 答 可能含有核蛋白 多糖和rna等雜質(zhì) 5 為什么反復(fù)地溶解與析出dna 能夠去除雜質(zhì) 答 用高鹽濃度的溶液溶解dna 能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì) 用低鹽濃度使dna析出 能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì) 因此 通過反復(fù)溶解與析出dna 就能夠除去與dna溶解度不同的多種雜質(zhì) 6 方案二與方案三的原理有什么不同 答 方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白 從而使提取的dna與蛋白質(zhì)分開 方案三利用的是dna和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同 從而使蛋白質(zhì)變性 與dna分離 二 練習(xí) 1 答 提取dna的第一步是材料的選取 其目的是一定要選取dna含量較高的生物材料 否則會由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測的困難 第二步是dna的釋放和溶解 這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵 要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的dna全部